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相似文献
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1.
以国审油茶(Camellia oleifera)良种‘华硕’种子为材料,在已构建的转录组和表达谱数据库基础之上,采用RACE技术,克隆获得油茶脂酰辅酶A脱氢酶基因的全长c DNA序列,命名为Co ACAD(基因登录号KJ910338)。该基因c DNA全长为2702 bp,含有2487 bp的开放读码框,编码828个氨基酸,分子量为92.4113 k D,理论等电点p I为8.47,具有2个比较明显的跨膜区和酪氨酸蛋白激酶活性位点LVHGDFRIDNLVF,存在5个亚结构域;在Co ACAD基因c DNA全长序列的基础上构建表达载体,其中原核表达载体在宿主细胞BL21(DE3)中成功诱导表达,获得表观分子量约为93 k D的目的蛋白;实时荧光定量PCR分析表明,Co ACAD基因在果实膨大期和成熟期上调表达,预示着Co ACAD基因可能在种子发育过程中参与能量供应过程的调控。  相似文献   

2.
克雷伯氏菌甘油脱水酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达   总被引:5,自引:2,他引:5  
利用PCR技术从克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae ATCC49790)总DNA中扩增得到甘油脱水酶(glycerol dehydratase,DHAB)基因的DNA片段,并将其连接到表达质粒pSE380,携带有重组质粒pSE-dhaB的大肠杆菌JM109实现了dhaB基因的表达;对含有dhaB工程菌进行表达研究,表明工程菌在37℃,以1.0mmol/L IPTG诱导5h酶活力即达到1164.14u/L,比野生菌酶活力(168.69U/L)提高了6.9倍。  相似文献   

3.
迅速升温的生物柴油投资热导致了其副产物甘油的大量积累,这一现状使得开发和利用甘油生产各种精细化工产品备受关注。本实验通过构建基因工程菌来生物转化甘油生产3-羟基丙醛,为甘油下游产品的开发开辟了一条新途径。3-羟基丙醛是一种重要的化学中间体,同时也是一种有效的抗菌剂和生物组织的固定剂,在化学工业中具有广泛的应用前景。实验主要利用甘油脱水酶N末端序列,并根据NCBI中公布的甘油脱水酶的氨基酸序列设计了一对克隆引物,并以菌株罗伊乳酸杆菌Lactobacillus reuteri的基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得约为1.6kb的片段,将其克隆到T载体上进行测序,对测序结果进行分析,重新设计两端含有EcoRI和HindIII酶切位点的表达引物,利用PCR扩增得到了甘油脱水酶基因,该基因片段长度为1674bp,编码558个氨基酸。将所得片段定向克隆到pET28b载体中,并转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中。经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE电泳,在约65kD处检测出一蛋白表达条带,另外还对该重组菌进行比活力测定,最高比活力可达1.14U/mg,比野生型菌株提高了86.88%。  相似文献   

4.
弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达   总被引:4,自引:0,他引:4  
以弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)基因组DNA为模板,通过PCR得到甘油脱水酶(glycerol dehydratase)基因dhaB、dhaC、dhaE,克隆到表达载体pSE380上,得到重组质粒pSn-dhaBCE。将此重组质粒转化到E.coli JM109中,重组菌株SDS-PAGE结果显示有明显的61kD、22kD、16kD三条特异性蛋白条带出现。重组菌株经诱导表达,酶活力为11.59U/mL。  相似文献   

