肌萎缩侧索硬化脊髓器官型培养模型的建立

利用谷氨酸转运体抑制剂苏—羟天冬氨酸(THA)制备选择性运动神经元凋亡的肌萎缩侧索硬化(ALs)脊髓器官型培养模型。取出生后8天乳鼠腰段脊髓组织切成脊髓薄片,在培养液中分别加入不同浓度THA,用SMI—32免疫组化染色对脊髓腹角α运动神经元进行鉴定,calretinin免疫组化染色对背角中间神经元进行鉴定,测定培养液中谷氨酸(Glu)、乳酸脱氢酶(LDH)的含量,并与对照组比较。结果显示对照组α运动神经元数目恒定;THA引起培养液中剂量依赖性Glu、LDH含量增高和SMI—32阳性的α运动神经元数目减少,脊髓背角的中间神经元损伤相对较轻;100μmol／L THA组在体外培养4周后,细胞外Glu含量增高,SMI—32阳性的α运动神经元数目较对照组明显减少,背角的中间神经元数目无显著变化,可以制成ALS脊髓器官型培养模型。     

谷氨酸转运抑制剂对器官型培养脊髓片的影响

观察谷氨酸转运体抑制剂苏-羟天冬氨酸(Threo-hydroxyaspartate,THA)对器官型培养的脊髓片的影响,探讨谷氨酸在运动神经元损伤中的作用。取出生后8天乳鼠的腰段脊髓组织切片做脊髓器官型培养,在培养液中加入不同浓度THA(50μmol/L、100μmol/L、500μmol/L),用神经元的特异性免疫组化染色剂SMI-32,非磷酸化神经丝标记物,对脊髓腹角α运动神经元进行鉴定,用单克隆抗钙网膜蛋白(calretinin)抗体对背角中间神经元进行记数,测定培养液中乳酸脱氨酶(LDH)的含量,并与对照组比较。结果显示对照组α运动神经元数目恒定,THA可以引起剂量依赖性的培养液中LDH含量增高和α运动神经元数目减少,而脊髓背角的中间神经元损伤相对较轻,其中THA100μmol/L组在体外培养4周后出现类似于肌萎缩侧索硬化(ALS)的病理改变:α运动神经元数目较对照组明显减少,而脊髓背角的中间神经元数目无显著变化。细胞外谷氨酸增高主要对运动神经元造成损伤,脊髓运动神经元较感觉神经元对谷氨酸的兴奋毒作用更加敏感。     

谷氨酸转运抑制剂对器官型培养脊髓片的影响

观察谷氨酸转运体抑制剂苏一羟天冬氨酸(Threo-hydroxyaspartate,THA)对器官型培养的脊髓片的影响,探讨谷氨酸在运动神经元损伤中的作用。取出生后8天乳鼠的腰段脊髓组织切片做脊髓器官型培养,在培养液中加入不同浓度THA(50μmol／L、100μmol／L、5001μmol／L),用神经元的特异性免疫组化染色剂SMI-32,非磷酸化神经丝标记物,对脊髓腹角α运动神经元进行鉴定,用单克隆抗钙网膜蛋白(calretinin)抗体对背角中间神经元进行记数,测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量,并与对照组比较。结果显示对照组α运动神经元数目恒定,THA可以引起剂量依赖性的培养液中LDH含量增高和α运动神经元数目减少,而脊髓背角的中间神经元损伤相对较轻,其中THA100μmol／L组在体外培养4周后出现类似于肌萎缩侧索硬化(ALS)的病理改变：α运动神经元数目较对照组明显减少,而脊髓背角的中间神经元数目无显著变化。细胞外谷氨酸增高主要对运动神经元造成损伤,脊髓运动神经元较感觉神经元对谷氨酸的兴奋毒作用更加敏感。     

