蒙古冰草MwMYB4基因功能鉴定

MwMYB4基因是从蒙古冰草中克隆得到的MYB类转录因子家族成员之一。该研究以转MwMYB4基因的拟南芥后代为材料,通过在干旱和低温胁迫下对转基因植株进行表型分析、理化指标测试和分子鉴定,分析并验证MwMYB4基因的功能。结果显示:(1)蒙古冰草MwMYB4基因已成功整合到转基因拟南芥T_1代的基因组中并实现转录水平的表达。(2)转基因拟南芥T_2代植株在干旱胁迫条件下,转基因植株叶片枯黄程度较轻,相对电导率较野生型变化幅度低,脯氨酸含量明显高于野生型对照,且MwMYB4基因的表达量随干旱胁迫时间延长而增加。(3)在低温胁迫条件下,转基因拟南芥叶片的枯白程度明显低于野生型,且MwMYB4基因的表达量随低温胁迫时间增加而增加。研究表明,过量表达蒙古冰草MwMYB4基因能够提高转基因拟南芥对干旱和低温的耐受性,该基因可能在干旱胁迫和低温胁迫调控机制中发挥调控作用,可作为改良农作物和其他牧草抗旱、抗寒性的重要候选基因。     

转ZjAPX基因拟南芥对NaCl、干旱胁迫的耐性研究

旨在探讨枣树抗坏血酸过氧化物酶基因ZjAPX在植物渗透胁迫中的作用。将ZjAPX基因转入到模式植物拟南芥,以野生型(WT)、转ZjAPX拟南芥株系T2为试材,进行不同浓度NaCl胁迫和干旱胁迫。结果表明,转基因株系的种子萌发、植株生长均优于野生型株系;荧光定量PCR检测转基因拟南芥植株在干旱和盐胁迫处理10 d后目的基因ZjAPX的表达量显著高于野生拟南芥,表明ZjAPX的高表达明显提高了植株的抗旱和耐盐性。     

沙柳SpsLAS基因超表达对拟南芥营养生长的影响

用沙柳SpsLAS基因构建35S∷SpsLAS超表达载体并转化野生型拟南芥,对转基因拟南芥进行表型观察,利用荧光定量PCR,对分枝、生长素及细胞分裂素相关基因进行表达分析。结果显示:(1)成功构建35S∷SpsLAS超表达载体,并获得9株纯合转基因株系,且转基因株系的萌芽速率快于野生型(对照),生活周期也较长;其中7个株系表现为生长迅速、株高增加、莲座叶叶片增大、分枝增加,2个株系表现为矮化、分枝增加、育性降低等一系列变化。(2)荧光定量PCR显示,与对照相比24h时转基因株系幼苗生长素及细胞分裂素途径关键基因无明显变化,4d时各基因在各转基因株系呈上调趋势;30d时分枝相关基因RAX1、RAX3表达量均上调,而MAX1、MAX3、REV、AXR1无明显变化。研究表明,SpsLAS基因过表达对拟南芥株型、莲座叶有明显影响,该研究结果为进一步研究该基因对分枝调控机制奠定了基础。     

拟南芥黑芥子酶TGG1对抗旱性的作用

为阐明拟南芥中黑芥子酶TGG1对抗旱性的影响,构建了35S启动子驱动的TGG1过表达载体,并将其转入拟南芥获得了转基因植株。以野生型和过量表达TGG1的转基因植株为材料,进行干旱胁迫实验,结果显示,在甘露醇模拟的干旱胁迫下35S∶TGG1种子平均发芽率显著高于野生型,平均相对电导率则显著低于野生型;自然干旱胁迫下,35S∶TGG1的相对失水速率显著慢于野生型,而干旱复水后的平均存活率则显著高于野生型。对气孔的观察结果表明,过表达TGG1的转基因植株气孔对ABA处理具有更高的敏感性,气孔关闭程度显著高于野生型植株。以上研究结果表明,过量表达TGG1基因可显著提高拟南芥的抗旱能力,而且其抗性机制很可能与气孔在逆境下的关闭程度有关。     

