GL—7—ACA酰化酶在大肠杆菌中的分泌表达

利用来自假单胞菌的ＧＬ－７－ＡＣＡ酰化酶的信号肽和表达元件基因片段构建了ＧＬ－０７－ＡＣＡ酰化酶的分泌型高表达质粒ｐＴｒｃＣＡ１Ｓ和ｐＫＫＣＡ１Ｓ,其中ｐＴｒｃＣＡ１Ｓ为ＩＰＴＧ诱导型质粒,ｐＫＫＣＡ１Ｓ为组成型质粒。ｐＴｒｃＣＡ１Ｓ和ｐＫＫＣＡ１Ｓ转入受体菌ＴＧ１中都可高表达ＧＬ－７－ＡＣＡ酰化酶基因并将表达产物转运到周质空间,完整细胞酰楷酶比活力分别为２３．９单位每克菌体和１８．３单位每克菌体     

GL-7ACA酰化酶表达检测系统的建立

戊二酰－7－氨基头孢烷酸（GL－7ACA）酰化酶能够催化GL－7ACA分解生成7－ACA,后者是工业半合成生产头孢类抗菌素所需的重要前体。为了准确地检测GL－7ACA酰化酶及其突变体的表达,本研究通过构建一系列质粒载体,建立了两个简便有效地测定GL－7ACA酰化酶基因acy表达量的系统,从而可对酶的比活力进行定量。我们将两个报告基因,即儿茶酚双加氧酶基因（xylE)和β－半乳糖苷酶基因（lacZ)分别置于acy基因的下游,使之与acy基因共用一个启动子,进行串联表达,各自构成一个多顺反子系统。实验证明,基因融合后的儿茶酚双加氧酶或β－半乳糖苷酶的活力可以间接反映acy的表达量。     

GL—7ACA酰化酶（C130）β亚基N端氨基酸残基的突变及功能

戊二酰 7 氨基头孢烷酸酰化酶 (即GL 7ACA酰化酶 ,EC .3.5 .1.11)的催化中心通常在 β亚基N端的第一个氨基酸 ,底物亲和标记的研究亦显示N端存在着结合靶点 ,因而该区域的结构可能与酶的功能密切相关。对C130 β亚基N端的 2～ 8位氨基酸残基分别进行了肽段置换和定点突变研究。将N端前 8位肽段置换为来源于Arthrobacterviscosus的青霉素G酰化酶 (PAC)的对应序列后 ,C130酰化酶活力丧失 ;而置换为来源于E .coli的青霉素G酰化酶 (PGA)的对应序列后 ,酰化酶活力仍然保留 ,但Km 值从 0 .44× 10 -3 mol·L-1增大为 0 .5 5× 10 -3mol·L-1,kcat值由 4.92s-1降低为 1.6 4s-1。另对C130 β亚基N端 2～ 4位氨基酸残基作了单点突变 :第 4位的Trp为可能的底物类似物结合位点 ,被变为Tyr后 ,它对底物GL 7ACA的结合能力略为减弱 ,kcat则降低为 2 .2 9s-1;而变为Leu后 ,Km 为 0 .34× 10 -3 mol·L-1,kcat为 3.15s-1;第 3位的Ser变为Met、Ala及Cys后 ,随着Km值逐渐降低 ,kcat也有所降低 ,而S3 M、S3 A突变体的kcat/Km 值比野生型的分别增加了 2 2 .3%和 39.3% ;将活性中心Ser(β1)邻位的Asn(β2 )变为Gln后 ,C130酶活大幅度下降 ,kcat减为 0 .47s-1。上述结果表明 ,C130 β亚基N端的前几个氨基酸残基均可对酶的功能     

GL-7ACA酰化酶表达检测系统的建立

戊二酰 7 氨基头孢烷酸 (GL-7ACA)酰化酶能够催化GL-7ACA分解生成 7-ACA ,后者是工业半合成生产头孢类抗菌素所需的重要前体。为了准确地检测GL-7ACA酰化酶及其突变体的表达 ,本研究通过构建一系列质粒载体 ,建立了两个简便有效地测定GL-7ACA酰化酶基因acy表达量的系统 ,从而可对酶的比活力进行定量。我们将两个报告基因 ,即儿茶酚双加氧酶基因 (xylE)和 β-半乳糖苷酶基因 (lacZ)分别置于acy基因的下游 ,使之与acy基因共用一个启动子 ,进行串联表达 ,各自构成一个多顺反子系统。实验证明 ,基因融合后的儿茶酚双加氧酶或 β-半乳糖苷酶的活力可以间接反映acy的表达量。     

