抗冻蛋白结构基因片段的克隆

为了研究和开发利用抗冻蛋白或多肽,木文通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）合成了抗冻蛋白１１０ｂｐ的结构基因片段,然后将该基因片段克隆到大肠杆菌质粒载体Ｐ（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）Ⅱｋｓ＋／－上,获得了重组质粒,经酶切证明,获得的重组质粒中含有抗冻蛋白结构基因片段,以供该基因在大肠杆菌或酵母中表达抗冻蛋白。     

鱼类抗冻蛋白的研究进展

抗冻蛋白 (AFP)可非依数性地降低溶液冰点 ,对冷冻细胞和胚胎具有高效的保护作用。目前的研究表明 ,不同的鱼类抗冻蛋白尽管都具有降低冰点的活性 ,但在结构和组成上又存在有较大的差异。根据其结构和化学组成 ,一般将它们分为 4大类 :AFP I、AFP II、AFP III和AFP IV。抗冻蛋白的编码基因为基因组中多拷贝基因家族的成员 ,其基因表达在很大程度上要受到季节变化的影响。目前 ,普遍使用吸附抑制假说来解释AFP非依数性降低溶液冰点的分子机制 ,但不同类抗冻蛋白在降低溶液冰点时的作用模式却不尽相同。现就鱼类的 4类抗冻蛋白的结构组成、基因性质、抗冻机制及其在细胞和胚胎冻存中的作用等领域的研究进展进行概括性综述     

Tenebrio molitor抗冻蛋白基因家族cDNA片段的克隆、序列分析及原核表达

利用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)的方法, 克隆黄粉甲虫(Tenebrio molitor)抗冻蛋白基因cDNA片段并进行序列分析和原核表达。同源性分析表明, 获得9条新cDNA片段, 与黄粉甲虫抗冻蛋白基因家族的其他基因序列具有较高的同源性。重组质粒pGEX-4T-1-tmafp-XJ430, 转化E.coli BL21进行原核表达, SDS-PAGE分析结果表明, 抗冻蛋白基因以可溶性融合蛋白表达, 相对分子量为38 kDa。构建真核表达载体pCDNA3-tmafp-XJ430, 免疫小鼠, 获得的抗血清滴度为1:2 000。Western blotting 结果为单一的条带, 证明该抗血清具有针对抗冻蛋白TmAFP-XJ430抗原的专一性。     

淡水瓦氏雅罗鱼基因文库的构建和抗冻蛋白基因同源序列的筛选

极地海域中的鱼类非常耐寒。它们的血液里常含有两种能降低其体内冰点的蛋白质：抗冻糖蛋白（AFGP）和不含糖的抗冻蛋白或抗冻多肽（AFP）。这些蛋白的编码基因已经被克隆,并将黄盖鲽AFP导人虹鳟鱼和大西洋鲑鱼,而改变了它们的抗冻基因进行了分离研究。所用实验材料鱼为中国内蒙古北部生活的瓦氏雅罗鱼（Leuciscus waleckii),属鲤形目（Lypciniformes),鲤科（Lyprinidae),雅罗鱼亚科（Leucisinae),基本按标准方法构建瓦氏雅罗鱼的基因库。只在包装反应至30分钟时,再加一份BHB2690制备物,并延长30分钟反应时间。所得库的成斑率大于1×10^5pfu。已知AFP基因常常多至40个拷贝,故已够用。采用通用的原位分子杂交和Southern分析进行瓦氏雅罗鱼AFP基因同源序列的分离及其亚克隆分析。以北美黄盖鲽AFP基因片段为探针,从瓦氏雅罗鱼DNA库中筛选了三个阳性克隆。图一所示为其中一个的双份膜及其复筛结果。图二为这个阳性克隆DNSA经过三种限制酶切后,同时与北美黄盖鲽AFP基因片段和该基因0．4KbcDNA两种探针的southern分析结果。其中Sac酶切在两个杂交中的均能产生一条2．7Kb的杂交带。图三对两个阳性克隆的southern分析证明：对这个杂交片段的亚克隆是成功的。这是首次在中国一种耐寒淡水鱼基因组内发现并得到AFP基因同源序列,将用于转基因鱼的研究。     

