一株不对称水解N-癸酰草铵膦生产L-草铵膦菌株的筛选及催化性质研究

从活性污泥样品中分离得到一株能不对称水解(D,L)-N-癸酰草铵膦的革兰氏阴性菌。经过16S r DNA测序分子生物学鉴定,命名该菌株为Pseudomonas sp. zjut126。当(D,L)-N-癸酰草铵膦浓度为8 g/L,湿菌体(含水75%):N-癸酰草铵膦=1∶1(w/w),反应24 h,产物L-草铵膦得率为16. 3%,eep 95%。该菌体催化的最适温度为30℃,在温度40℃以下催化稳定性较好。最适p H为7,pH在6～8之间催化稳定性较好。加入异丙醇有利于N-癸酰草铵膦的溶解,但对细胞催化活性有明显的抑制作用。建立了一条利用Pseudomonas sp. zjut126细胞作催化剂拆分(D,L)-N-癸酰草铵膦制备L-草铵膦的工艺路线,第一步先将(D,L)-草铵膦化学酰化得到(D,L)-N-癸酰草铵膦,然后用菌株选择性水解(D,L)-N-癸酰草铵膦生成L-草铵膦。将未反应的(D)-N-癸酰草铵膦与L-草铵膦进行分离,终产品L-草铵膦的含量是92. 0%,ee值为95. 2%。     

除草剂草铵膦对转基因抗草铵膦棉花生长发育的影响

【背景】草铵膦是继草甘膦之后又一种高效、广谱、低毒的非选择性除草剂,有望成为我国转基因抗除草剂棉花的主要靶标之一。目前,在抗草铵膦棉花的不同生育期使用草铵膦是否影响棉花生长发育尚不清楚。【方法】分别在抗草铵膦棉花子叶期、3~4片真叶期、现蕾期、盛花期喷施草铵膦,单次施药量分别为900和1800 g·hm-2,每个处理小区面积25.6 m2。分析草铵膦对花粉育性、棉花生长、产量及纤维品质的影响。【结果】喷施草铵膦对棉花盛花期的花粉活力、株高、茎直径、产量因子、纤维品质等各项参数均无显著性影响,在子叶期使用1800 g·hm-2的高剂量浓度处理时,籽指水平显著低于空白对照处理。【结论与意义】转基因抗草铵膦棉花对900、1800g·hm-2的草铵膦具有较好的耐受性。本研究为转基因抗草铵膦棉花的环境安全性评价提供了依据。     

草甘膦对茶树叶片主要生化成分的影响

以金观音茶树为试材,将草甘膦定量施于栽培基质,通过观察叶片的表观药害,并采用超高效液相串联质谱方法测定草甘膦施用前(0天)和施用后(7天和33天)叶片中的农药残留(草甘膦及氨甲基膦酸)及生化成分(游离氨基酸、儿茶素和生物碱)的含量变化,从而科学地评估草甘膦的使用对茶叶质量安全的影响.结果表明:草甘膦施用33天,茶树叶片...     

抗草铵膦转基因水稻品种的快速检测方法的比较

用种子萌发生测法和分子检测法分别检测抗草铵膦转基因水稻品种 ,比较这两种方法的优劣。种子萌发生测法以芽长作为指标优于根长 ,草铵膦处理浓度可在 10mg/L～ 10 0mg/L之间。分子检测用引物对 5′ ACCATCGTCAACCACTACATCG 3′和 5′ GCTGCCAGAAACCCACGTCAT 3′或 5′ ACCATCGTCAAC CACTACATCG 3′和 5′ GAGGTCGTCCGTCCACTCCTG 3′均可扩增导入的bar基因的特异DNA片段。种子萌发生测法具有简单、易操作特点 ,而分子检测法则具有快速、专一性强、灵敏度高等特点。     

