高等植物己糖激酶基因研究进展

己糖激酶(HXK)具有催化己糖磷酸化的作用,是植物体呼吸代谢过程中的关键酶之一。近十几年的研究发现,HXK在植物的糖感知和糖信号转导过程中扮演重要的角色。目前GenBank已登录28种高等植物的HXK同源基因,其在不同物种中均以多基因家族形式存在。HXK基因家族多数成员包括9个外显子,编码492-522个氨基酸。HXK亚细胞定位研究发现,植物HXK家族成员主要分布于线粒体,少数成员存在于细胞质、叶绿体和质体基质中。植物HXK基因家族大部分成员在不同器官或组织中均有表达,但是拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtHKL3和水稻(Oryza sativa)OsHXK10仅在花中表达。高等植物部分HXK不仅影响植物生长发育,还调控植物激素信号转导以及调节植物花青素合成途径中相关基因表达。应用MEGA 4.0软件对18个物种HXK基因氨基酸序列构建系统进化树,HXK基因序列聚为7小支,聚类关系能反映不同基因结构和功能的差异。     

转化酶和己糖激酶调控草莓聚合果内糖积累

以设施栽培的草莓品种‘枥乙女’为试材,用高效液相色谱法分析了果实发育进程中草莓聚合果内不同部位糖含量及相关酶活性的变化。果实成熟过程中草莓聚合果果顶部分含糖量高,中间部位次之,果柄端最低。转化酶活性呈现与糖含量相似的梯度变化。己糖激酶和果糖激酶则表现出与糖梯度相反的变化。上述结果表明,聚合果顶端转化酶活性高,有利于形成蔗糖梯度,从而促进光合产物向果顶端转移;聚合果近果柄端的己糖代谢酶活性高,促进果柄端的己糖消耗,导致果柄端相对低的糖含量。     

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂通过下调己糖激酶Ⅱ抑制HepG2细胞生长

糖酵解过度活跃是肿瘤细胞能量代谢的显著特征。抑制过度糖酵解已经成为一种新的癌症疗法。重组荞麦胰蛋白酶抑制剂 (recombinant buckwheat trypsin inhibitor, rBTI)可以通过上调磷酸酶及张力蛋白同源基因 (PTEN) 进而抑制HepG2细胞增殖。有关rBTI对肿瘤细胞能量代谢的影响仍未见报道。本研究中的MTT和ATP检测分析表明,rBTI以剂量依赖性方式抑制细胞活力及胞内ATP含量。qRT-PCR和Western印迹分析表明,rBTI处理HepG2细胞后,己糖激酶Ⅱ转录显著下调,但是糖酵解过程中的其他酶及葡萄糖转运蛋白基因在转录水平未发生显著变化,同时己糖激酶Ⅱ蛋白水平的表达也显著下调。酶活性分析也表明,rBTI能显著降低己糖激酶的活性。进一步分析表明, rBTI使细胞内PTEN转录及表达水平明显上调,己糖激酶Ⅱ转录和p-AKT,p-mTOR、己糖激酶Ⅱ的表达下调。当PTEN抑制剂phen存在时,可阻断rBTI诱导的己糖激酶 Ⅱ表达下降,表明rBTI能通过上调PTEN进而影响己糖激酶Ⅱ的表达。免疫荧光及Western印迹分析显示,rBTI作用后减弱了己糖激酶 Ⅱ在线粒体的定位,导致己糖激酶Ⅱ与线粒体电压依赖性阴离子通道蛋白 (voltage-dependent anion channel, VDAC) 分离,促使己糖激酶Ⅱ从线粒体转位到细胞质,降低糖酵解的效率。上述结果证明,rBTI对肿瘤细胞能量代谢的调控作用主要通过抑制PI3K/AKT信号通路,下调己糖激酶Ⅱ的表达并影响空间定位,进而抑制肿瘤细胞糖酵解过程,导致癌细胞生长受到抑制。     

