鳄梨冷藏过程中体外转译和基因表达的研究

鳄梨果实经低温贮藏一定时期,从中提取ＲＮＡ,进行体外转译和同源探针杂交分析,以研究冷藏过程中特写基因的表达时期和水平。并用纯化出的冷藏果实的ｍＲＮＡｓ,构建其ｃＮＤＡ文库。对文库作了初步筛选,２４个含ｃＤＮＡ插入片段的菌落能差示地与贮藏前和７℃贮藏的ｍＲＮＡ合成的探针杂交。３个纤维素酶ｃＤＮＡ能很好杂交,２个与鳄梨乙烯形成酶ｃＤＮＡ有同源性。     

人乳头瘤病毒6b型H增强子样序列在大肠杆菌中增强基因转录和β—干 …

将人乳头瘤病毒６ｂ型（ＨＰＶ６ｂ）基因组上游调控区（ＵＲＲ）５４０ｂｐ的Ｓａｕ３Ａ－Ｎａｒｌ片段（Ｈ序列）,正反向插入β－干扰素表达载Ｔｒｐ劝子上游,使β－ＩＦＮ表达明显增强,可使基因表达水平提高３．６倍和２．１倍。Ｈ序列正反向插入增强子检测载体不仅使β－半乳糖苷酶表达活性增加－１０倍,还能使半乳糖苷酶ｍＲＮＡ量明显增高,证明Ｈ序列对被调控基因的增强作用是发生在转录水平。     

人乳头瘤病毒6b型H增强子样序列在大肠杆菌中增强基因转录和β-干扰素表达

将人乳头瘤病毒６ｂ型（ＨＰＶ６ｂ）基因组上游调控区（ＵＲＲ）５４０ｂｐ的Ｓａｕ３Ａ－ＮａｒＩ片段（Ｈ序列）,正反向插入β－干扰素表达载体Ｔｒｐ启动子上游,使β－ＩＦＮ表达明显增强,可使基因表达水平提高３．６倍（正向）和２．１倍（反向）。Ｈ序列正反向插入增强子检测载体不仅使β－半乳糖苷酶表达活性增加５－１０倍,还能使半乳糖苷酶ｍＲＮＡ量明显增高,证明Ｈ序列对被调控基因的增强作用是发生在转录水平。     

β-半乳糖苷酶基因在猕猴桃果实成熟过程的表达

从成熟中华猕猴桃果实中克隆到了一个 β 半乳糖苷酶基因cDNA片段 ,其长度为 747bp ,有一由 2 49个氨基酸组成的开放阅读框架 ,它与苹果、芦笋、绿花椰菜、番茄中 β 半乳糖苷酶基因cDNA相应区段的核苷酸同源性为 6 7.3 %～ 70 .3 %,氨基酸同源性为6 9.1%～ 72 .7%。用该片段为探针进行Northern分析表明 ,果实采收时 ,β 半乳糖苷酶mRNA水平最高 ,随后呈下降变化 ,同时 β 半乳糖苷酶基因的表达可为外源乙烯所诱导 ,但在果实乙烯跃变期间 β 半乳糖苷酶基因的表达信号无显著变化。文中对 β 半乳糖苷酶在猕猴桃果实成熟衰老过程的作用进行了讨论     

酵母PH081基因的克隆和表达

从酵母染色体ＤＮＡ中获得１个约３．０ｋｂ的ＢａｍＨＩ的克隆片段和１个约５．０ｋｂ的ＰｓｔＩ片段,前者包含１７４５ｂｐ的ＰＨＯ８１基因编码序列及１２４４ｂｐ的上游列,后者包含２２３６ｂｐ的编码序列及约２．８ｋｂ的下游序列,经拼接得完整的ＰＨＯ８１基因。以ＵＲＡ３基因取代部分ＰＨＯ８１的编码序列,通过体内同源重组,获得ＰＨＯ８１基因缺陷的酵母细胞株。构建ＰＨＯ８１－ＬａｃＺ融合基因,以β－半乳糖苷敏的     