拟南芥lncRNA-At5NC056820过表达载体构建及其转基因植株的抗旱性研究

以拟南芥At5NC056820为研究对象,构建其过表达载体,以蘸花法侵染拟南芥,经半定量PCR鉴定成功获得了12株过表达株系,并测定转基因植株在干旱胁迫下的生理指标,分析转基因植株的抗旱性,以明确At5NC056820对干旱胁迫的响应,为进一步揭示lncRNA影响植物抗旱性的分子机制提供依据。结果显示:(1)成功构建出含有At5NC056820的载体,并得到了12株阳性植株。(2)阳性植株经RCR验证,证实At5NC056820已在拟南芥中过表达;转基因拟南芥A-3、A-7和A-8在干旱处理下均较野生型长势良好。(3)干旱处理10d后,转基因拟南芥的游离脯氨酸含量为2 429.58μg·g~(-1),比野生型高2.2~2.5倍;转基因拟南芥叶绿素含量为0.82mg·g~(-1),平均下降了48.9%,而野生型拟南芥下降了63.0%;转基因拟南芥丙二醛含量为2.15 mmol·L~(-1)·g~(-1),其上升量较野生型少1.19mmol·L~(-1)·g~(-1);转基因拟南芥的植物组织相对含水量为53.73%,其下降量较野生型少19.0%。研究表明,lncRNA-At5NC056820能够在一定程度上提高拟南芥的耐旱性。     

拟南芥热激转录因子耐高温功能分析

从拟南芥基因组中克隆了热激转录因子(At Hsf A6a),构建了过量表达(over-expression,OE)和反义(anti-sense,AS)植物表达载体并转化拟南芥,获得了拟南芥纯合转基因株系。对其进行耐高温处理,结果显示:43℃处理2 h,过量表达转基因植株存活率(86%)远高于野生型(59%);而反义转基因植株存活率则只有43%,显著低于野生型。43℃处理0.5 h,过量表达转基因植株的离子渗漏水平显著低于野生型,而反义转基因植株则大幅度升高。基因表达分析证明,AtHsfA6a的表达受热胁迫诱导,并且Hsp70是受AtHsfA6a调控的下游靶基因。上述结果表明,拟南芥AtHsfA6a可能通过调节Hsp70表达,提高植物耐受高温胁迫的能力。     

山葡萄CBF基因表达载体构建及对拟南芥根生长的影响

为了研究山葡萄CBF基因调节植物对盐胁迫的应答机理,分别构建了山葡萄Va CBF1、Va CBF2和Va CBF3的植物过表达载体。经酶切及琼脂糖电泳检测证实3个基因均插入到p BASTA中,表明表达载体构建成功。然后,分别将3个植物过表达载体转入农杆菌EHA105中,并通过浸花法浸染拟南芥。利用除草剂筛选获得3个基因的拟南芥过表达株系。最后,对野生型拟南芥与转基因拟南芥进行盐胁迫处理,发现OE-CBF2转基因植株的主根伸长长度显著长于其它植株,3个转基因株系的侧根长度也明显长于野生型植株。上述结果表明山葡萄CBF基因可能在植物盐胁迫中对根部生长发育起到非常重要的调控作用。     

转CkLEA4基因拟南芥种子萌发期的抗逆性分析

该研究在实验室前期研究的基础上,将受脱水、盐胁迫和ABA诱导的柠条锦鸡儿CkLEA4基因转入野生型拟南芥,并利用实时荧光定量PCR从8株纯合体中筛选出3个表达量不同的株系,比较野生型和转CkLEA4基因过表达拟南芥种子在不同胁迫处理下的萌发率,以探讨CkLEA4基因在植物抵抗逆境胁迫中的功能。结果发现:(1)在不同浓度NaCl、甘露醇及ABA处理下,转CkLEA4基因过表达拟南芥种子的萌发率均高于野生型,随着NaCl、甘露醇及ABA浓度增加,各株系萌发率均降低,但野生型的萌发率下降幅度均高于3个过表达株系,并且在200mmol/L NaCl和400mmol/L甘露醇处理下,过表达株系子叶绿化率均显著高于野生型。(2)在低浓度ABA处理下,CkLEA4过表达植株子叶的绿化率也高于野生型。研究表明,柠条锦鸡儿CkLEA4基因提高了拟南芥种子萌发阶段对盐、ABA及渗透胁迫的耐受性。     

