蚯蚓纤溶酶的分离纯化及性质

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及性质邢宝东殷慎敏茹炳根（北京大学生命科学学院生物化学及分子生物学系,北京１００８７１）关键词蚯蚓;纤溶酶;纤维蛋白收搞日期：１９９７－０１－２１;接收日期：１９９７－０３－２７。蚯蚓作为中药已有悠久历史,许多中医都把它作为活血药...     

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及部分序列的测定

以新鲜蚯蚓为原料,经过保温抽提、乙醇沉淀、ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ离子交换层析、Ｌｙｓｉｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析以及ＳＤＳ－ＰＡＧＥ制备电泳等纯化步骤,得到一种纯度达９５％以上的蝗蚓纤溶酶,该酶具有强烈的溶解纤维蛋白折作用及蛋白酶活性,平板法测得其比活性为９００ＵＫ单位／毫克蛋白,ＴＡＭＥ法测得其比活性为２５０００单位／毫克蛋白,酶学性质研究表明其最适反应温度为６５     

蚯蚓纤溶酶组分及其基因的多态性

生化制备证明,蚯蚓纤溶酶为一组含有10个以上同工酶组分的混合酶.为了研究这些组分的DNA和蛋白质序列的异同,本文通过对数据库中已报道的28条蚯蚓纤溶酶基因按相似性进行归类,将它们分为4组(基因型).同一组中的序列具有共同特征,即保守的N-末端、C-末端和相同的结构域,而且这些结构域在序列中分布的位置也相同;但它们之间在中间部分存在明显差异,这些差异说明了基因型中存在多态性.这种多态性可能是它们在体内溶栓的药理药效作用存在差异的结构基础.     

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及部分序列的测定

以新鲜蚯蚓为原料,经过保温抽提、乙醇沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow离子交换层析、Lysine-Sepharose4B亲和层析以及SDS-PAGE制备电泳等纯化步聚,得到一种纯度达95％以上的蚯蚓纤溶酶．该酶具有强烈的溶解纤维蛋白的作用及蛋白酶活性,平板法测得其比活性为90OUK单位／毫克蛋白,TAME法测得其比活性为2500O单位／毫克蛋白．酶学性质研究表明其最适反应温度为65℃,最适反应PH值为8．5．该酶的分子量为33kD,等电点为pH3．5．还对该酶进行了氨基酸组成分析,并测定了其N端部分序列．     

蚯蚓纤溶酶组分的抗原性

以大豆胰蛋白酶抑制剂为配基 ,通过亲和层析制备出的蚯蚓纤溶酶 (EFE)含有 11～ 13个组分 .为了了解这些组分的相互关系 ,用EFE免疫家兔获得了抗血清 .利用该抗血清与已纯化的 10个组分进行免疫双扩散 ,根据形成沉淀线的形状可以将上述 10个组分分为 4大组 .各组内组分之间的沉淀线完全融合 (免疫反应同一性 ) ;组间沉淀线交叉 (免疫反应非同一性 )或为支线 (免疫反应部分同一性 ) .这种按免疫学性质分组与根据分子量大小、氨基酸组成和N端氨基酸序列分组基本吻合 .上述结果为EFE的分类提供了依据 .     

蚯蚓纤溶酶的纯化及稳定性研究

蚯蚓纤溶酶（ＥＰＡ）抽提液经３０％ ～７０％ 饱和度的（ＮＨ４）２ＳＯ４ 盐析、ＤＥＡＥ—纤维素柱层析、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５葡聚糖凝胶过滤等纯化步骤,得到了具有纤溶活性的洗脱峰,置凝胶电泳后,得到四个活性组分,它们经５０℃保温６ｈ,活力上升６４％ ;在２ ｍ ｏｌ／Ｌ盐酸胍存在时,活力仅保存７．２％ ,当其浓度降低时,活力可恢复至９０％ ;在１％ ＳＤＳ存在时,活力仅保存１２．１％ ,但当ＳＤＳ除去时,活力又可恢复。因此,盐酸胍、ＳＤＳ均为ＥＰＡ 可逆性抑制剂。另外,ＥＰＡ 中含有较高的糖链（占总量的４５％ ）,具有良好的抵抗自水解作用。     