5.
细菌采用II型脂肪酸系统合成脂肪酸,其中3-羟脂酰ACP脱水酶催化唯一的脱水反应,是细菌生长的关键酶之一.野油菜黄单胞菌(Xcc)引起几乎所有十字花科植物的黑腐病,在全球范围内造成广泛的经济损失.为研究Xcc中3-羟脂酰ACP脱水酶,本研究利用大肠杆菌3-羟脂酰ACP脱水酶FabZ序列同源比对时,发现其与XC2876 (XcfabZ)编码蛋白具有同源性,序列一致性达到46.1%,同时还具有保守的α螺旋结构和活性位点.将XcfabZ异体遗传互补大肠杆菌fabZ(EcfabZ)条件突变株HW7,结果显示添加IPTG能恢复突变株的生长,初步表明XcFabZ具有3-羟脂酰ACP脱水酶活性.而体外活性分析显示,XcFabZ能在脂肪酸合成的起始反应和延伸反应中发挥3-羟脂酰ACP脱水酶活性作用.本研究不能直接获得XcfabZ基因敲除突变株,但将携带EcfabZ或XcfabZ的表达质粒导入后,获得基因替换突变株,证明XcfabZ是必需基因. EcfabZ替换突变株的脂肪酸组成与野生菌有差异,对逆境条件(高盐、低pH、H2O2和SDS)...  相似文献   

6.
点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶基因的克隆与表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
用活性筛选法从产气单胞菌点状亚种ST7833 (Aeromonas puctata subsp.puctata ST7833)的基因组中克隆了脯氨酰内肽酶 (Prolyl Endopeptidase,简称apPEP)的基因,测定了含有PEP基因的33kb DNA片段的序列,第202092bp编码了690个氨基酸组成的脯氨酰内肽酶,经检索是一种新的PEP基因。并构建了一株组成性高效表达PEP的基因工程菌BL21/pGEMPEP。BL21/pGEMPEP在 YH培养基中apPEP的表达量占菌体总蛋白的30%左右,活力是野生菌的112倍,表达产物主要为可溶性的胞内蛋白,约5%分泌到胞外。非还原SDSPAGE显示为单体,分子量为76kD,与基因序列预测的分子量一致。试管培养后纯化得到了纯度大于90%的重组脯氨酰内肽酶,比活力为67U/mg。  相似文献   

7.
家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV)是家蚕的重要病毒病原之一,往往给养蚕业生产造成极大危害。我们以前的研究运用基因芯片技术在感染质型多角体病毒的家蚕中肠中鉴定出一个差异表达的3-羟酰辅酶A脱氢酶蛋白基因(Bombyx mori3-hydroxyacyl-CoA dehyrogenase protein gene-Bm3HAD)。本研究利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了该基因,其全长cDNA序列为1168bp,包含一个83bp5’端非翻译区序列(5’-UTR)、一个930bp的开放阅读框(ORF)和一个155bp的3’端非翻译区序列(3’-UTR);基因结构分析发现该基因由5个外显子和4个内含子组成。RT-PCR结果显示该基因在家蚕中肠、脂肪体、血液、丝腺及生殖体中均有表达。荧光定量PCR结果表明该基因在BmCPV感染初期为上调表达,随着病毒感染的进展,该基因的表达水平逐渐降低,并转变为下调表达。研究结果为进一步研究BmCPV对家蚕致病的分子机制提供了有益的信息。  相似文献   

8.
1,3-丙二醇是一种重要的化工原料,其生物法生产的研究逐渐受到的关注。研究以弗氏柠檬酸菌的总DNA为模板,通过PCR分别扩增出约1.8kb(dhaF)和0.4kb(dhaG)的两个基因片段分别编码甘油脱水酶激活因子大、小亚基, 连接于pMD-18T载体,测序分析显示与GenBank中相关基因的相似性最高为86%。将两基因以多顺反子的方式与pSE380连接构建表达载体,并在大肠杆菌中进行高效表达,表达量占总蛋白的30%。将高效表达的激活因子用金属亲合层析和分子筛进行了纯化,得到电泳纯级的甘油脱水酶激活因子,SDS-PAGE分析显示:大、小亚基分子量约为63kDa和12kDa;非变性胶分析显示:全酶的分子量约为150kDa,经扫描分析推测甘油脱水酶激活因子很有可能是以α2β2方式结合的。以弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶为研究对象,进行激活实验,结果证实该激活因子具备甘油脱水酶激活因子的功能,为进一步阐明甘油脱水酶的激活机制及1,3-丙二醇的高效生产奠定了基础。  相似文献   