中间锦鸡儿CiPUB22基因克隆与功能分析

中间锦鸡儿(Caragana intermedia)耐旱、耐寒、耐盐碱,是西北干旱地区的重要固沙灌木,筛选其优良抗逆境基因,可以作为林草基因工程的基因源。该研究在中间锦鸡儿干旱胁迫转录组文库中找到1条CiPUB22 (plant U box 22)基因的cDNA全长序列,CiPUB22基因包括1 260 bp开放阅读框,编码419个氨基酸。实时荧光定量PCR结果表明,在脱水、盐和ABA处理1 h后CiPUB22基因表达量上升并达到最高水平,分别为对照表达量的12倍、35倍和7倍,干旱处理后12 d达到最高值,为对照的2.5倍,表明CiPUB22的转录水平受非生物胁迫诱导。构建CiPUB22基因的过表达载体并转化野生型拟南芥,对转基因纯合体株系抗逆性分析发现,在150 mmol/L NaCl、1 μmol/L ABA和400 mmol/L甘露醇处理下,过表达株系的萌发率均低于野生型,说明过表达CiPUB22基因降低了拟南芥在种子萌发过程中对盐和渗透胁迫的耐受性。     

转甜瓜CmSAMDC基因拟南芥的获得及其耐盐性研究

该研究以哥伦比亚生态型野生拟南芥为材料,将甜瓜CmSAMDC基因构建到植物双元表达载体pCAMBIA1304上,采用农杆菌介导法转入拟南芥,在含有50mg/L潮霉素(Hyg)MS固体培养基上筛选转基因后代,并利用T3代转基因幼苗进行耐盐性分析。结果显示:(1)成功构建了植物超表达载体35S∷CmSAMDC,并经农杆菌介导法转化拟南芥,潮霉素抗性筛选后获得了转CmSAMDC基因拟南芥T3代植株。(2)转CmSAMDC基因拟南芥T3代幼苗在含100、150、200mmol/L NaCl培养基中,侧根长势比野生型植株更为健壮;在200mmol/L NaCl浇灌处理后,转CmSAMDC基因T3代植株仍能维持正常生长,而野生型植株的生长明显受到抑制;在400mmol/L NaCl浇灌处理后16d,野生型植株逐渐死亡,而转基因植株仍能继续存活;对盐胁迫后植株的脂质过氧化程度(MDA)测定显示,野生型植株MDA水平较转基因植株上升更为明显。研究表明,过表达甜瓜CmSAMDC基因增强了转基因拟南芥的耐盐性。     

菘蓝IiEMF基因的克隆与功能分析

该研究以菘蓝(Isatis indigotica Fort.)转录组数据为基础,克隆得到菘蓝EMF基因的cDNA全长,命名为IiEMF。(1)序列分析表明,IiEMF基因开放阅读框长度为1896 bp,编码631个氨基酸。进化树分析表明,菘蓝IiEMF蛋白与甘蓝(Brassica oleracea)EMF蛋白亲缘关系最为接近。(2)实时定量PCR结果显示,IiEMF在菘蓝不同器官中均有表达,且在叶中表达量最高,果实中表达量最低;IiEMF基因在菘蓝抽薹开花过程中叶内的表达量呈先升后降的趋势,并于初花期表达量达到最高后逐渐降低回落;在花/果期IiEMF基因表达量较花蕾中明显降低。(3)成功构建了超表达载体pCAMBIA1300-EMF,经农杆菌介导侵染拟南芥,PCR鉴定表明,有7株为超表达转IiEMF基因植株。(4)表型观察发现,在长日照和短日照条件下,与野生型相比2个转IiEMF基因拟南芥株系的开花时间都明显较早(提前6~10 d),且转IiEMF基因株系的莲座叶数比野生型多10片以上,叶片也比野生型大而肥厚。(5)qRT-PCR检测结果显示,在拟南芥营养生长过程中,过表达IiEMF显著抑制了拟南芥AtAP1、AtCO和AtLFY的表达,而促进了AtFLC的表达;当拟南芥开花时,转基因株系中的AtAP1和AtFLC表达量均高于野生型,AtCO和AtLFY的表达量显著低于野生型。研究表明,过量表达IiEMF基因能够促使拟南芥提前开花,且IiEMF可能是通过影响多种开花途径来共同调节促进拟南芥的早花。     