豇豆胰蛋白酶抑制剂cDNA在大肠杆菌中的克隆与表达

从即将成熟的豇豆予叶中分离出总RNA,逆转录合成cDNA第一条链。参照已知的几种Bowman—Birk型胰蛋白酶抑制剂基因序列,设计并合成了两段寡核苷酸引物,以单链cDNA为模板,进行PCR扩增,得到320bp的均一扩增产物,克隆到pBluescrip sK(+)的EcoRV位点上并转化大肠杆菌JM101。酶切图谱及DNA序列分析表明克隆到的片段含有编码完整80个aa的豇豆胰蛋白酶抑制剂结构基因和一段编码27aa的前导序列。利用限制酶NcoI对其前导序列进行缺失,只保留成熟蛋白结构基因上游第一个ATG密码子并克隆到大肠杆菌表达载体pKK233—2中进行表达研究,从转化细菌的提取物中检测到了外源CpTJ基因表达产物对胰蛋白酶的抑制活力。     

两种色型黄粉虫抗冻蛋白cDNA克隆、序列分析与表达分析

产生抗冻蛋白(antifreeze proteins, AFPs)是大多数昆虫抵抗低温的一个重要策略。为给黄粉虫Tenebrio molitotr耐寒机理研究提供参考, 本研究采用RT-PCR、 5′ RACE和3′ RACE法克隆了黄、 黑两种色型黄粉虫幼虫的抗冻蛋白基因Tm-afp, 分析了其基因序列及所编码的氨基酸序列, 并检测了其在这两种色型间的mRNA水平差异。结果表明： 从黄、 黑两种色型黄粉虫幼虫克隆出的Tm-afp cDNA全长分别为579 bp和588 bp, 它们包含一个20 bp的5′端非翻译区、 一个402 bp的开放阅读框和一个变异较大的3′ 端非翻译区, 其碱基序列一致性为95%。由于这两个抗冻蛋白基因编码的蛋白成熟肽存在两个氨基酸差异： 第35位（D→E）和130位（T→S）, 因此将其判定为黄粉虫抗冻蛋白基因Tm-afp的两个异构体, 并分别命名为Tm-afp-1和Tm-afp-2。Tm-afp-1和Tm-afp-2编码的抗冻蛋白异构体（分别为Tm-afp-1和Tm-afp-2 ）信号肽之间有3个氨基酸差异： 第2位（G→A）、 9位（S→T）和27位（Y→N）; 其成熟肽的第一个氨基酸为谷氨酰胺, 含8个高度保守的12 aa短串联重复序列, 每个重复序列的第2位和第8位为半胱氨酸。此外, Tm-afp-1和Tm-afp-2均属富含苏氨酸和半胱氨酸的昆虫抗冻蛋白, 其二级结构均由大量的β-折叠和无规则卷曲组成, 三级结构为8个特殊的右手β-螺旋, 每一圈螺旋由12个氨基酸组成; 在β-螺旋的一个侧面规则排列着由保守XCT形成的β折叠片层。同时, 低温可以诱导黄、 黑两种色型黄粉虫Tm-afp的表达, 但长时间低温诱导下黑色型黄粉虫幼虫的Tm-afp表达量显著高于黄色型黄粉虫幼虫Tm-afp表达量。结果提示, 黄粉虫种内不同色型间, 抗冻蛋白基因Tm-afp可能存在多种异构体, 并且黑色型黄粉虫Tm-afp比黄色型黄粉虫Tm-afp对低温的应答更强烈。这一研究结果为进一步探索黄粉虫的耐寒性机理提供了有益参考。     

尘螨变应原Der fl全序列的原核表达及生物信息学分析

目的 构建尘螨变应原Der fl原核表达体系,并了解其分子特征。方法 提取粉尘螨总RNA,用RT—PCR合成Der fl编码基因,将其克隆至pMD19-T载体,亚克隆至表达载体pET-28a（＋）,转化至大肠杆菌并刚IPTG诱导表达。用生物信息学软件对测序结果进行分析并预测其空间结构。结果从粉尘螨总RNA中扩增获得Der fl cDNA片段,成功构建了表达质粒pET-28a（＋）-Der fl,Western blotting显示原核表达获得成功。测序结果提交GenBank,臀陆号为EU095368,该基因长966bp,与参考序列同源性达99．9％,推测其编码氩基酸321个,属疏水蛋白,位于细胞外,信号肽位于1～18氨基酸处。同源性分析提示Der fl和Eur ml相似率为88％,而Der fl和Derpl的相似率为77％,分子进化树中粉尘螨和梅氏嗜霉螨聚成一簇。Derfl的二级结构由α-螺旋（109aa,33．96％）、延伸链（55aa,17．13％）、β-转角（18aa,5．61％）和随机卷曲（139aa,43．30％）组成：结论 尘螨变麻原Der fl原核表达获得成功,为进一步生产重组变麻原奠定了基础。生物信息学分析表明粉尘螨和梅氏嗜霉螨的亲缘关系可能更近,而与屋尘螨关系稍远,此与现行的形态学分类系统并不符合。     

