花鲫早期体色发育和几个体色相关基因在不同鲫的表达分析

红白花鲫胚胎发育期先观察到黑色素细胞的发生,孵化出膜后先后出现黄色素细胞、红色素细胞及虹彩细胞。1月龄花鲫幼苗体色呈浅青灰色,2月龄前后,花鲫皮肤黑色素细胞逐渐减少,体色发生“青转花”的变化,3月龄时基本形成红白镶嵌的成体体色。克隆获得了鲫Slc7a11和Pnp4a体色基因的全长cDNA。鲫Slc7a11全长1782bp,编码496个氨基酸,与斑马鱼Slc7a11基因氨基酸同源性达93.7%;鲫Pnp4a全长1535bp,编码291氨基酸,与斑马鱼Pnp4a基因氨基酸同源性达95.1%。RT-PCR检测了Mitfa、Tyr、Slc7a11和Pnp4a在白鲫、红鲫、花鲫三种不同体色鲫胚胎及成体组织中的表达,分析结果显示:花鲫和红鲫一样有一个黑色素消退过程,鲫Slc7a11和Pnp4a体色基因与斑马鱼Slc7a11和Pnp4a具有高度同源性,花鲫成体皮肤组织也和红鲫成体皮肤组织一样检测到了Mitfa和Tyr的表达。Pnp4a在不同鲫的不同体色发育时期和不同组织都有表达,Slc7a11在不同鲫的不同体色发育时期均有表达,但在不同鲫的成体皮肤组织中均未表达。     

不同倍性鱼肌间骨的比较分析

采用常规测量法和解剖法对野生鲫(Carassius auratus,2n=100)、彭泽鲫(Carassius auratus variety pengze,3n=162)、改良三倍体鲫鱼(Triploid crucian carp,即湘云鲫2号,3n=150)及其亲本改良二倍体红鲫(Carassius auratus red var,改良红鲫,♀,2n=100)和改良异源四倍体鲫鲤(Allotetreploid hybrid,四倍体鲫鲤,♂,4n=200)5种不同倍性鱼肌间骨的数目、形态和分布进行研究.结果显示,野生鲫肌间骨数目在78~83之间,平均值为81根,彭泽鲫肌间骨数目在80~86之间,平均值为84,四倍体鲫鲤肌间骨数目在77~84之间,平均值为82,但是湘云鲫2号和改良红鲫的肌间骨数目比较少,湘云鲫2号在77~82之间,平均值为79,改良红鲫在58~77之间,平均值为71.考虑到不同倍性的鱼体大小和肌节数目的不同,进一步统计了每一肌节的平均肌间骨数目,野生鲫最多(0.721),彭泽鲫次之(0.673),改良红鲫最少(0.608),湘云鲫2号次之(0.633),四倍体鲫鲤位于中间(0.653),除了两组湘云鲫2号与四倍体鲫鲤、四倍体鲫鲤和彭泽鲫外,两两间都存在显著差异.5种鱼的各种肌间骨有"I"形、"卜"形、"Y"形、一端多叉形、两端两分叉形、两端多叉形和树枝形7种类型.肌间小骨越靠前端,形态越复杂.每条鱼左右两侧的肌间骨数目不完全相等,但总体上两侧肌间骨的数目接近.在保持鱼的营养、形态和活动等基本生理功能的前提下,湘云鲫2号的肌间刺数目比野生鲫和彭泽鲫都少,所以它的食用价值较高.本研究结果说明,改良二倍体红鲫和改良三倍体鲫鱼等人工培育的杂交鱼比野生鲫的肌间刺少,为鱼类骨骼发育生物学和鱼类遗传育种提供了形态学基础.     