GL－7－ACA酰化酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达

本文报道了利用BamHⅠ酶解的载体pBR322 DNA与Sau3A部分酶解的假单胞菌Ps．130染色体DNA片段构建重组质粒,并用³²P标记的寡核苷酸探针从3205个含有外源片段的重组质粒中检测得到7株阳性克隆株。进一步经¹²⁵Ⅰ标记的抗体／抗原放射免疫反应、GL－7－ACA酰化酶活力测定以及酶反应产物的纸谱色层分析,由上述7株阳性株中鉴定出3株能在大肠杆菌中表达酰化酶活力的基因克隆株。对该3株菌的重组质粒——pMR 5、pMR 6和pMR-7-DNA的初步凝胶电泳分析表明,pMR 5和pMR 7质粒中插入片段的分子量为6．8kb,质粒pMR 6则带有5．7kb的外源片段。实验还比较了重组质粒pMR 5在8株不同的大肠杆菌宿主菌中,GL－7－ACA酰化酶的表达水平。     

一株产多种β-内酰胺类抗生素酰化酶菌株的筛选

为了从大量的候选菌株中快速筛选头孢菌素酰化酶产生菌,设计并合成了一系列头孢菌素酰化酶的底物类似物。这些酰胺类的底物类似物由二部分组成,一部分为与头孢菌素相同或相似的侧链,另外一部分为发色基团或便于检测的基团。它们被酰化酶水解酰胺键以后可以方便快速的检测,因此用于对大量菌株进行快速筛选。采用这些化合物筛选到6株酰化酶阳性菌株。其中菌株ZH0650能够同时水解GL-7ACA和多个底物类似物。进一步研究表明,该菌至少产生3种酰化酶,AD-NABA酰化酶,青霉素G酰化酶和头孢菌素C酰化酶。我们初步纯化了AD-NABA酰化酶和青霉素G酰化酶,并对头孢菌素C酰化酶的活力进行了鉴定。这是首次报道的可以产生青霉素G酰化酶和头孢菌素酰化酶等多种酰化酶的菌株,具有良好的应用前景。     

假单胞菌sp.130 GL-7-ACA酰化酶的核苷酸和蛋白质序列分析

对来源于假单胞菌sp.130的戊二酰-7-氨基头孢烷酸（GL－7－ACA）酰化酶结构基因的全序列及所编码蛋白质的α,β亚基的N末端和C末端的氨基酸序列进行了测定。将蛋白质序列与其他同类的GL－7－ACA酰化酶进行了同源性比较,结果显示该酶与来源于假单胞菌GK16和C427的酰化酶的序列有较高同源性,而与其它同类酰化酶的同源性较低。这些酶的α亚基N－末端差别较大,但是β－亚基的N－末端有较高的保守性。     

头孢菌素酰化酶基因在大肠杆菌中的表达规律

假单孢菌sp .130头孢菌素酰化酶催化戊二酰 7 氨基头孢烷酸的水解反应 ,生成 7 氨基头孢烷酸。 7 氨基头孢烷酸是医药工业合成大多数头孢菌素衍生物的起始原料。在 6种大肠杆菌表达质粒上构建了表达该酶的不同载体 ,得到了不同表达结果的大肠杆菌转化子。这些质粒有各自的特点 ,适用于不同的场合。     