新疆准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因的克隆和抗冻活性分析

根据GenBank中已发表的昆虫抗冻蛋白基因的保守序列设计引物,利用RT-PCR技术结合3'-RACE扩增的方法,从新疆荒漠昆虫准噶尔小胸鳖甲 Microdera punctipenis dzunarica中获得了长约294 bp不含信号肽的抗冻蛋白cDNA片段,命名为MpAFP5,其全长序列为363 bp(GenBank注册号为：AY821792)。基因测序结果表明, MpAFP5-cDNA片段与加拿大拟步甲Dendroides canadensis AFP 8基因片段、黄粉甲Tenebrio molitor THP 4-9基因片段的核苷酸同源性分别达68.4%和71.8%,氨基酸序列同源性分别达70%和81%。将MpAFP5构建到原核表达载体pGEX4T-1中,重组质粒pGEX4T-1-MpAFP5在大肠杆菌BL21(DE3)中能够表达融合抗冻蛋白,SDS-PAGE分析显示融合蛋白的分子量约为37 kD,Western印迹分析证明MpAFP5在大肠杆菌中正确表达。细菌的抗冻实验结果显示准噶尔小胸鳖甲融合抗冻蛋白对细菌具有显著的抗冻保护作用,保护效果与抗冻蛋白剂量呈正相关性。     

从小鼠11.5d胚胎cDNA文库中筛选Dishevelled2相互作用蛋白

Dishevelled (Dvl)是个多功能、进化上非常保守的蛋白,在Wnt信号传导通路中起着重要的作用。为了研究Dishevelled介导Wnt信号传递的分子机制,利用GAL4酵母双杂交系统筛选了小鼠11．5d胚胎cDNA库,发现了15个可与小鼠Dvl2 DEP结构域和羧基端相互作用的蛋白质。将阳性库质粒测序并对测序结果做BLAST分析,发现其中一个阳性克隆是编码Gli3蛋白氨基端(6—122aa)的cDNA片段,从而暗示Gli3蛋白可能与Dishevelled一起作用并参与某些生物学过程。     

甲虫抗冻蛋白热滞活性的二维吸附结合模型

甲虫抗冻蛋白是一种具有规则结构的昆虫抗冻蛋白。在相同浓度条件下,甲虫抗冻蛋白比鱼类抗冻蛋白有更高的热滞活性,目前已成为人们重点研究的一类抗冻蛋白。根据甲虫抗冻蛋白的结构特点及其在冰晶表面的吸附模式,应用二维吸附结合模型计算分析了具有6￣11个β-螺旋(β-helix)结构片段的甲虫抗冻蛋白变体分子,得到了它们的热滞活性随溶液浓度变化的规律,特别是热滞活性与甲虫抗冻蛋白的β-螺旋结构片段数的关系。结果显示,抗冻蛋白在冰晶表面的覆盖度是一个影响其热滞活性的重要因素。     

增加规则重复序列对光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP914热滞活性的影响

旨在探究光滑鳖甲抗冻蛋白Ap AFP914结构与热滞活性(Thermal hysteresis activity,THA)的关系。采用基因合成的方法,在光滑鳖甲抗冻蛋白基因Ap AFP914中增加单个规则重复序列并进行蛋白原核表达及热滞活性测定。结果显示,增加单个重复序列的Ap AFP-C914为312 bp,融合蛋白Trx A-Ap AFP-C914经SDS-PAGE及Western bolt分析表明,分子量为34 k D。差示扫描量热法(Differential scanning calorimetry,DSC)测定表明,在50μg/m L的浓度下,增加单个重复序列显著提高了Ap AFP的THA活性。光滑鳖甲抗冻蛋白Ap AFP914增加一个重复序列可显著提高其热滞活性。     

草鱼cyclin G1基因的克隆、鉴定及适应性进化分析

本研究从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝肾cDNA文库中克隆到草鱼cyclin G1基因.测序结果表明,草鱼cyclin G1全长cDNA为2 118 bp,使用ORF finder推译其开放阅读框为第256 bp～第1 155 bp,编码299个aa,SMART在线软件预测其中N端第57个aa～第143个aa为细胞周期蛋白盒.同源性比对分析显示cyclin G1在鱼类中同源性极高,其中草鱼cyclin G1与斑马鱼的同源性为90%.通过PAML软件的密码子替换模型进行适应性进化分析,结果表明cyclin G1编码蛋白的26A、171A和225K氨基酸位点受到正选择作用.本研究为进一步了解草鱼cyclin G1结构功能与分子演化打下基础.     