四倍体异育银鲫新品种长丰鲫肌肉品质和营养成分分析

研究对长丰鲫、彭泽鲫、异育银鲫D系以及红鲫的肌肉品质和营养成分进行了对比分析。结果显示:肌纤维密度方面, 单位面积肌纤维密度长丰鲫最高[(184.2624.11) fiber/mm2], 其次为彭泽鲫[(149.7212.51)fiber/mm2]、异育银鲫D系[(134.4515.96) fiber/mm2]和红鲫[(119.8522.86) fiber/mm2]。粗蛋白含量、总氨基酸和呈味氨基酸方面, 长丰鲫、彭泽鲫和异育银鲫D系无明显区别。高度不饱和脂肪酸中(n3), 长丰鲫含量最高(24.2%), 依次为彭泽鲫(14.4%), 异育银鲫(11.3%)和红鲫(8.3%)。在高度不饱和脂肪酸中, 二十二碳六烯酸(DHA)长丰鲫含量最高(10.3%), 依次为红鲫(4.9%)、彭泽鲫(4.5%)和银鲫(2.9%); 花生四烯酸(AA)长丰鲫含量最高(8.3%), 依次为彭泽鲫(5.1%)、银鲫(3.8%)和红鲫(0.6%)。结果表明, 长丰鲫新品种在所检测的肌肉品质和营养成分指标方面, 优于彭泽鲫、异育银鲫D系和红鲫。     

三个鲫品系DNA含量的比较研究

采用流式细胞术 (FCM)对红鲫、彭泽鲫、异育银鲫进行红血球DNA含量的检测分析比较 ,以鉴定它们的倍性。结果显示 ,红鲫红血球的DNA含量是 3 0pg ,彭泽鲫是 4 7pg ,异育银鲫是 4 8pg。显而易见 ,彭泽鲫的DNA含量是二倍体红鲫的 1 57倍 ,异育银鲫的DNA含量是红鲫的 1 6倍。采用肾细胞直接制作染色体的方法进行红鲫、彭泽鲫、异育银鲫的染色体倍性鉴定 ,结果红鲫的染色体数目是 10 0 ,为二倍体 (2n =10 0 ) ,彭泽鲫的染色体数目是 162 ,为三倍体 (3n =162 ) ,异育银鲫的染色体数目是 156— 162 ,为三倍体 (3n =156— 162 )。研究证明 :不同品系鲫的DNA含量高低与染色体的倍性有显著的正相关性     

红鲫近交系的建立

目的应用人工雌核发育繁殖技术建立红鲫近交系.方法红鲫卵子被经紫外线照射的鲤鱼精子激活后,在0～4℃的温度下进行冷休克处理30min,再在常温下静水孵化;以红体色为遗传标记,在连续2代雌核发育子代中选择二倍体红鲫,放置水泥池中常规饲养;用同样的人工雌核发育繁殖技术进行保种,随机交配繁殖1～2代供应实验;用常规方法测量形态学指标.结果红鲫卵子激活率在91%以上;实验组2中摄食期仔鱼成活率为15.20%,80%的成鱼为二倍体红鲫,其中有较高比例的遗传上真实的雄性个体.鳞式主要为27(5)/(6)28;鳍式主要为D.i,17～18;A.i,6;V.i,7～8;P.i,15～16;C.24～25;其他外部形态指标与封闭群红鲫近似.结论本实验建立的人工雌核发育繁殖技术,设备要求简单,操作安全可靠,并且省时节资,完全能够用于培育鱼类近交系,本实验结果完全可以满足育种繁殖的要求;所获得的二倍体红鲫,经同工酶电泳等检测,被证实是纯合的,具备鱼类近交系品系特征;出现遗传上真实的雄性个体是正常的.     

红鲫实验动物含肉率及营养成分分析

目的探讨红鲫实验动物的营养需要、科学配制红鲫饲料。方法用常规方法测定红鲫幼鱼、红鲫成鱼的含肉率及肌肉营养成分。结果红鲫幼鱼、红鲫成鱼的含肉率为46．34％、42．35％;红鲫幼鱼、红鲫成鱼肌肉（鲜样）中分别含水分79．11％、78．49％,粗蛋白质12．47％、14．72％,粗脂肪6．95％、4．37％,粗灰分1．01％、1．41％,无氮浸出物0．47％、1．07％,能量5．65kJ／g、5．24kJ／g,其E／P值（能量蛋白比）为45．32kJ／g、35．69kJ／g。结论红鲫幼鱼、红鲫成鱼含肉率、肌肉营养成分有一定差异。     

