鹅膏环肽毒素生源合成的研究进展

在蘑菇目Agaricales中,已知鹅膏属Amanita、环柄菇属Lepiota和盔孢伞属Galerina 3个属的部分物种能产生剧毒的鹅膏环肽毒素。全球90%以上的致死性蘑菇中毒事件是由含鹅膏环肽蘑菇导致。上述3个属的剧毒蘑菇虽然亲缘关系较远,但却可以合成同一种鹅膏环肽毒素,且使用了大致相同的生源合成代谢途径,涉及多个毒素合成基因,采用了特殊的组合式合成机制。本文总结了鹅膏环肽毒素合成途径研究的最新进展,指出了当前工作中遇到的一些难题,对未来研究的趋势进行了展望。     

东北地区非鹅膏属真菌中鹅膏肽类毒素的分布

本文采用高效液相色谱（HPLC）法对采自中国东北地区的95份非鹅膏属真菌样本进行鹅膏肽类毒素（α-amanitin、β-amanitin、phalloidin）检测。为获得更准确的实验结果,对57份阳性反应样品利用UPLC-MS/MS进一步测定,值得注意的是,测定结果中褶纹丝盖伞Inocybe leiocephala确认同时含有以上3种毒素。本研究通过检测鹅膏肽类毒素在非鹅膏属真菌中的分布,对误食中毒事件的发生起到一定程度的预防和警示作用,另一方面筛选出含有鹅膏肽类毒素的新型毒菌资源,为毒菌资源的开发利用提供基础资料。     

基于转录组解析淡玫红鹅膏环肽基因家族特征及其系统发育

【背景】淡玫红鹅膏(Amanita pallidorosea)是鹅膏属檐托鹅膏组的一种剧毒鹅膏菌,其子实体内含有丰富的鹅膏环肽毒素,但其编码毒环肽和相关肽的基因家族"MSDIN"尚待深入研究。【目的】探究淡玫红鹅膏中编码毒环肽及相关肽的基因家族成员的多样性、保守性及其系统发育。【方法】采用Illumina HiSeq2000平台对淡玫红鹅膏转录组进行测序,使用TBLASTn软件对MSDIN基因家族进行检索,并设计特异性引物进行PCR验证,通过生物信息学比对分析MSDIN基因家族成员的种类和序列构成,通过重建分子系统发育树了解其演化历程。【结果】通过对MSDIN基因家族的查找,从转录组数据获得了60条环肽编码基因,经PCR验证其可编码32条环肽,包括α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽。本研究报道了8条新环肽。分子系统发育树分析显示,鹅膏环肽分为鹅膏毒肽、鬼笔毒肽和未知功能环肽3大支。系统发育结合保守序列推测出7条潜在的新毒肽。【结论】淡玫红鹅膏具有丰富的鹅膏环肽资源,利用转录组测序能够系统挖掘鹅膏环肽新资源,为其整体结构解析奠定基础。     

大孔吸附树脂联合葡聚糖凝胶Sephadex LH20分离制备鹅膏肽类毒素的研究

鹅膏菌肽类毒素是蘑菇中毒导致死亡的最主要因素,同时也是生物学研究领域的一种重要工具试剂,但由于其结构相似,分离制备单体化合物比较困难。通过4种大孔吸附树脂对致命鹅膏Amanita exitialis子实体中主要肽类毒素组分的静态吸附与解吸附性能比较,结果表明XAD16的吸附能力最强,同时也有较强的解吸附能力,但XAD16柱层析梯度洗脱时对毒素分离效果差,表明XAD16只具有吸附富集鹅膏肽类毒素的特性但不适于分离。经XAD16柱层析富集的毒素成分,通过葡聚糖凝胶sephadex LH20柱层析分离,结果表明sephadex LH20柱层析对鹅膏肽类毒素具有较好的分离效果,经过2次sephadex LH20柱层析,获得了5个纯度达50%–80%的鹅膏肽类毒素单体化合物,进一步利用半制备高效液相色谱系统(HPLC)纯化,分离得到了7个纯度达95%以上的鹅膏肽类毒素单体,其中5个经质谱分析鉴定为:α‐鹅膏毒肽(α‐amanitin)、β‐鹅膏毒肽(β‐amanitin)、脱氧二羟毒伞素(desoxoviroidin)、羧基三羟鬼笔毒肽(phallisacin)和羧基二羟鬼笔毒肽(phallacidin)。     