抗除草剂bar基因与EPSPS基因在转基因甘蔗中的应用研究

通过农杆菌介导法,分别将bar基因和EPSPS基因导入到甘蔗中,分别获得了抗草铵膦和草甘膦两种除草剂的转基因甘蔗。通过直接喷洒田间施用浓度的草铵膦和草甘膦除草剂,证明了转基因甘蔗T0、T1代、宿根1代和宿根2代外源基因遗传稳定,且均具有稳定的耐除草剂的功能。因此转耐除草剂基因的甘蔗,可以与转耐除草剂基因的玉米、大豆、油菜和棉花一样,有广阔的应用前景。     

HPLC-DAD和LC/MS/MS测定豆奶中三聚氰胺

目的：建立二极管阵列高效液相色谱仪和三重四级杆液质联用仪对豆奶中三聚氰胺的测定方法。方法：采用三氯乙酸和乙腈为提取剂、蛋白质为沉淀剂,提取液过净化柱纯化。结果：三重四级杆液质联用法对三聚氰胺的检出限为0-001 5 mg/kg,标准曲线在0-01~0-5 μg/mL范围内,R2为0-999 8,线性良好,再回收率为85 %~89 %,适用于检测低浓度的样品;二极管阵列高效液相色谱法检出限为0-024 mg/kg,标准曲线在0-5~100 μg/mL范围内,R2为0-999 9,线性良好,回收率为83 %~91 %,可以快速地对高浓度样品进行筛查。结论以上两种检测方法结合使用,可检测0-01~100 mg/kg的三聚氰胺含量,极大地拓宽了检测范围。     

番茄红素β-环化酶基因的玉米转化及 后代遗传分析

利用农杆菌介导法将番茄红素β-环化酶基因(Lycb)转入由玉米自交系天塔五号植株,分析基因在T0转化及后代的遗传情况,结果表明,在27株T0转基因植株中,PCR初步检测后8株呈阳性;将T1代转基因植株以株系为单位用200mg/L草铵膦抗性筛选后,收获抗性植株种子。T2代转基因植株进一步进行PCR、RT-PCR和田间草铵膦涂抹检测,结果表明,PCR、RT-PCR为阳性的6个株系植株均具有草铵膦抗性。选取6株阳性植株提取叶片总类胡萝卜素,经HPLC分析其β-胡萝卜素含量显著高于野生型,表明目的基因Lycb成功的转入玉米,并得到了稳定遗传。     

抗草铵膦除草剂转基因油菜新种质的创制及鉴定北大核心CSCD

草铵膦是一种在世界范围内广泛使用的内吸型除草剂。目前,我国还未研发出具有自主知识产权的抗草铵膦除草剂油菜品种。本研究通过油菜下胚轴遗传转化方法成功将1个新型草铵膦抗性基因Syn1-RePAT转化到甘蓝型油菜中,通过筛选获得了27株阳性单株。利用Southern blot技术筛选出其中的单拷贝T-DNA插入株系,并通过后代分离比检测对重要株系进行了拷贝数验证。利用Inverse-PCR技术对OV40-7、OV40-15、OV40-16和OV40-17等转化体进行T-DNA侧翼序列分析与比对,分离获得了各转基因株系的插入位点信息。对不同转化体株系设计特异性引物,通过PCR技术检测外源基因序列在T1~T3代材料的整合稳定性。RT-PCR和qRT-PCR表达分析证实,Syn1-RePAT转基因在多个转化株系的不同世代稳定超量表达。对T1代转化体进行功能鉴定,各转化体对草铵膦具有良好的抗性,至少可耐受6倍田间推荐施用剂量的草铵膦。本研究所创建的新型抗草铵膦油菜种质资源极具应用前景,为我国抗草铵膦良种培育工作提供了有力支持。     