青霉素酰化酶基因的克隆与表达Ⅱ 质粒pPAl的限制性酶切图及青霉素酰化酶基因的定位

前文报道重组质粒pPAl中9．1kb的EcoRI片段上带青霉酰化酶基因。用16种限制性内切酶消化pPAl,其中ApaI,KpnI,SacI,SacI,SmaI及XhoI等六种内切酶在pPAl上无切口; BamHI,ClaI,Sph I,BglI为单切口;Sal为双切口,AvaI,HindI及PvuI为三切口,EcoRV为五切口。经交叉双酶解法测定各片段的大小,作出质粒pPAl的限制性酶切图。在包含青霉素酰化酶基因的9．1kbEcoRI片段上,BglI有一个切口,AvaI,HindI 及PvuI都有两个切口,而EcoRV有四个切口,SalI,BamHI,ClaIKSphI不切9．1kb的EeoR I片段。HindI切9．1kb EcoR I片段为A(3．5kb),B(2．7kb)及C(2,9kb)等三个片段。经Hind I部分水解后连接,转化大肠杆菌HB101得到一系列带不同Hind 1片段的质粒的转化子,青霉素酰化酶活性测定证明其基因位于Hin d II—A片段上。合成青霉素酰化酶仍需苯乙酸诱导,并被葡萄糖阻遏,Hind I—B片段的存在能增加青霉素酰化酶基因的表达,而c片段无显著影响。     

GL-7ACA酰化酶基因工程菌(Escherichia coli MMR204/pZC1)批式补糖发酵条件优化

戊二酰-7-氨基头孢烷酸(GL-7-ACA)酰化酶(3．1．5．11)可有效催化GL-7ACA分子中戊二酰基侧链水解,形成7-氨基头孢烷酸(7-ACA)而成为两步酶法生产7-ACA的重要工业用酶之一。在已构建的GL-7ACA酰化酶基因(acy)重组质粒pZC1基础上,进一步对酰化酶基因工程菌Escherichia coli MMR204／pZC1的产酶发酵条件进行了考察。研究表明,工程菌的最佳发酵温度为33℃,pH7．5～8．5的微碱条件有利于酶的生成。LB培养基补加适量葡萄糖(1～5g／L),可提高发酵生物量和产酶水平,但葡萄糖的过量补加(6g／L以上),则导致发酵液偏酸(低至pH4．0)而完全抑制酰化酶生成,并证明工程菌生长和产酶对乙酸的抑制效应较为敏感。同时通过5L自控发酵罐的批式补糖试验,对恒速流加、pH反馈控制和指数流加等三种补糖模式的发酵产酶进程进行了比较。结果发现,三种方式的补糖条件下,acy基因在tac启动子控制下,呈组成型表达,细胞生长与产酶同步,无需诱导;其中,以指数流加方式得到的生物量和产酶水平最高。而从acy基因的表达效率,即比酶活看,pH反馈的补料方法略高于恒速或指数流加模式。     

青霉素G酰化酶调节基因的定位

为了定位青霉素G酰化酶的调节基因,从质粒Ppa6克隆了一系列青霉索G酰化酶基因(pac)的片段,将这些重组质粒转化E.coli D816,测定克隆片段对pac表达的影响。如果克隆片段含有完整的调节基因(pacR)。诱导剂不能使由高拷贝pacR表达的阻抑物失活,部分阻抑物结合pac操纵基困,阻碍RNA聚合酶对加pac的转录,因此pac的表达量降低。发酵结果表明,阻抑物可能是由pac结构基因内部的ORFⅡ编码的蛋白因子。     

大肠杆菌AS1.76青霉素G酰化酶基因的克隆和定位

通过DNA体外重组,由E. colt AS 1.76菌株染色体DNA获得了青霉素G酰化酶基因克隆。测定了pPGA20质柱的限制性内切酶图谱,并构建了若干个pPGA2(／的变种。这些变种的酶活力及其酶切位点关系的分析结果表明,青霉素G酰化酶基因定位在 HindIII 和Sinai酶切位点之间小于2．8Kb DNA片段上。     