黑子南瓜甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的克隆及序列分析

依据国外报道的南瓜甘油－３－磷酸转酰酶（ＧＰＡＴ）基因的ｃＤＮＡ序列合成相应引物,用ＲＴ－ＰＣＲ技术,成功地分离了黑子南瓜（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｆｉｃｉｆｏｌｉａ）ＧＰＡＴ基因的ｃＤＮＡ片段,并亚克隆到了ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统的多克隆位点上,序列分析表明黑子南瓜ＧＰＡＴ基因的ｃＤＮＡ序列及递推的氨基酸序列与南瓜（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｍｏｓｃｈａｔａ）相比分别具有９８％和９６５％的同源性。在１１８８ｂｐ中有２２个核苷酸发生变化,导致１３个氨基酸的改变     

海藻糖合酶基因的克隆及其植物表达载体的构建

以担子菌灰树花的菌丝体中提取总ＲＮＡ,并纯化出ｍＲＮＡ,ｍＲＮＡ经反转录合成ｃＤＮＡ第一链,以ｃＤＮＡ第一链为模板经ＰＣＲ扩增海藻糖合酶（Ｔｓａｓｅ）基因,获得一长约２．２ｋｂ的片段,把该片段连接一ｐＧＥＭ－Ｔ－ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ上进行测序,其全长共２１９９ｂｐ。随后将此片段以正向插入植物表达载体ｐＢＩ１２１的ＨｉｎｄⅢ＋Ｘｂａｌ位点构建ｐＵＢ,再把海藻糖合酶基因以正向插入载体ｐＵＢ的ＢａｍＨ     

河套蜜瓜ACC合成cDNA酶片段的克隆和序列分析

１－氨基环丙烷－１－羧酸（ＡＣＣ）合成酶是高等植物中乙烯生物合成的关键酶。以成熟河套蜜瓜果实的ＲＮＡ为模板,经反转录和ＰＣＲ扩增得到预期大小的ＤＮＡ片段,插入到ＰＵＣ１９的ＳｍａＩ位眯后转化Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９,筛选出重组子ＰＨＭＡＳ１。离列分析表明获得了６２７ｂｐ的ＡＣＣ合成酶ｃＤＮＡ片段。与已报道的ＡＣＣ合成酶基因相应离理比较有很高的同源性。     

人胎肝唾液酸转移酶基因的克隆及测序

根据已克隆的唾液酸转移酶的保守区的序列,以人胎肝ｍＲＮＡ为模板扩增出１５０ｂｐ的片段并测序。其中一个片段（ｓ３８）与已克隆的唾液酸转移酶的活性中心有５７％～９７％的同源性。根据ｓ３８的序列合成寡核苷酸并标记后用作探针筛选人胎肝ｃＤＮＡ文库。从文库中分离了一个编码α２,３唾液酸转移酶的ｃＤＮＡ。该ｃＤＮＡ序列含一个编码３４０个氨基酸的开放读框,推导的氨基酸序列与人颌下腺Ｇａｌβ１,３ＧａｌＮＡｃα２,３唾液酸转移酶相同,与猪颌下腺α２,３唾液酸转移酶有８３２％的同源性。表明从人胎肝ｃＤＮＡ文库中分离的ｃＤＮＡ所编码的蛋白为Ｇａｌβ１,３ＧａｌＮＡｃα２,３唾液酸转移酶     

重叠片段法克隆全长人肝细胞生长因子cDNA

通过重叠片段的ＲＴ－ＰＣＲ方法,从人胎盘组织克隆了人全长肝细胞生长因子ｃＤＮＡ片段（约２２００ｂｐ）,经酶切证实和测序分析都表明该片段确为人ＨＧＦｃＤＮＡ。本文所用方法解决了扩增较长目的基因片段时,由于ＲＮＡ酶及反转录酶的ＲＮＡ酶Ｈ活性和ｍＲＮＡ二级结构等多种因素的影响,使获取长片段ｃＤＮＡ难以成功的难点     

酵母K.cicerisporus基因组中有启动子功能的DNA片段的克隆

利用以３′－氨基糖苷磷酸转移酶基因（ＡＰＨＩ）为报告基因的一套启动子探针质粒ｐＳＫ－ｋａｎ４０１、ｐＳＫ－ｋａｎ１１０５、ｐＳＫ－ｋａｎ１２３８,从酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｃｉｃｅｒｉｓｐｏｒｕｓ基因组中克隆到８个有较强启动功能的ＤＮＡ片段,分析出３′端ＤＮＡ序列,并在酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ中通过检测报告基因与３－磷酸甘油醛脱氢酶基因（ＧＡＰＤＨ）的ｍＲＮＡ表达量的比值,确定它们的功能强度,其中ｐＳＫ－ｋａｎ４０１－４１和ｐＳＫ－ｋａｎ１１０５－５１两个克隆的插入片段具有较强的启动子功能,并证明这两个片段在酵母Ｋ．ｃｉｃｅｒｉｓｐｏｒｕｓ中也有启动子功能。     