银鲫apelin基因的克隆、组织表达谱和摄食关系的初步研究

apelin是一种参与哺乳动物和鱼类摄食调控的重要神经肽。为了更好地研究apelin在银鲫(Carassius auratus gibelio)上的摄食调控作用,本试验采用RACE技术首次获得了银鲫apelin的cDNA全长序列,并通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测了apelin基因在各组织的表达情况以及餐前餐后和禁食对其表达量的影响。结果显示银鲫apelin全长cDNA序列长度为1082 bp,其中5’非编码区(5’-UTR)的长度为114 bp,3’非编码区(3’-UTR)的长度为734 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)的长度为234 bp。银鲫apelin基因的ORF区编码77个氨基酸,前22个氨基酸为信号肽。apelin基因在银鲫21个组织中普遍表达,特别是在下丘脑中表达量最高。在餐前餐后的试验中,银鲫下丘脑apelin基因在餐后表达量显著下降(p<0.05);在禁食试验中,禁食组下丘脑apelin基因的表达量在第5天显著升高(p<0.05),第7天极显著升高(p<0.01),复投喂后,apelin基因的表达量在第9天、第11天、第14天极显著降低(p<0.01)。综上所述,apelin基因可能是银鲫的诱食因子,在其摄食调控起到一定的作用。     

异源四倍体鲫鲤及其原始亲本遗传变异的微卫星标记分析

采用从鲤中分离出来的32对微卫星DNA标记,对异源四倍体鲫鲤、红鲫和野鲤的基因组DNA进行了研究。在筛选出的15对微卫星引物中,随引物不同,各等位基因数为1～8个,大小在100～420bp之间。从3个不同群体内部的遗传相似系数来看,异源四倍体鲫鲤个体之间的遗传相似系数最大,说明异源四倍体鲫鲤群体内部的遗传变异程度最低,已经形成了一个遗传性状稳定的群体。从3个不同群体之间的遗传相似系数来看,异源四倍体鲫鲤和红鲫遗传相似系数为0．5625,和野鲤的遗传相似系数为0．5125,说明异源四倍体鲫鲤接受原始母本的遗传物质比原始父本野鲤要多一些。微卫星标记与以前报道的RAPD标记的检测结果是相似的,然而由微卫星标记获得的种群内和种群间的遗传距离均大于RAPD,说明微卫星标记比RAPD标记显示出更高的个体多态性。     

从ATPase8-6基因研究杂交多倍体鱼线粒体母性遗传

异源四倍体鲫鲤是世界上首例人工培育的两性可育并形成群体的且能自然繁殖的四倍体鱼。本文采用质粒克隆测序法测定了红鲫、异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和三倍体湘云鲤的ATPase8和ATPase6基因全序列 ,结合鲤鱼、日本白鲫和斑马鱼的同源序列 ,对不同倍性水平鲤科鱼类的ATPase8和ATPase6基因进行了比较 ,分析了碱基组成、变异情况以及核苷酸和氨基酸序列差异。红鲫、鲤鱼、异源四倍体鲫鲤、日本白鲫、三倍体湘云鲫和三倍体湘云鲤之间的序列差异为 0 0 % - 1 3 4 % ,它们与外群斑马鱼之间的序列差异为 2 7 9% -31 0 %。用MEGA软件中的MP法、ME法、NJ法和UPGMA法构建分子系统树 ,得到了相似的拓扑结构。结果分析表明 ,人工杂交多倍体异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和三倍体湘云鲤在线粒体ATPase8和ATPase6基因上具有严格的母性遗传特征。值得注意的是 ,异源四倍体鲫鲤经过 1 1代的繁育后 ,与其原始母本红鲫仍然保持了非常高的同源性 ,说明了新的异源四倍体基因库在线粒体ATPase8和ATPase6基因上拥有稳定的遗传特性。对不同倍性鲤科鱼类线粒体ATPase8和ATPase6基因的研究表明 ,ATPase8和ATPase6基因是杂交鱼后代遗传变异研究的一个很好的分子标记     