GL-7ACA酰化酶基因工程菌(Escherichia coli MMR204/pZC1)批式补糖发酵条件优化

戊二酰 7 氨基头孢烷酸 (GL-7-ACA)酰化酶 (3.1.5.11)可有效催化GL-7ACA分子中戊二酰基侧链水解 ,形成7-氨基头孢烷酸 (7-ACA)而成为两步酶法生产7-ACA的重要工业用酶之一。在已构建的GL-7ACA酰化酶基因(acy)重组质粒pZC1基础上 ,进一步对酰化酶基因工程菌EscherichiacoliMMR204pZC1的产酶发酵条件进行了考察。研究表明 ,工程菌的最佳发酵温度为 33℃ ,pH7.5～ 8.5的微碱条件有利于酶的生成。LB培养基补加适量葡萄糖 (1～ 5g/L) ,可提高发酵生物量和产酶水平 ,但葡萄糖的过量补加 (6g/L以上 ) ,则导致发酵液偏酸 (低至pH4.0 )而完全抑制酰化酶生成 ,并证明工程菌生长和产酶对乙酸的抑制效应较为敏感。同时通过5L自控发酵罐的批式补糖试验 ,对恒速流加、pH反馈控制和指数流加等三种补糖模式的发酵产酶进程进行了比较。结果发现 ,三种方式的补糖条件下 ,acy基因在tac启动子控制下 ,呈组成型表达 ,细胞生长与产酶同步 ,无需诱导 ;其中 ,以指数流加方式得到的生物量和产酶水平最高。而从acy基因的表达效率,即比酶活看,pH反馈的补料方法略高于恒速或指数流加模式。     

一株产多种β-内酰胺类抗生素酰化酶菌株的筛选

为了从大量的候选菌株中快速筛选头孢菌素酰化酶产生菌,设计并合成了一系列头孢菌素酰化酶的底物类似物。这些酰胺类的底物类似物由二部分组成,一部分为与头孢菌素相同或相似的侧链,另外一部分为发色基团或便于检测的基团。它们被酰化酶水解酰胺键以后可以方便快速的检测,因此用于对大量菌株进行快速筛选。采用这些化合物筛选到6株酰化酶阳性菌株。其中菌株ZH0650能够同时水解GL7ACA和多个底物类似物。进一步研究表明,该菌至少产生3种酰化酶,ADNABA酰化酶,青霉素G酰化酶和头孢菌素C酰化酶。我们初步纯化了ADNABA酰化酶和青霉素G酰化酶,并对头孢菌素C酰化酶的活力进行了鉴定。这是首次报道的可以产生青霉素G酰化酶和头孢菌素酰化酶等多种酰化酶的菌株,具有良好的应用前景。     

青霉素酰化酶调节基因的定位和反式作用

青霉索酰化酶基因(pac)的定位研究表明它的调节基因和结构基因位于3．5kb的HindI—EcoR I片段。本文报道构建一系列质粒pPA 6的缺失衍生物,并测定这些缺失对pac表达的影响。结果表明调节基因位于pac结构基因内的spb I—Pvu I片段。SphⅠI—PvuⅡ片段克隆到质粒pTzl8u,所得质粒pPA57转化到青霉素酰化酶产生菌E．ColiD816,观察sphⅠ—PvuⅡ片段对染色体pac基因表达的影响。结果表明在sph Ⅰ—PvuⅡ片段内的调节基因反式调节pac基因表达。计算机分析表明在sph Ⅰ—PvuⅡ片段内有两个ORF是编码调节蛋白的可能候选者。Pac调节基因的精确定位正在进行中。     

利用强启动功能片段提高麦迪霉素4″—羟基丙酰化酶基因的表达

利用ＰＣＲ技术将本室克隆到的强启动功能片段取代麦迪霉素丙酰化酶基因（ｍｐｔ）的启动子或与ｍｐｔ基因自身启动子串连,获得含ｍｐｔ重组质粒ｐＣＨＦＰＥ３和ｐＣＨＦＰＥ２。用含有这两质粒的Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４对螺旋霉素进行微生物转化,结果表明,与含有原启动子的ｍｐｔ．Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４（ｐ．ＷＦＰＥ）相比,丙酰螺旋霉素的组分比例分别提高了８９．０２％和５８．５     

生米卡链霉菌丙酰化酶基因定位及其核苷酸序列测定

我们已往的工作已经确定在重组质粒ｐＩＪＭ９中,生米卡链霉菌来源的４．１６ｋｂ插入ＤＮＡ片段带有丙酰化酶基因,为了进一步确定该基因在４．１６ｋｂ插入片段中的位置,我们以ＢａｍＨＩ对ｐＩＪＭ９进行酶切,在此基础上进行缺失重组亚克隆,在所获得的转化子中,Ｎｏ．５转化子含重组质粒ｐＩＪＭ９５,分子量为５．０ｋｂ,插入ＤＮＡ片段为０．５３ｋｂ,以Ｎｏ．５转化子对螺旋霉素进行生物转化实验,其转化产物经薄层层析