几种除草剂对薇甘菊的防控效果

【背景】薇甘菊是一种外来入侵的恶性杂草,对当地农、林业造成了严重的危害。【方法】研究了草甘膦、氨氯吡啶酸、甲嘧磺隆、噻吩磺隆、苯磺隆、百草枯、五氟磺草胺、单嘧磺隆和单嘧磺脂9种除草剂对薇甘菊的化学防治,调查各药剂对薇甘菊的植株鲜重抑制率、叶片覆盖度和抑花率。【结果】氨氯吡啶酸25～100gai.hm-2、草甘膦1538～2306gai.hm-2、甲嘧磺隆100～400gai.hm-2、百草枯750、1125gai.hm-2、五氟磺草胺125gai.hm-2、噻吩磺隆11.25～33.75gai.hm-2和单嘧磺脂15～60gai.hm-2对薇甘菊营养生长控制效果较好。其中,百草枯短时间有效,草甘膦、五氟磺草胺、单嘧磺脂、单嘧磺隆、氨氯吡啶酸和甲嘧磺隆对薇甘菊的抑花率较高,苯磺隆和单嘧磺隆基本无效,且9种药剂对橡胶树均未表现出药害。【结论与意义】适当降低氨氯吡啶酸、甲嘧磺隆、草甘膦、五氟磺草胺、噻吩磺隆和单嘧磺脂的浓度可以保持薇甘菊营养生长而扼制种子蔓延。本研究首次发现五氟磺草胺、噻吩磺隆和单嘧磺脂对薇甘菊有良好的抑制效果。     

两种新型农药对斜生栅藻(Scenedesmus obliquus Kütz.)的毒性研究

LY-04和WSQIF是由华中师范大学农药所合成的两种新型有机磷农药,LY-04属于α-氧代膦酸衍生物,WSQIF属于芳氧基乙酰氧基烃基膦酸脂.选用斜生栅藻(Scenedesmus obliquus Kütz.)作为实验生物,通过显微计数测定藻细胞的密度以计算LY-04和WSQIF对斜生栅藻24 h、48 h、72 h、96 h的半效应抑制浓度(EC50),研究其对斜生栅藻的毒性效应.结果表明以丙酮为溶剂时,每隔24 h取样,测得 LY-04对斜生栅藻的48 h、72 h、96 h的EC50值分别为2 942.5 mg/L、239.7 mg/L和65.0 mg/L,而WSQIF的24 h、48 h、72 h、96 h的EC50值分别为15.9 mg/L、53.0 mg/L、98.0 mg/L和28.8 mg/L.LY-04和WSQIF分别作为杀虫剂和除草剂而研制,经活体研究表明,LY-04具有较强的杀虫活性,WSQIF则具有很强的除草活性,所得EC50值基本符合设计结果.根据毒性分级标准,LY-04和WSQIF的EC50值远大于3 mg/L,其对非靶生物中的水生藻类都属于低毒,可推广应用.     

HPLC法测定头孢克肟的含量

采用高效液相色谱法测定头孢克肟的含量 ,HPL C法 C1 8为填充柱 (6 .0× 15 0 mm ) ,以氢氧化四丁铵 -乙腈 (34 0 :16 0 )为流动相 ;检测波长为 2 5 4nm。结果 :线性范围为 0 .144 mg/ ml～ 0 .2 80 mg/ ml(r=0 .9999) ,平均回收率为 99.80 %,RSD=0 .2 0 %(n=3)。本法具有柱效高、经济等优点 ,优于 USP法。     

新型柱前衍生试剂分析草甘膦的高效液相色谱研究

以2,5-二甲氧基苯磺酰氯(DMOSC)为柱前衍生化试剂,建立了柱前衍生草甘膦的紫外检测反相高效液相色谱法,并优化了衍生化条件,得最佳条件:衍生温度35℃,时间15 min,pH 10.0,草甘膦与DMOSC的摩尔比为1∶6。HPLC分析条件:采用Kromasil C18柱,流速1.0 mL/min,柱温30℃,检测波长220 nm,流动相为甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲溶液(0.02 mol/L、pH 5.5),三者的体积比为15∶5∶80。结果表明:草甘膦质量浓度在5~100μg/mL范围内线性关系良好,相关系数为0.996 2,检测限为0.067μg/mL。实验表明该方法反应条件温和,灵敏度高,衍生产物稳定。     