蚯蚓纤溶酶组分的抗原性分析

  用热变性蚯蚓纤溶酶(earthworm fibrinolitic enzyme,EFE)组分EfP-0-2、EfP-Ⅰ-1、EfP-Ⅱ-1, 以及重组蛋白EfP-Ⅲ-2为抗原,免疫家兔获得了抗血清,利用获得的抗血清对部分组分的免疫学同一性进行了验证.EfP-0、EfP-Ⅰ、EfP-Ⅱ的免疫双扩散反应表明,EfP-Ⅰ和EfP-Ⅱ具有部分免疫学同一性. 利用DNAMAN软件对获得的EfP-0、EfP-Ⅰ、EfP-Ⅱ、EfP -Ⅲ的蛋白质序列进行了初步分析,包括整个序列相似性比对、氨基酸组成、蛋白酶消化、抗原肽、疏水性和亲水性轮廓等,并对N端氨基酸序列进行了分析.结果表明,EfP-Ⅰ和EfP- Ⅱ具有部分免疫学同一性是由它们蛋白质序列的组成和结构决定的.     

蚯蚓纤溶酶的成分分析

蚯蚓纤溶酶（ｅａｒｔｈｗｏｒｍｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｓ,ＥＦＥ）是从蚯蚓体内提取的一类纤维蛋白水解酶,是一种新的溶栓药．利用亲和层析技术,自蚯蚓匀浆液一步提取蚯蚓纤溶酶,并对该酶的成分进行了分析．实验表明,蚯蚓纤溶酶是一组非均一的糖蛋白,含糖量为５％左右,以中性已糖为主;等电点（ｐＩ）在４．０以下;富含Ａｓｐ,而Ｍｅｔ、Ｔｒｐ和Ｌｙｓ含量很少;ｌｍｇ蚯蚓纤溶酶相当于２５０～３００尿激酶单位．     

赤爱胜蚯蚓(Eisenib Foetide Sorigng)纤溶酶的研究 1.提取纯化和生物化学性质

采用35％和65％的饱和硫酸铵分级沉淀法,获得蚯蚓纤溶酶活性蛋白,并对其纤溶酶的分子量,纤溶酶对其底物专一性,温度对纤溶酶的影响,纤溶酶最适pH值和pH值稳定性,纤溶酶的等电点,抑制剂对蚓蚯纤溶酶的影响几方面的测定,从而确定了蚯蚓纤溶酶的生物化学性质。     

蚯蚓纤溶酶的糖成分分析

以大豆胰蛋白酶抑制剂为配基的亲和层析制备的蚯蚓纤溶酶是一组糖蛋白。通过苯酚一硫酸法测中性糖,3,5一二硝基水扬酸法测还原糖,硅胶G薄层层析法鉴定糖的种类,结果为：蚯蚓纤溶酶主要含有中性己糖,含量为15％左右,TFMS的去糖处理会使蚯蚓纤溶酶酶活丢失．     

蚯蚓纤溶酶基因的克隆与序列分析

目的:获取蚯蚓纤溶酶(EFE)的基因,并对其进行序列分析。方法:从赤子爱胜蚓中提取总RNA,然后利用RT-PCR技术扩增EFE的基因,并将其插入pUCm-T载体,经PCR和酶切鉴定后进行序列测定及分析。结果:DNA序列分析表明,所克隆的EFE基因全长为738bp,其中编码区段为735bp,共编码245个氨基酸残基,成熟肽为238个氨基酸残基。与GenBank中已报道的粉正蚓的EFE序列F-Ⅲ-2的同源性最高,两者在核苷酸序列上有2处不同,即第137位(T→C)和第632位(G→T),密码子也因而分别由GTC、GGT变为GCC、GTT,导致第46位、211位的氨基酸残基分别由缬氨酸、甘氨酸变为丙氨酸和缬氨酸。结论:从赤子爱胜蚓中成功克隆了1条EFE基因F245。序列测定及同源性分析表明,蚯蚓纤溶酶F245与已报道的多条EFE基因序列具有高度同源性,且具备完整的编码区。该序列的克隆为用基因工程的方法生产单一成分的高酶活性EFE奠定了基础。     

中药广地龙中纤维蛋白溶酶提取工艺的优化

通过正交设计实验和利用国际上流行的统计分析软件SPSS10.0对蚓纤溶酶的提取结果进行方差分析,考察了提取时间、提取次数和溶剂体积3个因素对提取效果的影响,并考察了硫酸铵盐析的最适浓度段,得到了一条较好的提取工艺。     