UV-B预处理诱导拟南芥耐旱性的提高

为了解UV-B提高拟南芥(Arabidopsis thaliana)耐旱性的生理机制,将2周龄的野生型拟南芥(WT)和sto突变体幼苗用不同剂量UV-B预处理1周,再用30%PEG模拟干旱处理24 h,对植株的表型进行统计,并测定类黄酮、脯氨酸和MDA含量。结果表明,低剂量UV-B预处理能够提高拟南芥的耐旱性,植株的类黄酮与脯氨酸含量分别提高了20%～40%和50%～65%,细胞膜受损程度降低,从而提高了保水性。低剂量UV-B提高拟南芥耐旱性的效应在sto突变体中消失,证明这种效应在分子机制上可能与STO蛋白相关。     

沙冬青AmFAD2-1基因的克隆及其功能分析

细胞膜脂的不饱和度主要由脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase,FAD)决定,二者与植物抵抗低温和高盐等逆境胁迫密切相关。沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)是中亚荒漠区唯一的常绿旱生阔叶植物,具有很强的耐寒、耐旱和耐盐碱等特性。该研究利用RT-PCR方法克隆到沙冬青油酸去饱和酶基因AmFAD2-1的cDNA和gDNA,其中后者不含内含子。在AmFAD2-1蛋白(含382个氨基酸残基)序列中含有FAD家族必须的保守组氨酸簇和内质网定位信号及跨膜结构域。进化分析表明,AmFAD2-1与大豆(Glycine max)和柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)等豆科植物的FAD2距离较近,而与玉米(Zea mays)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)等其他植物的FAD2距离较远。qRT-PCR分析表明,在室内培养的沙冬青幼苗中,AmFAD2-1的表达量在低温处理2～24h和干旱处理6～13d期间显著上调,在盐胁迫处理期间则呈现升高、降低、再升高的变化趋势;在野外生长的沙冬青成株嫩叶中,其表达量在秋季和冬季总体上明显高于春季和夏季。成功构建了植物表达载体p3300-35S-AmFAD2-1并通过根癌农杆菌介导法转化野生型拟南芥,获得16株转AmFAD2-1基因植株。耐逆性鉴定表明,转基因株系的耐冻性较野生型拟南芥显著提高,其耐旱性和耐盐性也比后者有较明显的改善。     

过表达或沉默棉花GhPCBER基因株系的获得及其茎叶木质素和木脂素含量研究

编码苯基香豆满苄基醚还原酶(phenylcoumaran benzylic ether reductase,PCBER)的基因PCBER属于PIP亚家族,是苯丙烷代谢途径中参与木脂素合成的关键基因。该研究构建了棉花GhPCBER基因的植物过表达载体并转化拟南芥,同时构建了VIGS(virus induced gene silencing,病毒诱导的基因沉默)载体转化棉花,采用实时荧光定量PCR技术对GhPCBER基因在不同组织中的表达进行分析;对野生型和转基因植株茎叶组织中的木质素和木脂素含量进行测定分析。结果表明:(1)成功构建了GhPCBER植物过表达载体pGWB17-GhPCBRE以及基因沉默重组载体pTRV2-GhPCBER;经遗传转化获得6株转棉花GhPCBER基因抗性拟南芥植株,同时获得15株GhPCBER基因沉默棉花植株(5株为一组)。(2)PCR检测表明,6株转基因拟南芥均为过表达株系,其中株系1、2、3相对表达量更高,且在茎、叶组织中的表达量分别较野生型提高了7～14倍和6～16倍,表明GhPCBER基因成功在拟南芥中过表达;GhPCBER基因沉默棉花植株的茎、叶组织中的表达量分别比野生型棉株约下降12%和26%,表明烟草脆裂病毒(TRV)体系(pTRV2-GhPCBER)成功抑制了GhPCBER基因的表达。(3)转GhPCBER基因拟南芥茎、叶中木质素和木脂素含量较野生型均显著降低;GhPCBER基因沉默棉花植株茎、叶中木质素和木脂素含量较野生型均极显著降低;组织化学染色观察发现GhPCBER基因沉默棉花植株茎秆颜色明显比野生型染色浅,也证明沉默基因棉花植株茎秆中的木质素含量减少。(4)苯丙烷代谢通路中8个相关基因的实时荧光定量PCR分析发现,过表达或抑制GhPCBRE基因均会导致苯丙烷代谢途径发生重新定向。     