顶头孢霉中己糖激酶编码基因Achka的功能研究

己糖激酶在真菌中广泛存在,参与葡萄糖磷酸化等生理过程。本文从头孢菌素产生菌顶头孢霉中克隆并鉴定了一个己糖激酶编码基因,命名为Achka。通过RT‐PCR证明Achka含有4个内含子,其推测的编码蛋白含有484个氨基酸,分子量为53.7k Da。在顶头孢霉中敲除Achka后发现,突变株在以果糖、蔗糖或甘露糖为唯一碳源的培养基上生长受到严重限制。我们在大肠杆菌中异源表达了Achka,并对表达的重组蛋白AcHKA进行了分离纯化。酶学动力学分析表明,AcHKA对果糖的最大反应速率要大于葡萄糖,但是却对葡萄糖有更高的亲和力。上述结果进一步证明AcHKA为己糖激酶,在顶头孢霉体内主要负责果糖、蔗糖和甘露糖等的代谢。     

miR-125a-5p通过靶向调控GAB2抑制乳腺癌细胞的迁移能力

miR-125a-5p可负性调节GAB2表达,抑制胶质瘤细胞的侵袭和转移。本研究旨在证明miR-125a-5p抑癌作用的普遍性,即miR-125a-5p是否可通过靶向抑制GAB2抑制乳腺癌细胞的迁移。荧光素酶实验结果显示,miR-125a-5p可特异识别GAB2的3′-UTR,抑制报告酶的表达。荧光定量PCR结果揭示,与正常乳腺上皮细胞MCF-10A比较,miR-125a-5p在乳腺癌细胞MDA231和MCF-7中的表达明显降低;与迁移能力相对较低的MCF-7细胞比较,miR-125a-5p在迁移能力较高的MDA231细胞中的表达量更低。Western 印迹结果证明,与空载体（对照）和anti-miR125a 5p转染细胞比较,转染miR-125a-5p明显抑制GAB2蛋白在乳腺癌细胞中的表达。Transwell结果显示,与空载体转染的对照细胞比较,转染miR-125a-5p的乳腺癌细胞穿过基质胶的细胞数明显减少;相反,转染anti-miR125a-5p的细胞穿过基质胶的细胞数却明显增多。上述结果提示,miR-125a-5p在正常的乳腺细胞中高表达,而在乳腺癌细胞中低表达,其表达水平与癌细胞的迁移能力和GAB2表达呈反向关系。本研究结果还提示,miR-125a-5p通过靶向负调控GAB2抑制乳腺癌细胞的迁移能力。总之,本研究证明,miR-125a-5p在肿瘤中发挥抑癌作用。     

miR-130a靶向G3BP2促进乳腺癌侵袭

目的 探讨基因预测软件Targetscan预测到的微小RNA-130a如何调节GTP酶激活蛋白SH3功能区结合蛋白2(GTPase activating protein SH3 binding protein 2,G3BP2)的表达,进而影响乳腺癌细胞的侵袭.方法 应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测正常乳腺上...     

小分子代谢物对黑曲霉己糖激酶和丙酮酸激酶的酶活调控

黑曲霉是柠檬酸的工业生产菌株,糖酵解中的3个不可逆反应是柠檬酸积累的重要调控节点,但己糖激酶和丙酮酸激酶的代谢调控研究相对较少,本研究旨在加深对己糖激酶和丙酮酸激酶代谢调控的认识.首先,将黑曲霉己糖激酶和丙酮酸激酶进行内源过表达,经GST亲和层析纯化后重组酶的比酶活分别为(4.86±0.14)U/mg和(1.83±0....     