四个鲫鱼品系线粒体DNA的限制性酶切分析

用差速离心和核酸酶消化法从红鲫 (C auratusredvar .)、湘鲫 [F1hybridsofredcruciancarp (♀ )×commoncarp (♂ ) ]、野鲫 (C auratusauratus)和白鲫 (C auratuscuvieri)的肝组织及白鲫的卵巢中提取和纯化线粒体DNA。用 9种内切酶 (EcoRⅠ、HindⅢ、PstⅠ、BglⅡ、BamHⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ、SalⅠ和KpnⅠ )进行单酶酶解 ,经琼脂糖凝胶电泳分析 ,检测出PstⅠ、KpnⅠ和BglⅡ 3种酶在品系间存在限制性片段长度多态性 ,但并未检测出品系内的限制性片段长度多态性。计算出红鲫、湘鲫、白鲫和野鲫的mtDNA大小分别约为 16 19、 16 0 2、 16 6 0和 16 0 6kb。根据限制性酶切片段共享度 ,计算出 4个品系间的遗传距离 ,结果表明存在直接亲缘关系的红鲫与湘鲫之间的遗传差异最小 ,证实了红鲫与子代湘鲫之间mtDNA遵循母系遗传的特性。     

银鲫复合种外源遗传物质整入的RAPD分析

在优化ＲＡＤＰＤ检测条件的基础上,采用４０对随机引物,比较分析了银复合物,异育银鲫和兴国红鲤相互间扩增ＤＮＡ片段的异同性。总的来说,银鲫复合种和异育银鲫具有基本一致的扩增产物,而与兴国红鲤的扩增产物多数不同,相似率分析表明,银鲫复合种与兴国红鲤之间的相似率为３１．６％,异育银鲫与兴国红鲤之间的相似率为２８．６％。在分析中,除发现银鲫复合种,异育银鲫与兴国红鲤间共有扩增片段外,还发现了银鲫复合种与兴     

不同倍性鲫鲤鱼Dmc1基因cDNA的克隆 及其表达分析

酵母菌 Dmc1(disrupted meiotic cDNA)基因是一个在减数分裂前期Ⅰ表达的特异基因, 其产物是减数分裂同源染色体配对所必需的. 根据酵母菌、小鼠以及人的DMC1中保守氨基酸序列合成简并引物, 分别克隆了二倍体红鲫(Carassius auratus red var.)、湘江野鲤(Cyprinus carpio L.)、日本白鲫(Carassius cuvieri)、三倍体湘云鲫和异源四倍体鲫鲤Dmc1基因部分cDNA序列. 通过cDNA末端快速分离法(RACE)进一步获得了以上5种鱼Dmc1的cDNA全长, 其中红鲫Dmc1、湘江野鲤Dmc1和日本白鲫Dmc1全长均为1375 bp, 三倍体湘云鲫Dmc1全长1383 bp, 异源四倍体鲫鲤Dmc1全长1379 bp, 这5种鱼各自都编码342个氨基酸. 结果表明, 红鲫、湘江野鲤和日本白鲫的DMC1蛋白的氨基酸同源性高达97.3%, 说明DMC1蛋白在这3种鱼里具有高度保守性; 而三者与已知序列的人、小鼠和斑马鱼(Danio rerio)DMC1蛋白的氨基酸同源性分别为 86%, 86%和95%. 以分离得到的不同倍性鱼Dmc1基因编码区中完全相同的序列设计特异引物进行表达分析. RT-PCR结果表明, Dmc1只在性腺中表达, 在其他组织中不表达; 通过实时荧光定量PCR(real-time PCR), 对Dmc1基因在繁殖季节的二倍体红鲫, 三倍体湘云鲫, 四倍体鲫鲤性腺中的表达进行分析, 发现Dmc1在不同倍性鱼的性腺表达有差异, 在卵巢和精巢均表现为: 三倍体表达最高, 二倍体次之, 四倍体的表达最弱, 特别是在三倍体卵巢的表达远高于在二倍体和四倍体的表达. 同时, 对这3种鱼的性腺进行组织切片分析, 发现二倍体和四倍体鱼的性腺发育良好, 且四倍体成熟度高于二倍体, 而三倍体鱼性腺发育缓慢未达到性成熟, 特别是卵巢的发育相当不好. 由此可见, 在不同倍性鲫鲤鱼中Dmc1基因也是减数分裂特异的基因, 其表达与倍性无显著的相关性, 而与性成熟相关; 并且在三倍体卵巢中的过量表达可能与其减数分裂异常及其不育有关.     