9.
长链脂肪酰基Co A合成酶(LACS)在脂肪酸的合成与分解代谢中起着重要作用。本研究以油茶(Camellia oleifera Abel)国家审定品种华硕(Camellia oleifera Huashuo)种仁转录组数据为基础,根据LACS基因Unigene序列设计引物,分离克隆了油茶LACS1基因全长c DNA序列,命名为CoLACS1(Gene Bank登录号:KJ960228),全长2114 bp,开放阅读框2088 bp,编码695个氨基酸;生物信息学分析显示CoLACS1具有3个B1ock,从分子特征可判断CoLACS1属于LACS家族;氨基酸同源比对显示与其他物种的LACS氨基酸序列具有较高的相似性,其中与拟南芥LACS7相似性为78%,与麻风树、大豆、毛果杨等物种LACS6(peroxisomal)相似性可达80%以上;对CoLACS1进行原核表达分析,构建的p ET30a-CoLACS1载体成功转化至BL21(DE3)中经1 mmol/L IPTG诱导表达,菌液检测获得预测的目的蛋白(分子量约为76 k D);分析转录组数据中CoLACS1的Unigene序列RTKM值并对CoLACS1进行实时荧光定量PCR分析,结果表明CoLACS1在油茶华硕种子发育各时期平稳表达,表达丰度变化不大,荧光定量结果变化规律与转录组数据分析一致;同时分析华硕种仁不同时期含油率和脂肪酸成分变化,双变量统计分析发现CoLACS1表达模式与油茶油脂积累规律呈显著相关性。本研究为进一步研究油茶油脂积累与代谢的基因调控提供理论依据。  相似文献   

10.
姜鸣  霍棠  吕淑敏  张雅林 《昆虫学报》2012,55(7):860-868
3-羟甲基戊二酰辅酶A-还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR)是甲羟戊酸途径的关键酶。获得芫菁体内HMGR基因信息是确定甲羟戊酸途径与斑蝥素合成相关性的基础。本研究利用RACE技术从细纹豆芫菁Epicauta mannerheimi (Maklin)体内克隆获得HMGR基因全长cDNA序列, 命名为EmHMGR(GenBank登录号为JQ690539)。该基因全长3 118 bp, 其中5′端非翻译区178 bp, 3′端非翻译区414 bp, 开放阅读框2 526 bp, 编码842个氨基酸。推测的蛋白质分子量为92.8 kDa, 理论等电点为6.0, 预测分子式为C4135H6604N1098O1216S50, 不稳定系数为43.37, 总亲水性系数为0.091, 为疏水性不稳定蛋白。序列分析发现该基因编码的蛋白与已报道的其他昆虫HMGR的氨基酸序列一致性达50%以上, 而且包含HMGR_Class I保守功能域、 固醇敏感多肽区及HMGR蛋白的其他保守功能位点。系统进化分析发现该基因与叶甲科昆虫HMGR基因的关系最近。本研究首次从芫菁科昆虫体内克隆获得甲羟戊酸途径的关键酶EmHMGR基因, 为后期芫菁体内斑蝥素生物合成途径的研究奠定了基础。  相似文献   

11.
采用RT-PCR技术从油茶中分离出一个柠檬酸合成酶基因,该基因的c DNA全长1 416 bp,编码471个氨基酸,推导的蛋白分子量为52.74 k D,理论等电点(PI)为6.95。同源比对显示其与其他植物的CS蛋白序列高度同源,将该基因命名为Co CS(Gen Bank登录号:KU161147)。系统进化树分析表明油茶Co CS与杜鹃和葡萄的CS蛋白的亲缘关系较近。荧光定量PCR分析结果表明,油茶受到低磷胁迫后根系Co CS基因的表达受到低磷诱导,表达量呈现先升高后降低的趋势;不同油茶品种不同组织(根、茎、叶)中的Co CS基因在不用磷处理下的表达模式不同。  相似文献   