马铃薯gbss、ssⅡ和ss Ⅲ基因片段的融合及其RNAi载体的构建

颗粒结合淀粉合成酶（GBSS）与可溶性淀粉合成酶（SSS）是淀粉合成的关键酶,其活性大小直接影响着淀粉的直链淀粉/支链淀粉比例、淀粉链长及结构等,进而影响着其品质。利用blast及分子生物学软件DNAStar对gbss、ssⅡ和ss Ⅲ基因的cDNA序列同源性进行分析比较,选用gbss的261bp（1～261）,ssⅢ的244bp（2164～2407）,ssⅡ的281bp（161～441）的cDNA片段,并应用重叠PCR法将其拼接成一融合基因gbs3s2,构建了以CaMV 35S启动子驱动的含有"正向gbs3s2融合片段-pdk内含子-反向gbs3s2融合片段"ihRNAi的植物表达载体,为培育糊化温度低的马铃薯品系奠定基础。     

马尾松毛虫质型多角体病毒NS5蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对马尾松毛虫质型多角体病毒的增殖,纯化,获得一株单一质型多角体病毒。提纯的病毒粒子经SDS－热酚法抽提,在使用低熔点琼脂凝胶电泳分离基因组dsRNA,回收纯化第九片段S9。SgRNA双链经高温变性,使用正反两种引物逆转录合成cDNA双链,使用同样的引物经PCR扩增后,克隆在pMD18-T载体上。利用两种引物组合,获得了大小两个亚克隆片段。序列测定结果表明,较小亚克隆片段长405bp,较大亚克隆片段长677bp,经过序列拼接,得到一个977bp的序列,其中包含一个963bp大的开放阅读框（ORF）。推测DpCPVS9基因编码一个320个氨基酸的多肽,分子质量35.66kDa。和家蚕1型质型多角体病毒的I株（BmCPV-I Istrain)位于第九片段的NS5蛋白基因相比较,核苷酸和编码氨基酸序列同源性分别为86．0％和93．4％。     

黄鳝Nup93基因的分子克隆及其在性腺和肾的显著表达

核孔蛋白（Nucleoporins,Nups）是核孔复合体（Nuclear pore complexes,NPC）的重要组成成分,核孔复合体可以控制细胞内信号分子在核质问的双向转运,从而控制基因表达、细胞增殖和分化。在构建的黄鳝精巢SMART cDNA文库中,采用差异筛选的方法得到黄鳝核孔蛋白家族中Nup93基因的3’端片段,根据此段序列设计引物,使用兼并PCR和5＇RACE方法克隆得到此基因的全长cDNA。序列比对显示该基因与酵母Nic96、斑马鱼Nup93和人类Nup93的同源性分别为36．5％、94．6％和90．5％。进化树分析显示,黄鳝Nup93与其他鱼类的Nup93归为一支。采用荧光定量PCR方法对不同性别黄鳝的性腺和其他组织内该基因的表达作定量分析发现,Nup93在性腺和肾中的表达量远高于其他组织,而且表达量存在一定的性别差异。这一结果提示Nup93可能与性腺发育相关。     

从小鼠11.5d胚胎cDNA文库中筛选Dishevelled2相互作用蛋白

Dishevelled (Dvl)是个多功能、进化上非常保守的蛋白 ,在Wnt信号传导通路中起着重要的作用。为了研究Dishevelled介导Wnt信号传递的分子机制 ,利用GAL4酵母双杂交系统筛选了小鼠11.5d胚胎cDNA文库 ,发现了15个可与小鼠Dvl2DEP结构域和羧基端相互作用的蛋白质。将阳性文库质粒测序并对测序结果做BLAST分析 ,发现其中一个阳性克隆是编码Gli3蛋白氨基端 (6-122aa)的cDNA片段 ,从而暗示Gli3蛋白可能与Dishevelled一起作用并参与某些生物学过程.     