6种抗真菌药物对皮肤癣菌体外抗真菌活性评价

目的评价6种抗真菌药物对皮肤癣菌体外抗真菌活性。方法采用CLSI推荐的M-38P方案对分离自足癣和体、股癣的皮肤癣菌进行联苯苄唑、硝酸舍他康唑、硝酸异康唑、盐酸布替萘芬、阿莫洛芬、利拉萘酯6种抗真菌药物敏感性测定。结果联苯苄唑MIC范围为0．03—4mg／L,MIC50为1mg／L,MIC90为2mg／L。硝酸舍他康唑分别为0．06—16mg／L、0．5mg／L和2mg／L。硝酸异康唑分别为0．03～2mg／L、0．25mg／L和0．5mg／L。盐酸布替萘芬分别为0．0025～0．04mg／L、0．01mg／L和0．02mg／L。阿莫罗芬分别为0．01～〉0．08mg／L、0．02mg／L和0．04mg／L。利拉萘酯分别为0．004—0．625mg／L、0．039mg／L和0．312mg／L。结论6种抗真菌药物对皮肤癣菌均有强的抗菌活性,由强到弱依次为布替萘芬、阿莫罗芬、利拉萘酯和咪唑类药物。     

膦酸天然产物中碳磷键生物合成机制的研究进展

膦酸天然产物是指生物体产生的结构中含有碳磷键的小分子化合物,它因为与细胞中的羧酸和磷酸化的化合物结构相似,常作为某些生命活动必需的酶抑制剂,表现出良好的生物抑制活性。已知的膦酸天然产物碳磷键合成机制可以分为四类:磷酸烯醇式丙酮酸变位酶(PepM)催化类、磷甲基转移酶(PhpK)催化类、由S-2-羟基丙基膦酸环氧化酶(HppE)催化类和一种未知的碳磷键合成机制。本文就膦酸天然产物中碳磷键生物合成机制进行综述。     

高效液相色谱-柱后光化学衍生法测定变性淀粉中黄曲霉毒素含量的研究

本文采用高效液相色谱-柱后衍生法对变性淀粉中的黄曲霉毒素G2、G1、B2和B1含量进行测定.样品采用乙腈-水(84:16,v/v)提取,经免疫亲和柱净化,C18色谱柱分离,以乙腈-甲醇-水(10:30:60,v/v)为流动相进行洗脱,用HPLC光化学衍生-荧光检测器检测样品含量.结果表明,4种黄曲霉毒素的标准曲线线性均...     

以草甘膦为筛选标记的大豆转基因体系的建立及抗除草剂转基因大豆的培育

抗草甘膦转基因大豆能显著提高大豆生产效率,具有重大的应用前景.本实验室前期研究建立了农杆菌介导、草胺膦为筛选剂的大豆转基因体系,转化效率在4%以上.在此基础上,利用G6-EPSPS和G10-EPSPS 2个具有自主知识产权的草甘膦抗性基因,通过优化转化体系,成功建立了以草甘膦为筛选剂的大豆遗传转化体系,转化效率达1%以上.浓度梯度实验发现,当草甘膦的筛选浓度为100 mg/L时,虽然丛生芽的再生率下降了50%～60%,但最终转化效率不受影响.进一步通过基因表达分析、Western blot、Southern blot和除草剂抗性鉴定等方法对转基因大豆进行了分子检测和验证,最后获得了分子特征明确、对草甘膦抗性稳定的抗草甘膦转基因大豆后代.结果对国内抗草甘膦转基因大豆转基因方法研究及抗除草剂新品种选育具有意义.     