我国28种鹅膏菌主要肽类毒素的检测分析*

利用高效液相色谱(HPLC)技术对产于我国的28种鹅膏菌的主要肽类毒素(鹅膏毒肽和鬼笔毒肽)进行了检测分析,并和采于欧洲(德国)的毒鹅膏Amanita phalloides作对照,结果表明,3种东亚所特有的鹅膏菌(灰花纹鹅膏、致命鹅膏和黄盖鹅膏白色变种)和欧洲毒鹅膏所含毒素种类多、含量高,其子实体菌盖部位主要毒素总量分别达到12583.7μg/g、8152.6μg/g、1058.2μg/g、7456.2μg/g干重子实体,这4种鹅膏菌可称之为剧毒鹅膏菌。其它25种鹅膏菌中有10种检测出含有微量鹅膏毒肽,含量在19.5μg/g-151.2μg/g之间。在4种剧毒鹅膏菌中,子实体组织部位不同,毒素含量以及鹅膏毒肽和鬼笔毒肽在其中的分布也不一样,菌盖中的毒素含量最高,菌柄的毒素含量次之,菌托中的毒素含量最低;对于灰花纹鹅膏、致命鹅膏和黄盖鹅膏白色变种,无论在菌盖、菌柄和菌托中,鹅膏毒肽类毒素的含量都高于鬼笔毒肽类毒素,尤其以α-amanitin的相对含量最高;而在欧洲毒鹅膏中,菌盖、菌柄和菌托中都以鬼笔毒肽为主,尤其以phallacidin的相对含量最高,并且从菌盖至菌柄到菌托,鬼笔毒肽的相对含量依次增加。     

我国28种鹅膏菌主要肽类毒素的检测分析

利用高效液相色谱(HPLC)技术对产于我国的28种鹅膏菌的主要肽类毒素(鹅膏毒肽和鬼笔毒肽)进行了检测分析,并和采于欧洲(德国)的毒鹅膏。Amanita phalloides作对照,结果表明,3种东亚所特有的鹅膏菌(灰花纹鹅膏、致命鹅膏和黄盖鹅膏白色变种)和欧洲毒鹅膏所含毒素种类多、含量高,其子实体菌盖部位主要毒素总量分别达到12583．7μg／g、8152．6μg／g、1058．2μg／g、7456．2μg／g干重子实体,这4种鹅膏菌可称之为剧毒鹅膏菌。其它25种鹅膏菌中有10种检测出含有微量鹅膏毒肽,含量在19．5μg／g—151．2μg/g之间。在4种剧毒鹅膏菌中,子实体组织部位不同,毒素含量以及鹅膏毒肽和鬼笔毒肽在其中的分布也不一样,菌盖中的毒素含量最高,菌柄的毒素含量次之,菌托中的毒素含量最低;对于灰花纹鹅膏、致命鹅膏和黄盖鹅膏白色变种,无论在菌盖、菌柄和菌托中,鹅膏毒肽类毒素的含量都高于鬼笔毒肽类毒素,尤其以α-amanitin的相对含量最高;而在欧洲毒鹅膏中,菌盖、菌柄和菌托中都以鬼笔毒肽为主,尤其以phallacidin的相对含量最高,并且从菌盖至菌柄到菌托,鬼笔毒肽的相对含量依次增加。     