枸杞己糖激酶基因LbHXK的克隆及表达分析

该研究以宁夏枸杞‘宁杞1号’果实为材料,利用RT PCR技术, 分离出枸杞己糖激酶基因LbHXK的全长序列(1 494 bp),该基因包含完整开放阅读框ORF,编码498个氨基酸,蛋白质分子量为53.88 kD ,理论等电点5.96; LbHXK基因编码的蛋白具有己糖激酶家族显著的特征,包含一个己糖激酶小亚基 (Gly91~Val228)和一个大亚基结构(Asn229~Asp476),该蛋白三级结构为V型,并且存在一个葡萄糖结合结构域;LbHXK与茄科烟草的同源性最高为93.36%。 实时荧光定量分析发现,LbHXK基因在不同组织均有表达,叶中最高,茎中次之,根中最低,且组织间差异不显著;随着果实发育LbHXK基因表达量呈先升后降的变化趋势,并在色变期(开花后约22 d)达到最高,随后到果实成熟期降至最低,且果实发育前中期显著高于后期。该研究结果为进一步探讨枸杞LbHXK基因的功能奠定了基础。     

LncRNA AL133467.1作为miR-661的ceRNA抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭

长非编码RNAs((long non-coding RNAs,lncRNAs)在多种肿瘤中异常表达并参与肿瘤的发生发展.然而,众多lncRNAs在肿瘤的表达及功能尚未完全阐明.本文通过分析TCGT数据库113例正常乳腺组织和1109例乳腺癌组织发现,LneRNA AL133467.1在乳腺癌组织中低表达,并与乳腺癌患者...     

己糖激酶介导小豆蔻明改善血管平滑肌细胞糖代谢的作用

目的：探讨小豆蔻明对胰岛素抵抗状态（IR）血管平滑肌细胞（VSMCs）糖代谢的影响及其作用机制。方法：采用高糖（2.5×l0-2 mol·L-1）高胰岛素（100 U·L-1）培养VSMCs,72 h后加入小豆蔻明培养48 h,观察培养液中葡萄糖消耗量、细胞内己糖激酶活性以及细胞增殖。结果：高糖高胰岛素培养72h后,血管平滑肌细胞糖消耗量降低（P〈0.01）;小豆蔻明能显著性增加IR细胞的平均糖消耗量（P〈0.01）,增强己糖激酶活性（P〈0.01）;同时明显抑制高糖高胰岛素引起的VSMCs增殖（P〈0.01）。结论：小豆蔻明能增强己糖激酶活性,改善IR状态下细胞糖代谢;同时抑制高糖高胰岛素刺激引起的VSMCs异常增殖。     

MiR-206与ANXA2的3′UTR靶向结合抑制乳腺癌侵袭

膜联蛋白A2（annexin A2,ANXA2）可促进人结直肠癌的侵袭和迁移。然而,ANXA2在乳腺癌中的作用以及调节机制尚缺乏系统的研究。本研究旨在探讨微小RNA-206（microRNA-206,miR-206）如何调节ANXA2基因的表达,进而影响乳腺癌的侵袭。通过基因预测软件TargetScan (TargetScan V5.2)找到与ANXA2的3′UTR区互补结合的miR-206。运用实时定量 PCR（qRT-PCR）检测不同乳腺癌细胞系中miR-206的表达水平,发现低侵袭性乳腺癌MCF-7细胞株miR-206 表达量明显高于高侵袭性乳腺癌细胞株MDA-231、MDA-435和T47D。运用转染技术将 miR-206 质粒及miR-206 抑制剂转入乳腺癌细胞系MDA-231后,qRT-PCR检测转染后各组细胞中miR-206的表达情况,结果显示转染成功。用Western印迹法检测各组细胞中ANXA2的表达情况,结果显示,miR-206负向调控ANXA2蛋白的表达。 qRT-PCR显示,过表达乳腺癌细胞内miR-206 后,ANXA2 mRNA基本没有变化。结果显示,miR-206是在翻译水平上影响ANXA2蛋白的表达。荧光素酶实验显示：miR-206能特异性地与ANXA2 mRNA的3′UTR结合,抑制其荧光素酶活性。Transwell侵袭实验检测各组细胞的侵袭能力。结果显示,过表达miR-206后,乳腺癌细胞体外侵袭能力明显减弱。综上所述,miR-206 通过靶向结合癌基因ANXA2 mRNA的3′UTR区,抑制ANXA2蛋白翻译,从而抑制了乳腺癌细胞的侵袭。因此,miR-206有望成为抑制乳腺癌侵袭与治疗乳腺癌的新靶点和生物学标记物。     