Ⅱ相酶诱导剂CPDT对运动神经元损伤保护作用的机制初探

利用谷氨酸转运体抑制剂制备选择性运动神经元损伤的脊髓片培养模型,在此基础上探讨Ⅱ相酶诱导剂5,6-二氢环戊烯并1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮(CPDT)对运动神经元的保护作用及机制.乳大鼠脊髓片分为正常对照组、THA模型组(100 μmol/L苏-羟天冬氨酸;THA)和Ⅱ相酶诱导剂CPDT干预组(15和30 μmol/L).通过免疫组化方法对脊髓腹角α运动神经元进行计数,并利用RT-PCR半定量方法,免疫印迹及酶活性检测等方法,分析各组间醌氧化还原酶1(NQO1)和铁蛋白重链的表达.结果表明CPDT(15或30 μmol/L)干预组脊髓腹角的运动神经元数明显增多,与THA模型组相比差异显著(P<0.05,P<0.01),并且经CPDT干预可以有效的诱导NQO1以及铁蛋白重链的表达增加,为下一步在肌萎缩侧索硬化(ALS))动物模型或ALS病人中进行临床干预打下了前期基础.     

脂多糖对脊髓前角运动神经元的损伤作用

研究脂多糖(LPS)诱导的炎症反应对运动神经元的损伤作用及其机制.采用SD乳鼠脊髓器官型培养,分为单纯培养液组和不同浓度LPS组,应用免疫组化、酶活性测定、电镜等技术衡量神经元损伤程度.对LPS组分别给予细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM和NADPH氧化酶抑制剂apocynin,观察运动神经元数量和形态变化.结果显示LPS可以引起剂量和时间依赖性的运动神经元数量减少和培养液中乳酸脱氢酶含量增高,运动神经元超微结构改变明显,中间神经元损伤相对较轻.运动神经元缺乏钙网膜蛋白表达,而BAPTA-AM减轻运动神经元损伤,提示钙离子缓冲能力较低是其较易受损的原因之一.LPS可以引起NADPH氧化酶活性增高,而apocynin对LPS引起的运动神经元丢失有保护作用,说明NADPH氧化酶在炎症介导的运动神经元损伤中发挥着关键作用.     

糖基化终末产物对3T3-L1脂肪细胞脂联素分泌的影响

目的糖基化终末产物(Advanced glycation end products,AGE)对3T3-L1脂肪细胞脂联素(adiponectin,APN)分泌的影响。方法3T3-L1小鼠前脂肪细胞体外培养并诱导分化为成熟的脂肪细胞,以PBS和BSA作为阴性对照,用含不同浓度梯度(50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml)AGE的培养液对成熟的脂肪细胞体外培养48h,收集细胞和上清液,用RT-PCR方法检测脂联素mRNA的表达,ELISA方法检测培养液中脂联素蛋白的分泌情况。结果AGE干预组脂联素的表达在mRNA和蛋白水平较对照组均明显下降(P<0.05),并且随着AGE浓度的升高脂联素的合成和分泌逐渐减少,其中100μg/ml、150μg/ml AGE干预组脂联素的减少较对照组有显著差异(P<0.001)。结论糖基化终末产物能够通过抑制3T3-L1细胞脂联素mRNA的合成,近而抑制脂联素的分泌,且这种抑制呈浓度依赖性。     

器官型培养的脊髓与体内脊髓的对比

旨在观察体外器官型培养的脊髓薄片是否与同龄大鼠体内生长的脊髓具有相似的形态和恒定的前角a运动神经元数目,建立能模拟体内生长环境的稳定的脊髓器官培养模型。利用出生后8天乳鼠的腰段脊髓组织切片建立脊髓器官型培养模型,用神经元的特异性免疫组化染色SMI-32对脊髓前角a运动神经元加以鉴定并与同龄大鼠体内生长的脊髓做比较。结果发现脊髓体外生长良好,形态完整,a运动神经元数目恒定,与同龄大鼠比较无显著差异,并可长期存活达2个月。脊髓的器官培养技术为研究脊髓生理、病理改变及神经保护提供了有效的方法。     

妊娠早期人胎盘绒毛组织中hcG分泌功能的调节

本工作研究了在体外无血清培养条件下,不同类型的激素对妊娠6—8周人绒毛组织hCG分泌功能的影响。绒毛组织被剪成约1mm~3的小块,接种在涂有鼠尾胶原的培养瓶内,每瓶加入2ml McCoy’s 5a培养液,于37℃、5％ CO_2条件下预孵48小时以排除内源激素。更换培养液后加入不同浓     