玫瑰红鹅膏主要肽类毒素的HPLC 测定及其对白色念珠菌的抑制活性

【目的】检测玫瑰红鹅膏中所含肽类毒素及其含量,并对其肽类毒素的抑制白色念珠菌活性进行研究。【方法】采用HPLC和ESI-MS法从玫瑰红鹅膏中分离并鉴定出所含肽类毒素,并采用HPLC法测定其子实体、菌盖及菌柄和菌托混合部分中肽类毒素的含量。同时,采用纸片法研究了玫瑰红鹅膏粗毒液和分离到的单品肽类毒素对白色念珠菌JLC31680和JLC31681的抑菌作用。【结果】分离并鉴定出α-鹅膏毒肽(α-AMA)、β-鹅膏毒肽(β-AMA)和二羟鬼笔毒肽(PHD)等3种肽类毒素。玫瑰红鹅膏子实体中α-AMA、β-AMA、PHD的含量分别为30.3168、6.9932和9.9459 mg/g;菌盖中含量分别为44.9573、11.0798和11.3025 mg/g;菌柄和菌托混合部分中:α-AMA 11.6904 mg/g和PHD 7.9775 mg/g,β-AMA未检出。粗毒液、α-AMA、β-AMA和PHD对白色念珠菌JLC31680均具有很好的抑制作用,抑制率分别达到11.96%、32.52%、23.29%(p<0.01)和15.46%(p<0.05);粗毒液和β-AMA对白色念珠菌JLC31681的最高抑制率分别为10.16%和11.10%(p<0.01),α-AMA对白色念珠菌JLC31681最高抑菌率为6.89%(p<0.05)。【结论】玫瑰红鹅膏中的三种肽类毒素的含量较高,是制备肽类毒素的新资源;其具有抑制白色念珠菌的活性,可开发利用。     

白鳞粗柄鹅膏菌丝的固态发酵

近年来 ,因鹅膏菌肽类毒素可用于分子生物学、医学、农学等领域而具广阔的开发前景[1] 。但由于鹅膏菌资源有限 ,而人工合成的毒素又不具活性 ,所以目前尚难以开发利用。加之鹅膏菌大多属于外生菌根真菌 ,虽然已在少数种的菌根合成方面取得了一些进展[2～ 4 ] ,但至今该属中绝大部份种仍属于自然界中难培养或未能培养的微生物 ,难以人工、半人工栽培。因此 ,目前国内还没有一种能规模化开发的毒素产品。而现在作为生化试剂的肽类毒素全部来源于欧美的毒鹅膏子实体 ,售价在每克 1 0万美元以上。所以 ,研究如何开发利用我国的鹅膏菌及其毒素具…     

多彩的菌物世界

正黄柄鹅膏Amanita flavipes S. Imai,担子菌门Basidiomycota,蘑菇纲Agaricomycetes,蘑菇目Agaricales,鹅膏科Amanitaceae,鹅膏属Amanita。该物种原描述于日本,在中国、日本、印度、巴基斯坦、韩国等地区广泛分布。图片由广东省科学院微生物研究所张明博士2020年9月4日摄于云南省普达措国家森林公园。     

β-鹅膏毒肽的反相高效液相色谱分离纯化*

用反相高效液相色谱,以0.02mol/L醋酸铵-乙腈为流动相的梯度洗脱模式,在295nm吸收值的条件下,灰花纹鹅膏菌Amanitafuliginea的肽类毒素可以被成功的分离和纯化。单个肽类毒素的鉴定是用反相高效液相色谱和质谱同时进行。用这一方法可从灰花纹鹅膏菌中分离纯化出β-鹅膏毒肽(β-amanitin),产量可达到:1158靏/g(干重),产品纯度达98%以上,回收率为95.3%。β-鹅膏毒肽的分子量为919.3Da。这个方法可用于其它鹅膏菌肽类毒素的分离纯化。     

β-鹅膏毒肽的反相高效液相色谱分离纯化

用反相高效液相色谱,以0.02mol/L醋酸铵-乙腈为流动相的梯度洗脱模式,在295nm吸收值的条件下,灰花纹鹅膏菌Amanitafuliginea的肽类毒素可以被成功的分离和纯化。单个肽类毒素的鉴定是用反相高效液相色谱和质谱同时进行。用这一方法可从灰花纹鹅膏菌中分离纯化出β-鹅膏毒肽(β-amanitin),产量可达到:1158靏/g(干重),产品纯度达98%以上,回收率为95.3%。β-鹅膏毒肽的分子量为919.3Da。这个方法可用于其它鹅膏菌肽类毒素的分离纯化。     