酶母K.cicerisporus基因组中有启动子功能的DNA片段的克隆

利用以３′－氨基糖苷磷酸转移酶基因（ＡＰＨＩ）为报道基因的一套启动子探针质粒ｐＳＫ－ｋａｎ４０１、ｐＳＫ－ｋａｎ１１０５、ｐＳＫ－ｋａｎ１２３８,从酵母Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｃｉｃｅｒｉｓｐｏｒｕｓ基因组中克隆到８个有较强启动功能的ＤＮＡ片段,分析出３′端ＤＮＡ序列,并在酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏ８ｍｙｃｅｓｅ ｌａｃｔｉｓ中通过检测报告基因与３－磷酸甘油醛脱氢酶基因（ＡＰＤＨ）的ｍＲＮＡ表达量的比     

柯萨奇B3病毒结构和非结构蛋白基因重组质粒的构建及其在体外真核细胞中的

制备ＣＶＢ３结构蛋白和非结构蛋白重组质粒ＤＮＡ疫苗时,采用ＲＴ－ＰＣＲ从ＣＶＢ感染的ＨｅＬａ细胞中扩增ＶＰ１、ＶＰ２、２Ａ和３Ｄ基因,重组入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３中,构建ｐｃＤＮＡ３／ＶＰ２、ｐｃＤＮＡ３／ＶＰ１、ｐｃＤＮＡ３／２Ａ和ｐｃＤＮＡ３／３Ｄ重组质粒,经酶切和测下实扩增的序列并将各重组质粒体外转染真核细胞ＣＯＳ－７,用ＲＴ－ＰＣＲ检测ｍＲＮＡ的转录,用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物。结果４种重组质粒酶切出相应大小的目的片段,经测序证实为ＣＶＢ３相应序列,Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ证实能够在体外真核细胞中表达。本文成功构建ＣＶＢ３结构与非结构蛋白的重组质粒ＤＮＡ疫苗,为进一步研究其免疫效果奠定了基础。     

醇母PHO81基因的克隆和表达

从酵母染色体ＤＮＡ中获得１个约３．０ｋｂ的ＢａｍＨＩ的克隆片段和１个约５．０ｋｂ的ＰｓｔＩ片段,前者包含１７４５ｂｐ的ＰＨＯ８１基因编码序列及１２４４ｂｐ的上游序列,后者包含２２３６ｂｐ的编码序列及约２．８ｋｂ的下游序列,经拼接得到完整的ＰＨＯ８１基因。以ＵＲＡ３基因取代部分ＰＨＯ８１的编码序列,通过体内同源重组,获得ＰＨＯ８１基因缺陷的酵母细胞株。构建ＰＨＯ８１－ＬａｃＺ融合基因,以β－半乳糖苷酶的活力表示ＰＨＯ８１基因的表达水平,研究了它的表达作用。ＰＨＯ８１基因为阻遏型表达,受无机磷浓度的控制,高磷使基因表达阻遏,低磷去阻遏。ＰＨＯ８１对其自身的表达有正调控作用,它与ＰＨＯ５和ＰＨＯ１１基因的调控模式相似,但ＰＨＯ８１上游调控序列和ＰＨＯ５及ＰＨＯ１１的同源性很低。     

黄芪毛状根GBSSI基因cDNA克隆及其结构分析

根据多种已发表的淀粉粒结构淀粉合成酶（ＧＢＳＳ）基因的比对分析,以它们保守区的核酸顺序为基础,设计一对简并引物。从膜荚黄芪（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ（Ｆｉｓｃｈ）Ｂｕｎｇｅ）毛状根提取ｍＲＮＡ,用ＲＴ－ＰＣＲ的方法扩增出５６０ｂｐ的ｃＤＮＡ片段。序列测定表明,此片段与发表的豌豆和马铃薯ＧＢＳＳＩ基因相应序列同源性分别达８９．６％和７３．０％,通过５′／３′ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ     