蚯蚓纤溶酶底物特异性

蚯蚓纤溶酶是具有较强溶栓作用的丝氨酸蛋白酶,为研究蚯蚓纤溶酶在溶栓的同时是否对其他血液蛋白有破坏作用,本实验以一些血液功能蛋白为底物,用蚯蚓纤溶酶在体外对其进行水解,采用SDS—PAGE检测水解前后底物成分的变化。结果显示,蚯蚓纤溶酶短时间内能完全水解纤维蛋白和纤维蛋白原,长时间作用下能部分水解牛血清白蛋白和人免疫球蛋白重链,不水解牛血红蛋白、牛血超氧化物歧化酶和牛凝血酶原。表明蚯蚓纤溶酶对血栓成分具有较强的识别和水解能力,而对其他血液蛋白作用微弱,说明蚯蚓纤溶酶作为药物使用时具有较强的溶栓和预防血栓形成的作用,且副作用较小。     

江浙蝮蛇蛇毒纤溶酶的纯化

目的：从江浙蝮蛇蛇毒中纯化出无出血毒的纤溶酶。方法：经DEAE-SepharoseFF离子交换树脂和Superdex75PG凝胶过滤树脂,从江浙蝮蛇蛇毒中纯化出2种可直接溶解纤维蛋白的蛋白酶：F1,F2。结果：它们20μg皮下注射小鼠都无出血反应,F1,F2SDS-PAGE电泳纯度在95%以上。结论：纯化的两个纤溶酶为进一步基础研究和临床应用奠定了基础。     

Purification,characterization and crystallization of a group of earthworm fibrinolytic enzymes from Eisenia fetida

Seven fibrinolytic enzymes were purified from the earthworm Eisenia fetida. The molecular weights of the enzymes were 24663, 29516, 29690, 24201, 24170, 23028 and 29595, and the respective isoelectric points were 3.46, 3.5, 3.5, 3.68, 3.62, 3.94 and 3.46. All the proteases showed different fibrinolytic activity on fibrin plates. Studies on substrate specificity and inhibition indicated that they belonged to different types of serine proteases. N-Terminal sequencing indicated their high homology to those from the earthworm Lumbricus rubellus. All the enzymes have been crystallized.     

蚯蚓纤溶酶新基因PV242的克隆与表达

从我国特有的双胸蚓属（Lumbricus bimastus）蚯蚓体内提取到一种有纤维蛋白平板溶解活性的蛋白质,采用聚偏二氟乙烯膜(PVDF)微量测序法测得蛋白质的N端氨基酸序列,依此设计简并引物,通过RT-PCR获得其对应cDNA.该cDNA全长888 bp,1～726位核苷酸对应读码框架(ORF),编码含242个氨基酸的成熟肽.终止子（TAG）位于cDNA的727～729位,其余核苷酸序列为3′端非编码区.成熟肽命名为蚯蚓纤溶酶PV₂₄₂.蛋白质预测得知蛋白质等电点为4.33,含组氨酸(His44)及丝氨酸 (Ser191)两个活性位点;蛋白质由两个结构域组成,表面有活性裂隙;该蛋白质属丝氨酸蛋白酶超家族胰蛋白酶类.经国际基因库等多种查询比较未见PV₂₄₂基因的报道,为首次发现的新基因,在国际基因库的输入号为GenBank AF109648.随后构建了pTrxFUS-PV₂₄₂重组质粒,并在大肠杆菌GI724中获得融合蛋白TrxA/PV₂₄₂的可溶性表达,采用离子交换层析法纯化表达蛋白,融合蛋白有纤维平板溶解活性.     

溶血栓酶活性测定的一种新方法

根据血栓溶解会引起吸光度下降的特性,在细胞培养板上制作小血栓,利用酶标仪同时检测多个样品的吸光度变化.发现反应初期,血栓吸光度的降低同时间呈线性关系,其回归方程的斜率k与酶活性成正比.因此可用k来表示酶活性.此方法与蛋白凝块溶解时间法(CLT法)相关性很好.该法省时,成本低,是一种较好的、实用的检测溶血栓酶活性的方法.