12.
将L-异亮氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum YILW)苏氨酸脱水酶(threonine de-hydratase,TD)的编码基因ilvA在大肠杆菌中进行异源表达及进行初步的酶学性质研究。分别以C.glutamicum ATCC13032、YILW的基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增出苏氨酸脱水酶的编码基因ilvA,测序获得编码序列。利用质粒PET-His将该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达、金属螯合纯化,对其酶学性质进行初步研究。结果显示C.glutamicum YILW编码基因序列与已报道的ilvA序列相差5个碱基,相似度为99.6%,第383位氨基酸由苯丙氨酸突变为缬氨酸。酶学性质研究表明:重组酶YilwTD最适反应温度为32℃,在20~55℃范围内该酶较稳定,最适pH为6.7,该酶底物专一性强,对最适底物苏氨酸的米氏常数Km=8.32 mmol/L,最大反应速度Vmax=3.18×104U/mg,与野生型酶相比,突变(F383V)后可显著降低终产物对酶的反馈抑制作用。为揭示突变对苏氨酸脱水酶活性的影响及进一步利用基因工程技术改造L-异亮氨酸生产菌,提高L-异亮氨酸产量奠定了基础。  相似文献   

13.
罗汉果甜苷V是一种葫芦烷型四环三萜类物质,作为主要的活性成分和甜味成分存在于成熟果实中,3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)作为萜类化合物生物合成途径中的第一个限速酶,位于甲羟戊酸(MVA)途径中,是罗汉果甜苷V生物合成途径中的重要调控位点。为了深入了解罗汉果甜苷Ⅴ的生物合成途径,该研究从罗汉果转录组数据中获得一条编码HMGR的unigene,以授粉后3 d的幼果作为实验材料,通过RACE技术获得了1 926 bp的全长序列,经过生物信息学软件分析,发现该基因含有1 749 bp的开放阅读框,编码582氨基酸残基,含2段跨膜区,分别位于50~72 aa和93~115 aa,亚细胞定位预测位于质膜或内质网上,预测该蛋白没有信号肽,系统进化树分析显示与同科植物黄瓜和甜瓜中HMGR基因的同源性最高。该研究采取去掉N端跨膜区的方法,构建原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导在上清和沉淀中均有融合蛋白出现,尤其在25℃诱导过夜后上清中表达最明显。该文是首次对SgHMGR基因全长序列的克隆及原核表达的功能验证,为进一步深化SgHMGR基因在罗汉果甜苷V生物合成途径中的功能及分子调控研究打下基础。  相似文献   

14.
DNA重组激活基因(Recombination activating genes RAG)是脊椎动物特异性免疫反应的关键基因,也是脊椎动物进化分析的标记基因之一。鲫鱼具有很强的适应性和抗病能力,是我国广泛养殖的重要经济淡水鱼;由于具有不同的倍性和丰富的遗传多样性,又是研究鱼类基因组进化的独特材料。本研究用PCR方法扩增、克隆了鲫鱼的Rag基因。鲫鱼Rag1基因从起始密码到终止密码总长4188bp,由三个外显子和两个内含子组成,其中开放阅读框长3192bp,编码1063个氨基酸。Rag2基因从起始密码到终止密码总长1593bp,没有内含子,只有单一的编码区,编码530个氨基酸。Rag1和Rag2基因的ORF和氨基酸序列在不同鱼类中的对比结果表明其在进化过程中非常保守。不同鱼类Rag1基因的第二内含子也是高度保守的,转录因子结合位点分析表明在第二内含子的保守区域中有许多转录因子的可能结合位点。其中有一段在所有已知鱼类中都存在的保守区域是与性腺发育相关的转录因子SRY和SOX5的可能结合位点,提示Rag1基因的表达可能与性腺发育具有相关性。用RT-PCR方法进行的组织特异性表达分析表明Rag1基因在鲫鱼成体的头肾和精巢都能检测到表达,提示Rag基因不仅主导了免疫组织中的DNA重组,也可能参与了生殖细胞的DNA重组。RT-PCR检测证明Rag1基因在鲫鱼胚胎发育至第5天开始表达,在第7天鲫鱼胚胎的胸腺原基中可检测到Rag1基因mRNA的杂交信号,在第9天鲫鱼胚胎的胸腺原基中可以检测到很强的Rag1 mRNA原位杂交信号,说明该时期可能是鲫鱼免疫基因重组的活跃时期。  相似文献   