中华眼镜蛇心脏毒素(CardiotoxinⅢ)的克隆及其在大肠杆菌和酵母中的表达

心脏毒素cardiotoxinⅢ（CTXⅢ）是中华眼镜蛇毒主要组分之一,根据Genbank中已有的CTXs序列设计特异性引物,从中华眼镜蛇毒中克隆出208bp的CTXⅢ片段,并将该基因片段分别克隆至大肠杆菌His—patch ThioredoxinB载体中,重组CTXⅢ经渗透休克分泌至胞外。将CTXⅢ基因插入酵母pPIC9K分泌型表达载体重组表达,N端带有3个氨基酸（GYT）残基的重组CTXⅢ（rCTXⅢ）分泌量达9．5mg／L,经一步凝胶过滤纯化,其纯度达90％以上,纯化率达65％。经细胞毒性实验检测,纯化的rCTXⅢ 12h的IC50为4．66μg／ml,证实重组蛋白具有良好的生物学活性。     

单纯疱疹病毒II型糖蛋白G主要抗原表位的表达和抗原性检测*

利用PCR拼接技术,合成含单纯疱疹病毒II型糖蛋白G(gG2)抗原表位（氨基酸序列第561～578位）的片段,并进一步利用基因工程技术获得该表位的双拷贝片段,克隆入pET-KDO表达载体进行原核表达。经IPTG诱导后,高效表达出分子量大小约为39,000D的融合蛋白,经Western-blot检测具有良好的抗原性。表达的融合蛋白经凝血酶切割和亲和层析纯化,得到双拷贝gG2（561～578aa）目的蛋白,经ELISA检测具有良好的灵敏度和特异性。该重组抗原的构建和表达可用于HSV-2特异性血清学诊断的研究。     

甜菜夜蛾泛素延伸蛋白基因cDNA的3′RACE-PCR扩增及其克隆和表达

根据已知的草地夜蛾Spodoptera frugiperda的泛素延伸基因 5'端核苷酸序列设计引物,应用3'RACE-PCR技术,从甜菜夜蛾S. exigua脂肪体组织总RNA中反转录扩增泛素基因的cDNA片段。扩增得到的片段全长513 bp,3'末端有123 bp的非翻译区,翻译区编码一个长为129个氨基酸残基的蛋白质,预测分子量为14.8 kD。同源分析表明,此cDNA序列为ubiquitin-53aa extension protein(ubi-53) 基因,在泛素蛋白后融合了一个核糖体L40蛋白（ribosomal L40 protein）。用MagAlign和Genedoc软件对cDNA编码的氨基酸序列进行了同源性分析,结果表明： 甜菜夜蛾的ubi-53基因与真核生物家蚕Bombyx mori、草地夜蛾、果蝇Drosophila melanogaster和人Homo sapienes泛素的同源性分别为96.9%、98.5%、95.3%和93.0%,与甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeNPV)泛素的同源性为78.8%,说明真核生物的泛素基因与核型多角体病毒的泛素基因可能存在不同的分子进化途径。将甜菜夜蛾的ubI-53基因克隆到原核表达载体pET-28a上,转化至BL21（DE3）中,用IPTG进行诱导表达,用异源泛素单克隆抗体进行Western blot检测,证明原核表达蛋白是目的蛋白。     

美洲鲽抗冻蛋白基因的克隆及在E.coli中的表达

本文报告了美洲鲽抗冻蛋白基因的克隆及在E.coli中表达的研究,以质粒P~(CT5)作为抗冻蛋白基因的供体,p~(ORF-2)作为表达载体。用HpaⅡ酶从质粒p~(CT5)上切下抗冻蛋白基因片段,再经Bal 31酶,绿豆核酸酶处理,连接上BglⅡ接头,然后插入到p~(ORF-2)的BglⅡ位点上,借助于p~(ORF-2)上的β-半乳糖苷酶基因的活性,使含正确插入抗冻蛋白基因的克隆呈现出蓝色菌落,共获得4000多个转化子,其中有201个蓝色克隆。对于50个蓝色克隆提取质粒DNA,电泳后发现均大于p~(ORF-2)。用BglⅡ消化后,可以发现有300—1500bpDNA片段,同时确定了抗冻蛋白基因在p~(ORF-2)中的插入方向,对于正确插入的克隆作出部分限制性内切酶图谱,测定出插入的抗冻蛋白基因片段的DNA序列,然后将重组质粒从E.coli MH1000菌株转化到E.coliTK1046中,研究分析表达产物,SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳结果证明插入的抗冻蛋白的基因已表达,有明显的融合蛋白带,分子量大于β-半乳糖苷酶、是由大肠杆菌的外膜蛋白F,抗冻蛋白和β-半乳糖苷酶组成。融合蛋白含量占总蛋白的20％左右。