猫爪草多糖对小鼠腹腔巨噬细胞活力的调节作用

此次研究旨在探讨猫爪草多糖对体外培养的正常状态下的原代小鼠腹腔巨噬细胞活性的调节作用,以及小鼠腹腔巨噬细胞在体外培养条件下的活力变化情况。以原代培养的小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象,设对照组(加入100μL DMEM培养基)和实验组(分别加入25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL, 200μg/mL,400μg/mL的猫爪草多糖),分别采用噻唑蓝(MTT)比色法、CCK-8法、乳酸脱氢酶释放法和中性红吞噬实验检测不同浓度的猫爪草多糖对体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞活力的调节作用;同时设置24 h、36 h、48 h、60 h和72 h的不同培养时间,观察在体外培养条件下,小鼠腹腔巨噬细胞活力的变化情况。结果表明:与对照组相比,不同浓度的猫爪草多糖均能增强小鼠腹腔巨噬细胞的活力,且猫爪草多糖浓度在100~400μg/mL的细胞活力极显著增强(p<0.01)。此外,各处理组的巨噬细胞在体外培养24~72 h不更换培养液的条件下,48 h处活性最佳。体外培养条件下,一定浓度的猫爪草多糖可以激活小鼠腹腔巨噬细胞,通过猫爪草多糖激活巨噬细胞,可能是猫爪草发挥提升机体免疫力的作用机制之一。此外,体外培养的巨噬细胞虽能存活长达一个月,但仍有一个最佳活力时间。     

急性运动轴索型神经病患者血清对培养脊髓运动神经元的影响

为了观察急性运动轴索型神经病(AMAN)病人血清对培养的胚胎大鼠脊髓运动神经元及其轴突的影响,直接、动态观察致病因素对轴突的损害程度。我们分离了胚胎大鼠脊髓腹侧组织,制备成细胞悬液在体外进行原代培养,应用抗非磷酸化神经微丝单克隆抗体SMI-32对培养细胞染色鉴定为运动神经元。培养6天时给予25%浓度AMAN病人血清进行干预,血清中检测有致病型空肠弯曲菌(Cj)PennerO:19型脂多糖抗体存在,正常人血清作为对照组。观察神经元胞体和突起的变化,并经Guillery Shirra及Webster法进行变性纤维染色。结果表明AMAN病人血清干预9h可引起培养运动神经元的轴突变性,嗜银性增加并染为棕黑色;干预12h,胞体开始肿胀,核偏移,胞浆内有银颗粒的沉积,最终培养神经元在16h开始死亡。对照组神经元生长无变化。我们认为AMAN病人血清中含有致病成分,可引起运动神经元轴突变性和继发性胞体改变,最终神经元死亡。推测这种损害在无补体和巨噬细胞参与下,抗PennerO:19型Cj脂多糖抗体起着重要作用。     

急性运动轴索型神经病患者血清对培养脊髓运动神经元的影响

为了观察急性运动轴索型神经病(AMAN)病人血清对培养的胚胎大鼠脊髓运动神经元及其轴突的影响,直接、动态观察致病因素对轴突的损害程度。我们分离了胚胎大鼠脊髓腹侧组织,制备成细胞悬液在体外进行原代培养,应用抗非磷酸化神经微丝单克隆抗体SMI-32对培养细胞染色鉴定为运动神经元。培养6天时给予25％浓度AMAN病人血清进行干预,血清中检测有致病型空肠弯曲菌(Cj)PennerO：19型脂多糖抗体存在,正常人血清作为对照组。观察神经元胞体和突起的变化,并经Guillery Shirra及Webster法进行变性纤维染色。结果表明AMAN病人血清干预9h可引起培养运动神经元的轴突变性,嗜银性增加并染为棕黑色;干预12h,胞体开始肿胀,核偏移,胞浆内有银颗粒的沉积,最终培养神经元在16h开始死亡。对照组神经元生长无变化。我们认为AMAN病人血清中含有致病成分,可引起运动神经元轴突变性和继发性胞体改变,最终神经元死亡。推测这种损害在无补体和巨噬细胞参与下,抗PennerO：19型Cj脂多糖抗体起着重要作用。     