人IL-18 cDNA克隆及其真核表达质粒的构建

用ＲＴ－ＰＣＲ技术从健康人外周血单核细胞的总ＲＮＡ中扩增出编码白细胞介素１８的全长ｃＤＮＡ,并将此基因定向克隆入真核表达质粒载体ｐｃＤＮＡ３中,通过对转化子的筛选得到了带有ＩＬ－１８插入片段的阳性克隆,经酶切分析及核苷酸测序表明,克隆到的基因与文献报道的完全一致。把重组质粒ｐｃＤＮＡ３／ＩＬ－１８分别转染人肝癌细胞ＨｅｐＧ２和鼠肉瘤细胞Ｓ１８０,在ｍＲＮＡ水平检测到ＩＬ－１８的表达,但ＩＬ－１８ 的表达未诱导肿瘤细胞产生ＩＦＮ－γ。     

一种与Calpastatin具有部分同源结构的人精子膜蛋白的发现与研究

在以前工作中我们从人精子中分离纯化出一种与生育有关的糖蛋白,命名为ＢＳ－１７。本文用其多克隆抗血清从人睾丸λｇｔ１１ｃＤＮＡ表达库中克隆了编码ＢＳ－１７的ｃＤＮＡ片段。序列分析表明ＢＳ－１７ｃＤＮＡ片段长７９１ｂｐ,开放阅读框架５５８ｂｐ,可编码１８６个氨基酸。经数据库检索,该ｃＤＮＡ片段与人Ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎ（Ｃａ￣（２＋）依赖的半胱氨酸蛋白酶ｃａｌｐａｉｎ抑制剂）基因３’端顺序具有９９．７％的同源,与Ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎ蛋白质羧基末端同源性为９９．５％。用ｃＲＮＡ进行组织原位杂交结果表明,ＢＳ－１７基因表达于人精子减数分裂后期单倍精细胞阶段。     

Kl LAC4用作白色念珠菌的报告基因

由于ｌａｃＺ基因在白色念珠菌中不能工作。将克氏酵母的β－半乳糖苷酶基因Ｋｌ ＬＡＣ４构建了能在白色念珠菌中工作的报告基因。Ｋｌ ＬＡＣ４基因融合到白色念珠菌乙醇脱氢酶基因（ＡＤＨ１）的启动子后面,在ＡＤＨ１终止子的共同控制下构建Ｋｌ ＬＡＣ４的表达质粒ｐＹＰＢ１－ＬＡＣ４。ＰＹＯＢ１－ＬＡＣ４转化白色念珠菌并测定了在固体培养基中的β－半乳糖苷酶活性以及在液体增减基的β－半乳糖苷酶活力。结果表明Ｋｌ     

变铅青链霉菌66中对噬菌ΦHAU3显示抗性的基因（ψHAU3￣R）的核苷酸定序和分析

杂合质粒ｐＩＪ８３１０是链霉菌低拷贝质粒ｐＩＪ９２２１携带了１０．８ｋｂ来自变铅青链霉菌ＪＴ４６菌株,编码对噬菌体ΦＨＡＵ３抗性的ＤＮＡ片段。已知Ｔｎ４５６０插到该克隆中３ｋｂ的ＥｃｏＲＩ或３．３ｋｂ的ＢａｍＨＩ片段（这两个片段之间有２．５ｋｂ的重叠区）上,中断了ΦＨＡＵ３抗性基因的表达。已将３．０ｋｂ的ＢｃｏＡＩ片段分别以两种不同的取向克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）上。核苷酸序列分析揭示出一个１．３ｋｂ的ＯＲＦ的存在,其所编码的４７８个氨基酸组成的蛋白与λ噬菌体的ｅａ５９基因所编码的氨基酸序列显示了高度的同源性,其氨基酸序列的同一性高达３７％,相似性达５８％,而λ噬菌体的ｅａ５９基因是编码赖ＡＴＰ和单键ＤＮＡ的核酸内切酶Ｉ的,该区域与λ的复制无关。此外,这段具有高度同源性的ＤＮＡ区域的Ｇ＋Ｃ％只有６０％,低于变铅青霉菌ＤＮＡＧ＋Ｃ％的平均值（７４％）。     

大肠杆菌cai DE的基因克隆与表达

从Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ４１００菌体的染色体ＤＮＡ中利用鸟枪法克隆含编码肉碱消旋酶及相关因子的ｃａｉＤＥ基因片段,并经序列分析验证,由重组质粒ｐｌＸ３９３亚克隆得到ｐＤＳＷ２重组表达质粒,后者转入Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株中是丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导,在聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）上分子量为３０ｋＤ和２４ｋＤ附近可见明显的表达蛋白带。