15.
肉毒碱棕榈酰转移酶(carnitine palmitoyltransferases,CPT,EC.2.3.1.2)在脂肪酸的β-氧化中起重要作用.线粒体内膜外侧的脂酰CoA经CPTⅠ催化与肉毒碱结合形成脂酰肉毒碱而得以穿过线粒体内膜,进入线粒体.在线粒体内膜内侧的CPTⅡ催化下,脂酰肉毒碱上的脂酰基又转移到CoA上,重新形成脂酰CoA,成为β-氧化的底物.利用RT-PCR和SMART RACE的方法从鲈鱼(Lateolabrax japonicus)肝脏中克隆了CPT I全长cDNA.该序列全长3007 bp,5′非翻译区166 bp、3′非翻译区477 bp、开放阅读框2364 bp,编码一个由787个氨基酸组成的蛋白质,分子量为89.60 kDa,等电点为8.85.氨基酸序列分析表明,鲈鱼CPT I具有较高的保守性,与金头鲷(Sparus aurata)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、斑马鱼(Danio rerio)、人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)等 7个物种的同源性为93%~66%,其中与金头鲷同源性最高,为93%.用RT-PCR分析CPT I基因在10个组织中的表达,结果表明在肌、肾中有较高的表达,心、脑、鳃、肝、肠次之,眼、脂肪、脾表达最低.  相似文献   

16.
该研究以藤茶叶片为材料,利用RACE技术克隆得到1个黄烷酮-3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)基因,命名为AgF3H(登录号为JX087441)。AgF3H基因的cDNA全长为1 323 bp,其中开放阅读框长1 092 bp,编码363个氨基酸,含有双加氧酶家族的2个特征性结构域和5个保守基序。序列比对与系统进化树分析显示,AgF3H与其他物种F3H的氨基酸序列具有较高的相似性,且与葡萄、山葡萄和圆叶葡萄的亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示,AgF3H基因在藤茶不同组织部位都有表达,在芽中的表达量最高,嫩茎中最低,在叶片中的表达量随着成熟度的增加而逐渐降低;不同组织中的AgF3H基因表达量与藤茶类黄酮主要成分二氢杨梅素的含量呈显著正相关。构建AgF3H基因过表达载体并导入烟草中,获得5株转基因植株,其中4株烟草的叶片总黄酮含量比野生型对照有不同程度提高,最高株系提高了26.8%。研究表明,AgF3H基因可能在藤茶类黄酮的生物合成中起重要作用,研究结果为进一步研究藤茶高黄酮含量形成的分子机制奠定了基础。  相似文献   

17.
【背景】野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc)引起十字花科植物黑腐病,在全球范围内造成经济损失,亟须深入研究其致病机理,开发新的黑腐病防控措施。细菌脂肪酸合成系统不仅为细胞膜合成提供原料,其中间代谢产物还是许多生物活性分子合成的底物,具有重要的生理功能,也是抗菌药物筛选的重要靶标。【目的】研究XccfabZ对扩散信号分子(diffusible signal factor, DSF)类信号产量、致病力、胞外酶、胞外多糖和运动性等方面的影响。【方法】利用报告菌株检测法分析了不同替换突变株的DSF类群体感应信号产量。利用同源重组原理,在DSF类信号高产菌株中获得替换突变株,利用高效液相色谱(highperformanceliquid chromatography, HPLC)法测定DSF类信号产量。利用剪叶法检测替换突变株对寄主植物甘蓝的致病力,并分析了不同菌株的胞外多糖、胞外酶和运动性差异。【结果】报告菌株检测法和HPLC法都证明大肠杆菌fabZ替换突变株(XccΔfabZ/pSRK-EcfabZ)中DSF类信号产量显著下降。...  相似文献   