高效液相色谱法测定罗汉果根中两个降三萜配糖体

建立了高效液相色谱测定罗汉果根中两个结构新颖的降三萜糖苷,罗汉果酸苷乙Ⅱ(Siraitic acidⅡB)和罗汉果酸苷甲Ⅱ(Siraitic acidⅡA)含量的方法。色谱条件:色谱柱:ZORBAX SB-C18柱(4.6mm×150mm,5μm);柱温:25℃;流动相:乙腈-水(梯度洗脱:0→4min:35%乙腈;4→16min:35%→45%乙腈);流速:0.5mL/min;检测波长:230nm;进样量:10μL。结果表明,罗汉果酸苷乙Ⅱ在0.05～0.3mg/mL,罗汉果酸苷甲Ⅱ在0.05～0.25mg/mL之间线性关系良好。该方法稳定,精密度、重现性好,且样品处理简单,提取与检测时间短。     

2种HPLC-柱后衍生化-荧光检测法测定远志中黄曲霉毒素的比较

对远志中测定黄曲霉毒素的2种柱后衍生化方法(碘衍生化和光化学衍生化)进行分析比较。样品经过免疫亲和柱净化，HPLC-柱后衍生化-荧光检测器检测；采用C₁₈(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱，荧光检测。柱后衍生化系统：(1)碘衍生化法，以甲醇-乙腈-水(25∶20∶55)为流动相；衍生溶液为0.05%碘溶液，流速为0.3 m L·min^-1，衍生反应温度为70℃；(2)光化学衍生化法，以甲醇-乙腈-水(35∶15∶50)为流动相。碘衍生化方法中，黄曲霉毒素B₂、G₂在3.8～19 pg范围内线性关系良好，B₁在10.4～52 pg范围内线性关系良好，G₁在10.8～54 pg范围内线性关系良好；在光化学衍生化方法中，黄曲霉毒素B₂、G₂在1.9～45.6 pg范围内线性关系良好，B₁在5.2～124.8 pg范围内线性关系良好，G₁在5.4～129.6 pg范围...     

两种新型农药对斜生栅藻(Scenedesmus obliquus Ktz.)的毒性研究

LY-04和WSQIF是由华中师范大学农药所合成的两种新型有机磷农药,LY-04属于α-氧代膦酸衍生物,WSQIF属于芳氧基乙酰氧基烃基膦酸脂。选用斜生栅藻(ScenedesmusobliquusKütz.)作为实验生物,通过显微计数测定藻细胞的密度以计算LY-04和WSQIF对斜生栅藻24h、48h、72h、96h的半效应抑制浓度(EC50),研究其对斜生栅藻的毒性效应。结果表明:以丙酮为溶剂时,每隔24h取样,测得LY-04对斜生栅藻的48h、72h、96h的EC50值分别为2942.5mg/L、239.7mg/L和65.0mg/L,而WSQIF的24h、48h、72h、96h的EC50值分别为15.9mg/L、53.0mg/L、98.0mg/L和28.8mg/L。LY-04和WSQIF分别作为杀虫剂和除草剂而研制,经活体研究表明,LY-04具有较强的杀虫活性,WSQIF则具有很强的除草活性,所得EC50值基本符合设计结果。根据毒性分级标准,LY-04和WSQIF的EC50值远大于3mg/L,其对非靶生物中的水生藻类都属于低毒,可推广应用。     

溴化1-丁基,3-(3-氨丙基)咪唑用于羧基衍生:潜在应用于肽段的高灵敏度质谱鉴定

本文发展了阳离子衍生化试剂溴化1-丁基,3-(3-氨丙基)咪唑(BAPI),并应用于肽段的羧基衍生化.以合成肽段RVYVHPI(RI-7)作为样品,其衍生化标记效率可接近100%.此外,肽段衍生物在含0.1%的三氟乙酸水溶液或乙腈/水(体积比1︰1)溶液中至少可稳定保存1周.进一步研究了BAPI衍生对肽段离子化效率的影响.结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析,模式肽段RI-7的检测灵敏度可提高42倍以上,优于商品化哌嗪试剂的衍生效果.此外,衍生肽段在电喷雾质谱(ESI MS)中的离子带电荷数也得到显著提高.上述结果表明,BAPI是一种具有潜在优势的衍生化试剂,有望应用于肽段的高灵敏度质谱鉴定研究.