miR-148a promoted cell proliferation by targeting p27 in gastric cancer cells

Accumulating evidence has shown that miRNAs are aberrantly expressed in human gastric cancer and crucial to tumorigenesis. Herein, we identified the role of miR-148a in gastric cell proliferation. miR-148a knockdown inhibited cell proliferation in gastric cancer cell lines. Conversely, miR-148a overexpression promoted cell proliferation and cell cycle progression. p27, a key inhibitor of cell cycle, was verified as the target of miR-148a, indicating miR-148a might downregulate p27 expression to promote gastric cell proliferation. Moreover, we confirmed that miR-148a expression was frequently and dramatically downregulated in human advanced gastric cancer tissues, and observed a good inverse correlation between miR-148a and p27 expression in tumor samples. Thus, our results demonstrated that miR-148a downregulation might exert some sort of antagonistic function in cell proliferation, rather than promote cell proliferation in gastric cancer.     

胃癌相关mir-148a靶向调控胃泌素受体CCKBR

目的：研究胃癌相关miR-148a与胃泌素受体CCKBR的调控关系,并分析其调控结合位点。方法生物信息学预测人CCKBR 3’ UTR上miR-148a 的结合位点;利用 PCR扩增 miR-148a 前体构建真核表达载体;Northern Blot检测miR-148a真核表达载体的表达;构建CCKBR 3’UTR野生型和突变型荧光素酶报告载体,并利用双荧光素酶活性分析检测分析miR-148a对CCKBR基因表达的调控和结合位点;Western Blot检测miR-148a过表达对CCKBR蛋白表达的作用。结果在人CCKBR 3’UTR上找到3个miR-148a的潜在结合位点;miR-148a真核表达载体构建成功,转染胃癌细胞后可显著过表达;miR-148a通过人CCKBR 3’UTR上423bp处的结合位点抑制CCKBR的基因表达;miR-148a过表达显著抑制胃癌细胞中CCKBR的蛋白表达。结论 CCKBR是胃癌相关miR-148a的靶基因,miR-148a通过其3’UTR上的结合位点抑制CCKBR的基因表达和蛋白合成,提示miR-148a可能通过调控CCKBR参与胃癌的发生发展。     

东亚钳蝎氯毒素通过下调PKM2介导的有氧糖酵解抑制神经胶质瘤细胞的增殖活性

东亚钳蝎氯离子通道毒素(Buthus martensii Karshch chlorion channel toxin,BmK CT)是一类短链神经毒素,在体内和体外均能有效抑制神经胶质瘤细胞侵袭和增殖。然而,BmK CT抑制胶质瘤细胞增殖活性的机制尚不清楚。本研究采用代谢组学的方法探索BmK CT抑制人脑神经胶质瘤细胞增殖的分子机制。首先,通过蛋白质表达纯化获得带有谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase, GST)标签的BmK CT蛋白和GST蛋白。利用圆二色谱检测两种蛋白质均具有α-螺旋二级结构,并且融合蛋白质GST-BmK CT热稳定性较好。通过噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT)法检测GST-BmK CT对神经胶质瘤细胞(U251和A172)增殖的影响。结果显示,与GST处理组相比,1μmol/L GST-BmK CT处理组对U251细胞的抑制率更明显(U251细胞19±1.1 vs. 2.25±0.95,P<0.001, 48 h; A172细胞12±1.4 vs. 2.25±1.25,P<0.001, 48 h)。利用气相色谱-质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)分析鉴定出细胞内的63种代谢物,通过通路分析和聚类分析证实,GST-BmK CT处理影响神经胶质瘤细胞的有氧糖酵解。根据峰面积统计数据显示,GST-BmK CT处理降低胞内丙酮酸的含量。GST-BmK CT处理组相比GST组,明显下调胞外培养基的乳酸分泌(16.33±3.78 vs. 35.6±2.31,P<0.001, 48 h),葡萄糖消耗(2.04±0.09 vs. 2.64±0.04,P<0.05, 48 h)和胞内腺苷三磷酸(ATP)含量(633.79±0.001 vs. 5392.71±266.67,P<0.05, 48 h)。结果表明,GST-BmK CT通过下调胶质瘤细胞有氧糖酵解水平降低ATP的生成。实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹结果显示,GST-BmK CT降低U251细胞丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2, PKM2)在转录水平和翻译水平的表达,进一步发现GST-BmK CT通过下调低氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)降低PKM2在转录水平的表达。以上结果表明,BmK CT通过下调HIF-1α的表达,降低PKM2介导的有氧糖酵解从而抑制神经胶质瘤细胞的增殖活性。     