山羊体外受精的研究

通过在山羊卵母细胞体外成熟培养液中添加不同的血清和不同浓度的卵泡液 ,在体外成熟培养液中培养不同的时间 ,以及采用不同的精子获能方法来摸索效率较高的体外受精方法体系。在山羊卵母细胞体外成熟培养液中添加FCS、EGS及不同浓度的卵泡液 ,成熟培养时间分别为 16、2 0、2 4和 2 7h ,山羊新鲜精液用钙离子载体法和肝素法进行获能处理后用于体外受精 ,比较其体外成熟率和体外受精率。添加FCS、EGS和 2 0 %卵泡液组的成熟率无显著差异 ,显著高于添加 10 %和 3 0 %卵泡液组的成熟率 ;但添加FCS和EGS组的受精率显著高于添加10 %、2 0 %、3 0 %卵泡液组的受精率。培养 2 4h组和 2 7h组的成熟率显著高于另外两组 ,而培养 2 7h组的受精率显著高于其余各组。用钙离子载体法处理的山羊精子的顶体反应率和体外受精率显著高于肝素法。EGS可以代替FCS添加于成熟培养液中 ,对COCs的成熟率和受精率没有明显的影响 ,但卵泡液不能完全代替FCS的作用。培养时间为 2 7h ,精子用钙离子载体法处理获能后能得到较高的体外受精率     

产紫青霉中β-葡萄糖醛酸苷酶的诱导表达

针对产紫青霉(Penicillium purpurogenum)Li-3发酵生产β-葡萄糖醛酸苷酶存在的碳代谢阻遏现象,研究β-葡萄糖醛酸苷酶的高效诱导表达策略。在发酵条件优化的基础上,建立了新的产酶诱导工艺:葡萄糖的初始质量浓度5 g/L,在葡萄糖耗尽时加入20%诱导剂(10 g/L GL+1.2%Tween80)进行诱导,每24 h添加1次诱导剂,诱导72 h后立即转到40℃摇床发酵48 h。采用该工艺进行发酵,菌体出现了"二次生长"现象,比酶活从647.99 U/mL提高至2 356 U/mL,提高了近3倍。     

地塞米松对大鼠坐骨神经损伤后运动神经元的恢复作用

本实验使用120只Wistar系大鼠,采用定位、定量、定时的方法压挫坐骨神经后。给予治疗剂量的地塞米松,动态观察脊髓腰段伤侧前角运动神经元的SDH、AChE和ACP的酶组织化学及细胞超微结构的变化。结果提示,地塞米松对受伤害神经元具有稳定细胞酶活性和细胞超微结构的作用,可以减轻继发性损害,对神经元的恢复有积极作用。     

脑微血管内皮细胞条件培养液对星形胶质细胞活性的影响

目的:观察脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞的相互关系,探讨血脑屏障维持脑内环境稳定的生理学基础.方法:原代培养大鼠脑皮质微血管内皮细胞,传至三代,收集在指数生长期细胞生长48 h后的务件培养液;将条件培养液分别按20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%不同浓度作用于星形胶质细胞,MTT法检测不同浓度内皮细胞条件培养液作用于星形胶质细胞24 h、48h后的活性变化.结果:48h时间点的各浓度内皮细胞条件液组与相应的正常对照组相比差异均有显著统计学意义(P<0.01),内皮细胞条件液对星形胶质细胞表现出显著的抑制效应,而24 h的70%、80%、90%、100%浓度组与相应正常对照组相比也有显著统计学意叉的差异(P<0.01),且有浓度依赖性.结论:正常脑微血管内皮细胞条件培养液抑制了正常星形胶质细胞的活性.     

缺血预处理大鼠脊髓匀浆培养液增强骨髓基质细胞存活、增殖和迁移能力

目的探讨缺血预处理大鼠脊髓匀浆培养液对骨髓基质细胞(bone narrow stromal cells,BMSCs)存活、增殖和迁移能力的影响。方法体外分离培养BMSCs,予以传代。正常脊髓匀浆培养液组(Normal组):将BMSCs置于正常大鼠脊髓匀浆培养液中培养;缺血再灌注损伤脊髓匀浆培养液组(IR组):将BMSCs置于缺血再灌注损伤大鼠脊髓匀浆培养液中培养;缺血预处理脊髓匀浆培养液组(IPC组):将BMSCs置于缺血预处理后缺血再灌注损伤脊髓匀浆培养液中培养。流式细胞仪检测各组BMSCs凋亡率,MTT法检测BMSCs增殖,Transwell小室检测BMSCs迁移能力。结果与Normal组比较,IR组的BMSCs凋亡率增高,增殖能力下降,迁移能力下降;与IR组比较,IPC组的BMSCs凋亡率降低,增殖能力和迁移能力增强。结论缺血预处理大鼠脊髓匀浆培养液增强骨髓基质细胞存活、增殖和迁移能力。     