18.
汪信东  章挺  杨海宽  郑永杰  江香梅 《广西植物》2018,38(10):1335-1345
该研究以樟树转录组数据为基础,筛选克隆了拟南芥AtLACS9同源候选基因CcLACS9,二者序列相似性为75%。相关软件预测CcLACS9享有植物LACS亚家族成员3个特征motifs,且N端含有定位质体信手肽。在Δlacs缺陷型酵母互补测试中,以油酸作为唯一外源脂肪酸、转化了CcLACS9的突变型酵母恢复正常生长,证明CcLACS9具有典型的脂肪酰基CoA合成酶的功能。为探究CcLACS9是否参与了樟树籽油生物合成,进一步研究了其组织表达模式和在种子发育过程中其表达量与籽油累积量之间的关系。实时荧光定量PCR分析显示CcLACS9基因在种仁与花中优势表达,种仁中相对表达量是根中的17.74倍。随机测定了30棵成年樟树成熟期种子千粒重、籽油含量和中链脂肪酸比例等指标。根据仁油含量将测试群体划为高、中、低三个不同品级,并在各品级中挑选3棵单株、逐月关联分析其仁油含量与CcLACS9相对表达量。结果表明:在种仁发育前期,仁油含量和CcLACS9表达量都持续上升且二者呈正相关性,8月份为CcLACS9表达量峰值期; 9月下旬后,仁油含量趋向稳定但CcLACS9表达量仍处于较高水平但呈现下降趋势,二者无明显相关性。LACS亚家族在植物进化中较为保守,同源基因在不同植物中具有相同或相似的功能。该研究结果暗示CcLACS9可能拥有AtLACS9相似的生物学功能,即在樟树种仁油酯合成和累积过程中起重要作用。  相似文献   

19.
以大白菜叶片为材料,根据NCBI数据库中Br MYB34-3基因序列的已知信息,利用3-RACE获得了Br MYB34-3基因全长,用RT-PCR方法对Br MYB34-3在不同组织中的表达进行分析.结果显示,该基因全长1 135 bp,编码280个氨基酸.Br MYB34-3具有R2R3-MYB(含有2个MYB结构域的转录因子)典型的R2、R3结构域及基序.其氨基酸序列与大白菜的Br MYB34-1和Br MYB34-2、拟南芥的At MYB34具有较高的一致性.Br MYB34-3在莲座叶、当天开的花中表达水平较高,在花序顶端表达水平较低,在根和花序轴中未检测到表达,这与拟南芥At MYB34的表达模式不同.研究表明,Br MYB34-3是大白菜中的MYB34同源基因,在功能上可能与拟南芥At MYB34基因存在差异.  相似文献   

20.
酰基辅酶A结合蛋白(acyl-CoA-binding protein,ACBP)对长链脂酰基辅酶A(long-chainfatty acyl-CoA esters,LCACoA)有很高的亲和力,因而对LCACoA在细胞内的运输和利用过程起重要的作用。本文采用RACE技术从鲈鱼肝脏中克隆了Acbp基因的全长cDNA序列,该基因全长cDNA 679 bp,5'端和3'端的非翻译区分别为83 bp和326 bp,开放阅读框为270 bp。推测编码89个氨基酸,理论等电点为5.44,分子量为10.14 kDa。鲈鱼Acbp与青鳉鱼、银鳕鱼、大西洋鲑和人的同源性分别为87%、84%、78%和68%。用RT-PCR和实时定量PCR检测鲈鱼肌肉、心脏、眼、大脑、消化道、肾脏、脂肪组织、脾脏、鳃和肝脏等10种组织的Acbp基因的表达情况,结果表明,在肾脏和肝脏的表达量高,肌肉、眼睛和大脑中表达低。定量PCR检测表明鲈鱼肝脏Acbp的表达在饥饿时明显下降,胰岛素上调其表达,葡萄糖对其表达则没有影响。  相似文献   

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