不同倍性鲫鲤鱼Dmc1基因cDNA的克隆 及其表达分析

酵母菌 Dmc1(disrupted meiotic cDNA)基因是一个在减数分裂前期Ⅰ表达的特异基因, 其产物是减数分裂同源染色体配对所必需的. 根据酵母菌、小鼠以及人的DMC1中保守氨基酸序列合成简并引物, 分别克隆了二倍体红鲫(Carassius auratus red var.)、湘江野鲤(Cyprinus carpio L.)、日本白鲫(Carassius cuvieri)、三倍体湘云鲫和异源四倍体鲫鲤Dmc1基因部分cDNA序列. 通过cDNA末端快速分离法(RACE)进一步获得了以上5种鱼Dmc1的cDNA全长, 其中红鲫Dmc1、湘江野鲤Dmc1和日本白鲫Dmc1全长均为1375 bp, 三倍体湘云鲫Dmc1全长1383 bp, 异源四倍体鲫鲤Dmc1全长1379 bp, 这5种鱼各自都编码342个氨基酸. 结果表明, 红鲫、湘江野鲤和日本白鲫的DMC1蛋白的氨基酸同源性高达97.3%, 说明DMC1蛋白在这3种鱼里具有高度保守性; 而三者与已知序列的人、小鼠和斑马鱼(Danio rerio)DMC1蛋白的氨基酸同源性分别为 86%, 86%和95%. 以分离得到的不同倍性鱼Dmc1基因编码区中完全相同的序列设计特异引物进行表达分析. RT-PCR结果表明, Dmc1只在性腺中表达, 在其他组织中不表达; 通过实时荧光定量PCR(real-time PCR), 对Dmc1基因在繁殖季节的二倍体红鲫, 三倍体湘云鲫, 四倍体鲫鲤性腺中的表达进行分析, 发现Dmc1在不同倍性鱼的性腺表达有差异, 在卵巢和精巢均表现为: 三倍体表达最高, 二倍体次之, 四倍体的表达最弱, 特别是在三倍体卵巢的表达远高于在二倍体和四倍体的表达. 同时, 对这3种鱼的性腺进行组织切片分析, 发现二倍体和四倍体鱼的性腺发育良好, 且四倍体成熟度高于二倍体, 而三倍体鱼性腺发育缓慢未达到性成熟, 特别是卵巢的发育相当不好. 由此可见, 在不同倍性鲫鲤鱼中Dmc1基因也是减数分裂特异的基因, 其表达与倍性无显著的相关性, 而与性成熟相关; 并且在三倍体卵巢中的过量表达可能与其减数分裂异常及其不育有关.     

利用PCR-RFLP技术对鲫鱼6个不同品系的鉴定

采用PCR-RFLP方法分析鲫鱼不同品系mtDNA ND3/ND4L/ND4基因片段,对野鲫、异育银鲫、红鲫、白鲫、彩鲫及金鱼的基因片段进行测序,测序结果用RESearch-version1.0软件对限制性内切酶特异性位点进行分析,最终选择MvaⅠ核酸限制性内切酶对目的基因片段进行酶切,同时引入鲤鱼作为外类群,构建了系统树.酶切结果分析表明,基于聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性分析能快速而准确地区分鲫鱼的4个不同品系,首次提出异育银鲫和浙江地区野鲫(河鲫鱼)在mtDNAND3/ND4L/ND4基因上的分子鉴定法,为物种鉴定提供了一定的理论研究基础.但野鲫、金鱼、彩鲫的基因序列两两只有一个碱基的差异,相似度接近100％,用酶切软件(RESearch-version1.0)进行分析后未能找到区别三者的限制性内切酶位点,这一结果也验证了关于金鱼、彩鲫起源于野鲫的观点.     