β—鹅膏毒肽的反相高效液相色谱分离纯化

用反相高效液相色谱,以0．02mol/L醋酸铵—乙腈为流动相的梯度洗脱模式,在295nm吸收值的条件下,灰花纹鹅膏菌Amanita fuliginea的肽类毒素可以被成功的分离和纯化。单个肽类毒素的鉴定是用反相高效液相色谱和质谱同时进行。用这一方法可从灰花纹鹅膏菌中分离纯化出β-鹅膏毒肽(β-amanitin),产量可达到：1158μg／g(干重),产品纯度达98％以上,回收率为95．3％。β-鹅膏毒肽的分子量为919．3Da。这个方法可用于其它鹅膏菌肽类毒素的分离纯化。     

鹅膏菌毒素及其毒理研究进展

鹅膏菌是一类真菌的 称,误食野生蘑菇的中毒事件中,９５％以上由鹅膏菌引起,国外自六十年代起,对其毒理进行了深入的研究,而国仙则只是在九十年代才刚开始这方面的工作。为促进国内鹅膏菌毒素毒理的研究,作者概括了国内外各方面的资料,写就本文。本文概述了鹅膏 多肽毒素的种类、鹅膏菌毒素中毒反应及病理学症状、机体对鹅膏菌毒素的吸收、鹅膏菌毒素的生和毒理以及鹅膏菌毒素在生命科学研究中的应用,为国内这方面的研究提     

α-鹅膏毒肽与真核生物RNA聚合酶Ⅱ相互作用研究进展

鹅膏毒肽是我国蘑菇中毒事件中致死率最高的蘑菇毒素。鹅膏毒肽引起机体中毒的主要机制为鹅膏毒肽与真核生物RNA聚合酶Ⅱ (RNAP Ⅱ)特异性结合并抑制mRNA形成。本文系统整理了有关α-鹅膏毒肽与真核生物RNAP Ⅱ相互作用的国内外研究进展。由于同一时代各领域对该主题有不同研究角度,研究进展既有平行也有交叉,因此,本文将鹅膏毒肽与真核生物RNAP Ⅱ相互作用的110多年研究史(1907-至今)分为8个阶段,包括(1) 鹅膏毒肽的早期研究、(2) 化学结构解析、(3) 毒理学研究、(4) 构-效关系研究、(5) 生物化学研究、(6) 分子生物学研究、(7) 结构生物学研究和(8) 药物开发与评价。本文按以上顺序,分主题论述α-鹅膏毒肽与真核生物RNAP Ⅱ相互作用的研究历程和重要研究结果,以期给中毒和临床毒理学等领域带来新的思考。     

α-鹅膏[蕈]毒环肽核酸适配体的筛选和结构分析

α-鹅膏[蕈]毒环肽(α-amanitin)是从致命鹅膏毒伞子实体中分离的多肽物质。本文采用配体指数富集系统进化(systemic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)技术,以α-鹅膏[蕈]毒环肽为靶蛋白,以亲和填料epoxy-activated sepharose 6B为筛选介质,从体外合成的随机单链DNA文库中筛选其核酸适配体。经过12轮筛选,将第12轮筛选产物克隆测序,对获得的12条核酸适配体进行分析。二级结构预测分析表明,茎环和口袋结构为主要的结构形式,提示其可能是核酸适配体与α-鹅膏[蕈]毒环肽特异性结合的基础。对得到的核酸适配体进行特异性和灵敏度检测,其中E06核酸适配体的特异性最好,为核酸适配体检测蘑菇中α-鹅膏[蕈]毒环肽的残留奠定了基础。     

灵芝总三萜对鹅膏毒肽中毒小鼠所致肝损伤的保护作用研究

鹅膏肽类毒素是蘑菇中毒导致死亡的最主要因素,用于鹅膏中毒治疗的解毒药物已有大量报道,水飞蓟宾（silibinin,SIL）被认为是目前最有效的解毒药物。灵芝作为我国传统的中药真菌,具有良好的保肝护肝作用。本文开展灵芝主要活性成分灵芝总三萜（Ganoderma total triterpenoids,GTT）和对照药物水飞蓟宾对α-鹅膏毒肽（α-amanitin,α-AMA）中毒小鼠所致肝损伤的保护作用及其抗氧化机理研究,结果表明α-鹅膏毒肽中毒小鼠经灵芝总三萜和水飞蓟宾治疗后小鼠血清中的ALT和AST活性显著降低,小鼠死亡率降低40%-50%,病理组织切片观察表明能明显减轻肝组织损伤的程度,说明灵芝总三萜与水飞蓟宾一样,对α-鹅膏毒肽中毒小鼠的肝具有很好的保护作用。灵芝总三萜给药组和水飞蓟宾给药组能显著增加肝组织中SOD和CAT的活性,显著降低肝脏中MDA含量,表明灵芝总三萜和水飞蓟宾具有抗氧化和自由基清除剂作用,能减轻α-鹅膏毒肽所引起的脂质过氧化伤害作用。     