siRNA介导的ERA1表达下调对拟南芥抗旱性的影响

ERA1是控制植物气孔开闭的一个重要基因,根据其保守域构建RNA干扰(RNAi)载体并转化拟南芥,考察转基因植株的生长、气孔导度、离体叶片失水率以及ERA1和相关基因表达,探讨siRNA介导的ERA1表达下调对拟南芥抗旱性的影响。结果表明:转基因拟南芥株系中ERA1的表达受到明显抑制,其离体叶片失水率低于野生型,但并未出现ERA1缺失突变体的负面生长表型;转基因株系对ABA处理比野生型更敏感,其ABA处理株的根长显著变短,气孔孔径更小;转基因株ABI1、ABI2、ATHB6的表达量降低,而RAB18、RD29B、ADH1的表达量升高,siRNA介导的ERA1表达下调可能会激活RAB18、RD29B等逆境响应元件。研究发现,采用RNAi技术可以有效下调ERA1表达,在没有过多负面生长表型的前提下提高拟南芥的抗旱性,且ERA1表达下调可能通过ABA途径正面影响拟南芥的抗旱性。     

转彩色马铃薯StAN1基因的烟草幼苗耐旱性分析

该研究以转彩色马铃薯StAN1基因烟草为材料、野生型烟草(WT)为对照,测定分析转StAN1基因烟草在种子萌发期、幼苗期和苗期对干旱(甘露醇)处理的耐受情况,并对苗期旱热共同胁迫的耐受情况进行测定分析,以探讨彩色马铃薯StAN1基因的功能,为耐旱彩色马铃薯育种提供新路径.结果显示:(1)转StAN1基因烟草鉴定显示,阳...     

Overexpression of Maize IAGLU in Arabidopsis thaliana Alters Plant Growth and Sensitivity to IAA but not IBA and 2,4-D

Overexpression of the IAGLU gene from maize (ZmIAAGLU) in Arabidopsis thaliana, under the control of the CaMV 35S promoter, inhibited root but not hypocotyl growth of seedlings in four different transgenic lines. Although hypocotyl growth of seedlings and inflorescence growth of mature plants was not affected, the leaves of mature plants were smaller and more curled as compared to wild-type and empty vector transformed plants. The rosette diameter in transgenic lines with higher ZmIAGLU expression was also smaller compared to the wild type. Free indole-3-acetic acid (IAA) levels in the transgenic plants were comparable to the wild type, even though a decrease in free IAA levels might be expected from overexpression of an IAA-conjugate–forming enzyme. IAA-glucose levels, however, were increased in transgenic lines compared to the wild type, indicating that the ZmIAGLU gene product is active in these plants. In addition, three different 35SZmIAGLU lines showed less inhibition of root growth when cultivated on increasing concentrations of IAA but not indole-3-butyric acid (IBA) and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Feeding IAA to transgenic lines resulted in increased IAA-glucose synthesis, whereas the levels of IAA-aspartate and IAA-glutamine formed were reduced compared to the wild type. Our results show that IAA homeostasis can be altered by heterologous overexpression of a conjugate-forming gene from maize.