蛋白质合成抑制剂亚胺环已酮（CHX）对猪卵母细胞体外成熟的影响

研究了蛋白质合成抑制剂亚胺环已酮（CHX）对猪卵母细胞体外成熟过程中的GVBD、染色质凝集、MⅡ期成熟及卵丘细胞扩展的作用。结果表明：（1）培养液中添加CHX,可抑制卵母细胞GVBD的发生,而且此作用是浓度依赖性的,但CHX的抑效果是完全可逆的;（2）在含10μg/mlCHX液中分别培养0、6、12和24h后转入正常培养液再继续培养至48h,卵母细胞成熟率分别为84．1％、77．1％、48．9％和27．8％;（3）正常培养液中培养0、6、12、24、36和48h后,再转入浓度为10μg/mlCHX液中继续培养至48h,卵母细胞成熟率分别为0、0、0、31．3％、65．4％和79．5％;（4）CHX对卵丘细胞扩展的影响培养时间延长而增强,在CHX中处理时间为16h或更长,完全抑制卵丘细胞的扩展。     

改构型酸性成纤维细胞生长因子对顺铂肾损害保护作用的实验研究

目的 研究改构型酸性成纤维细胞生长因子(MaFGF)对顺铂(DDP)引起的体外培养的肾小管上皮细胞损害的保护作用。方法 将原代培养的肾小管上皮细胞接种于96孔培养板：(1)培养72h后加入一系列浓度的DDP,实验组在DDP作用12h后加入不同浓度MaFGF,再培养36h后用WST-8法检测细胞存活率。（2）以DDP建立损伤模型,并在加药后12小时加入一定量的MaFGF,观察MaFGF对肾小管上皮细胞的保护作用。结果 (1) MaFGF能使DDP对肾小管上皮细胞的半数抑制浓度（IC50）升高。（2）DDP组与对照组比较,各生化和酶学指标差异均有统计学意义;而MaFGF + DDP组与对照组比较,SOD、GSH-Px酶活性差异无统计学意义,MDA、NO升高差异仍有统计学意义。结论 MaFGF对DDP损伤的肾小管上皮细胞有明显的保护作用。     

塔里木马鹿腔前卵泡分离方法比较

以分离获得的腔前卵泡数量、正常卵泡率和72h体外培养存活率为指标,比较了酶消化法、梳刮法和剪碎法3种不同方法分离塔里木马鹿Cervus elaphus yarkandensis腔前卵泡的效果。结果表明:在卵巢数目相同的情况下,以酶消化法平均获得的腔前卵泡数最多,梳刮法次之,剪碎法最少,3种不同分离方法获得腔前卵泡数量之间存在极显著差异(P<0.01);梳刮法和剪碎法分离获得的腔前卵泡正常率均极显著高于酶消化法(P<0.01);梳刮法和剪碎法分离获得的腔前卵泡在体外培养24h、48h和72h后的存活率极显著和显著高于酶消化法(培养24h、48h后,P<0.01;培养72h后,P<0.05)。由此可见,梳刮法是塔里木马鹿腔前卵泡更有效的分离方法。     

家蝇卵巢在体外培育中摄取卵黄蛋白

本文报道家蝇Musca domestica卵巢在体外培养条件下,摄取异硫氰萤光素标记的家蝇卵黄蛋白的特点。用Grace's培养液标记蛋白浓度为2mg/m1,在27℃条件下培养2小时,卵巢摄取量依赖于培养液中卵黄蛋白浓度和温度,摄取高峰在羽化后48小时,正值卵母细胞发育阶段进入6-8时期。培养液中加入JHIII,能促进摄取,JHIIl的浓度和摄取量无明显相关性。乌本苷、牛血清蛋白和叠氮钠显著抑制卵巢的摄取活动。