稀有鮈鲫作为鱼类幼体生长试验受试鱼种的适用性研究

目的通过验证稀有鮈鲫作是否适用于幼体生长试验,为相关化学品测试国家标准的制定提供依据。方法以重铬酸钾和3,4-二氯苯胺为参比物质,按照《OECD化学品测试准则No.215鱼类幼体生长试验》,分别开展三次实验室内稀有鮈鲫幼体生长试验以评价试验结果的重复性,进行实验室间比对试验以评价试验结果的再现性。结果实验室内重复试验中,重铬酸钾和3,4-二氯苯胺对稀有鮈鲫生长抑制效应(EC_(20))平均值分别为30.9 mg/L和163μg/L,变异系数均小于15%;实验室间比对试验中,虽然变异系数增大,但是各实验室的28 d EC_(20)均在【math14】±2s范围之内。结论稀有鮈鲫幼体生长试验结果具有良好的重复性和再现性,且稀有鮈鲫对3,4-二氯苯胺的敏感性与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)相当,因此稀有鮈鲫可作为鱼类幼体生长试验的本土受试鱼种。     

红鲫C1HD近交系RAPD标记的建立

目的建立红鲫C1HD近交系的RAPD标记。方法从80条随机引物中筛选出20条扩增效果和多态性较好的引物,对8尾红鲫C1HD近交系和8尾普通红鲫基因组DNA进行RAPD扩增。结果S333引物扩增出一条特异性条带,大小约为2.1 kb。结论S333引物扩增出的特异性条带可以作为区分普通红鲫与红鲫C1HD近交系的分子遗传标记。     

复合四倍体异育银鲫个体间遗传异质性的研究

用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳,分析比较了４个不同的银鲫雌核发育系,红鲤和复合四倍体异育银鲫鳍的５种不同的同工酶及蛋白表型的差异,表明复合四倍体异育银鲫表型上的差异主要是来自银鲫种内的遗传差异（不同的雌核发育系）。来源于同一个银鲫雌核发育系的复合四倍体异育银鲫,个体间的ＥＳＴ同工酶出现差异,并与父体红鲤的ＥＳＴ同工酶的多态性相关,因此,复合四倍体异育银鲫个体间的异质性也包含了来自父本的遗传影响。在所检测     

雌核发育银鲫和两性融合发育鱼（红鲫和彩鲫）卵壳结构及其组成的比较研究

作者以两性融合发育鱼（红鲫、彩鲫）为对照,对雌核发育银鲫卵壳的表面结构及其可溶性蛋白的组成进行了研究：（１）雌核发育银鲫卵壳表面比较平滑,没有明显的嵴和沟;（２）雌核发育银鲫卵壳可溶性蛋白的含量略高于两性融合发育鱼（红鲫、彩鲫）,并且在ＩＩ区段存在一条分子量为１０万Ｄａｌｔｏｎ的特异蛋白区带。并对银鲫卵壳结构及组成的特殊性与银鲫卵初级控制作用间的关系进行了初步探讨。     

谷物氨基酸值回归估计初探

谷物粗蛋白(CP)含量与其氨基酸(AA)含量问存在极显著相关关系,通过回归统计确立CP与AA值间的一元回归方程,将欲测样品的CP值代入方程中即可估算出相应的AA值。本文是笔者利用河北省的三种谷物材料进行的一次偿试,结果证明,根据粗蛋白含量估算谷物氨基酸值是可行的,采用此法估算AA值快速、准确而经济。     

稀有鮈鲫及其饲料的生化组成研究

研究了稀有的鮈鲫鱼肌、性腺的生化组成,肌肉中水分含量为79.12-79.65％,蛋白质为68.39-70.20％,脂肪为20.11-20.65％,灰分为15.88-16.04％,能值为19.91-20.84Kj/gdm。鱼肌中含17种氨基酸,必需氨基酸占19.45-20.13％,极性氨基酸占17.23-17.45％,非极性氨基酸占17.51-18.16％,鱼肌中Ca、Na、P、Mg、Zn、Fe含量均较高,此外还测定了稀有的鮈鲫的活饵-水蚯蚓及人工饲料的生化组成。