miR-148a在5-aza诱导间充质干细胞心肌样分化中的调控作用及机制

目的：探讨miR-148a在5-aza诱导人骨髓间充质（hMSCs）成心肌样分化中的表达及miR-148a对hMSCs体外成心肌样分化的生物学作用。方法：免疫荧光检测5-aza诱导hMSCs分化后心肌细胞特异性标志物α-MHC表达水平;qRT-PCR和Western blot分别检测miR-148a和DNMT1在hMSCs成肌样分化中的表达水平。利用Lipofectamine TM 2000将miR-148a mimics和miR-148a inhibitor分别瞬时转染hMSCs,Western blot检测心肌细胞特异性标志物α-MHC的蛋白表达水平。利用生物信息学技术预测miR-148a的靶基因结合位点利用双荧光素酶报告基因系统鉴定其对靶基因3'UTR的结合序列。通过DNMT1 shRNA和miR-148a inhibitors共转到hMSCs中,研究miR-148a在hMSCs成心肌样分化中的调控作用。结果：hMSCs经5-aza诱导分化后,心肌细胞特性标志物α-MHC蛋白水平明显上调。miR-148a在hBMSCs成肌样分化中显著性增加（P<0.01）,DNMT1表达水平显著降低。过表达miR-148a能提高hBMSC中心肌细胞特异性标志物α-MHC表达水平,而抑制miR-148a则能降低其水平（P<0.01）。DNMT1沉默可以阻断miR-148a对hMSCs的诱导成肌样分化作用。结论：miR-148a在hMCCs成肌样分化中表达上调,通过靶定和调控DNMT1基因的表达,并对hMSCs心肌向分化具有正向调控作用。     

SB-431542抑制乳腺癌细胞BT-549的增殖和侵袭及其机理研究

肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的最主要原因,TGF-β超家族成员Nodal分子被证实参与肿瘤细胞的增殖和转移,因而基于Nodal信号为靶标开展抗肿瘤研究成为可能。该研究应用Western blot检测乳腺癌细胞株BT-549、T-47D、MCF-7、SK-BR-3和MDA—MB-231中的Nodal和基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）的表达水平,发现它们在BT-549细胞中表达量最高。然后采用不同浓度_Nodal信号抑制剂SB．431542（1-50μmol／L）处理BT-549细胞48h,利用MTT法揭示20～50gmol／L的SB-431542抑制该细胞增殖。进一步利用细胞划痕和Transwell实验证明,10μmol／L的SB-431542可抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭。最后,通过明胶酶谱和Westernblot显示,10～30gmol／L的sB．431542可剂量依赖性地抑制MMP-2的表达和活性。上述结果说明,SB-431542通过阻断Nodal信号通路可效抑制乳腺癌细胞BT-549的增殖、迁移和侵袭,其作用机制可能与降低MMP-2的表达和活性有关。     

Elevated Hexokinase II Expression Confers Acquired Resistance to 4-Hydroxytamoxifen in Breast Cancer Cells

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Highlights

• •LC-PRM-based targeted kinome analysis led to the quantification of 315 kinases in parental and tamoxifen-resistant MCF-7 breast cancer cells.
• •Hexokinase 2 and mTOR were up-regulated in tamoxifen-resistant MCF-7 cells, which was accompanied with elevated glycolysis rate.
• •Augmented expression of HK2 promotes autophagy through inhibition of the mTOR-S6K signaling pathway and results in resistance of MCF-7 cells to tamoxifen.
• •HK2 is a potential drug target for overcoming tamoxifen resistance.