灰花纹鹅膏中三个鹅膏毒肽的分离和结构研究

从灰花纹鹅膏(Amanita fuliginea)中分离得到3个已知鹅膏毒肽类成分,利用波谱方法(^1H-NMR、^13C-NMR、2D-NMR和FAB-MS等)对这些结构较为复杂的环肽类成分进行了鉴定,结构分别为α-Amanitin、β-Amanitin和Amanin。     

三种鹅膏菌培养条件及所产肽类毒素的比较研究

以外生菌根菌鹅膏菌属三个种Amanita muscaria,A.pseudoporphyria和A.fritillaria为研究材料,以生长速率为评价指标,对其最适生长温度、pH值、光照、培养基、C及N源的利用等基本培养条件及所产肽类毒素进行了比较研究。研究结果表明,三种菌株最适生长温度有差异,A.pseudoporphyria和A.fritillaria的最适温度为28℃,A.muscaria的最适温度为22℃;A.muscaria菌丝体生长的pH值范围为5-7,另外两个菌株的pH值范围为3-6;24h光照、12h光暗交替和24h黑暗对鹅膏菌的生长速率影响不大;SPDM培养基和MMN培养基都适合三种菌株的生长,但对于A.muscaria来说PDM培养基更适合其生长。鹅膏菌能够利用比较广泛的C、N源,但三个种在利用的C、N源种类上有一定的差别。通过抑芽法实验和HPLC分析分别表明三种鹅膏菌所含肽类毒素在种类和含量上有所不同,但都对绿豆发芽有一定的抑制作用。A.pseudoporphyria和A.fritillaria菌丝体中α-amanitin的含量分别为35.56μg/gDCW(drycellweight细胞干重)和26.02μg/gDCW,不含有phalloidin和β-amanitin;A.muscaria菌丝体中没有检测到α-amanitin、β-amanitin和phalloidin。结果表明供试的三种鹅膏菌在基本培养条件及所产肽类毒素方面存在种水平上的差异。     

a-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽的制备和鉴定(英文)

-鹅膏毒(环)肽和二羟鬼笔毒(环)肽是剧毒的鹅膏菌和其它几种致死毒菌中由一些修饰氨基酸组成的环肽毒素。由于-鹅膏毒肽对真核生物的mRNA合成的专一性抑制和和二羟鬼笔毒肽对肌动蛋白的专一性束缚,因而它们在分子生物学和细胞学研究中具有重要应用,对其需求逐步增加。为此,作者使用了一种改良的毒素提取方法,以制备高效液相色谱从灰花纹鹅膏菌中分离制备-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽,并通过紫外吸收光谱和质谱进行鉴定,表明-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽的分离效果好,纯度高。本方法对其它毒菌中的-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽的分离制备具有同样的应用价值。     

a-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽的制备和鉴定

-鹅膏毒(环)肽和二羟鬼笔毒(环)肽是剧毒的鹅膏菌和其它几种致死毒菌中由一些修饰氨基酸组成的环肽毒素。由于-鹅膏毒肽对真核生物的mRNA合成的专一性抑制和和二羟鬼笔毒肽对肌动蛋白的专一性束缚,因而它们在分子生物学和细胞学研究中具有重要应用,对其需求逐步增加。为此,作者使用了一种改良的毒素提取方法,以制备高效液相色谱从灰花纹鹅膏菌中分离制备-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽,并通过紫外吸收光谱和质谱进行鉴定,表明-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽的分离效果好,纯度高。本方法对其它毒菌中的-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽的分离制备具有同样的应用价值。