人胚胎干细胞高效分化为巨核细胞模型的建立

人胚胎干细胞具有无限增殖潜能,且能够分化为包括巨核细胞在内的大多数的成熟血细胞。因此,为解决临床治疗血小板来源不足而建立一种由人胚胎干细胞高效分化获得成熟巨核细胞的分化模型具有重要应用前景。该文利用人胚胎干细胞与m AGM-S3基质细胞系共培养进行早期造血前体细胞的定向分化,并在分化第14 d获得大量"卵石样"造血前体细胞(CD43+细胞、CD45+细胞)。将"卵石样"造血前体细胞分离后,用无血清培养基分阶段添加SCF、TPO、IL-6、IL-3、FLt-3、IL-11等细胞因子进行巨核细胞定向诱导分化。结果显示,在分化的第3 d,CD41a+细胞比例可高达48.5%,CD42b+细胞比例可高达30.0%。对分化第6 d的细胞进行Wright-Giemsa染色,可见形态典型的巨核细胞。综上所述,该研究初步建立了一种人胚胎干细胞高效分化为巨核细胞的模型,为体外获得大量巨核细胞奠定了基础。     

人胚胎干细胞程序降温保存的实验研究

本文采用升降式程序降温仪对人胚胎于细胞进行了程序降温保存,并探讨和比较了降温速率、置核温度、保护剂和投入液氮前温度对冻存复苏后胚胎干细胞的存活率、活力及分化特性的影响。结果表明:采用Me_2SO 血清 DMEM(体积比为1∶3∶6)的保护剂,从0℃开始,以0.5℃/min的速率对细胞悬液降温;至-10℃时对其进行置核,并于-35℃时将其快速投入液氮中保存,复温后效果最佳。冻存复温后细胞存活率可达81.8%,复苏后的胚胎干细胞形态和集落生长方式都与冻前的生长形态相同,且胚胎干细胞标志之一碱性磷酸酶(AKP)反应阳性,同时染色体组型仍正常。     

一种新的人胚胎干细胞自身来源的滋养层支持其体外培养

摘要: 通过人胚胎干细胞(Human embryonic stem cells, hESCs)经体内分化获取间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)为人胚胎干细胞提供一种新的滋养层。将约5×106个hESCs注射入重症免疫联合缺陷小鼠形成畸胎瘤, 8周后再从畸胎瘤中分离MSCs并鉴定, 将MSCs作为hESCs的滋养层细胞, 并检测和观察hESCs的生长情况、细胞特性和分化能力。从畸胎瘤中获得了纯度较高的具有类似骨髓来源的MSC特性的细胞群, 其形态相似、表面抗原标志相似(CD34和CD45阴性, CD29、CD49b、CD105、CD73和CD90阳性), 经诱导可以向成骨细胞和成脂细胞分化。将hESCs在MSCs滋养层细胞上传代培养10代以上, hESCs依然具有正常的细胞形态, 反转录PCR证实其特异转录因子Oct4、Nanog的表达, 干细胞表面标记SSEA-1显示为阴性, SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81显示为阳性, 碱性磷酸酶染色显示为阳性, 并且核型正常。体外EB形成和体内畸胎瘤形成证明了其全能性。因此来源于hESCs本身的MSCs可以被用来作为支持胚胎干细胞生长并维持其未分化状态的滋养层细胞。     

人胚胎干细胞分化为神经干细胞诱导方法的对比研究

目的探讨人胚胎干细胞分化为神经干细胞过程中,经拟胚体（embryonic body,EB）法和直接分化法的不同效率。方法人胚胎干细胞常规培养消化后,分为两组：A组,经EB法分化;B组,添加noggin和ITSFn直接分化法。倒置相差显微镜观察细胞形态变化,RT-PCR检测细胞各阶段标志物,免疫荧光及流式细胞仪观察两组细胞Nestin阳性细胞率。神经干细胞继续分化,免疫荧光、RT-PCR法检测MAP2、GFAP表达。结果RT-PCR检测到OCT4、nestin表达。B组nestin阳性细胞率明显高于A组,差异有统计学意义（P〈0.01）,且诱导周期短于A组。神经干细胞继续分化,得到不同数量的神经元和胶质细胞,MAP2、GFAP分别阳性。结论在体外采用定向分化诱导,人胚胎干细胞不经EB,可直接定向分化为神经干细胞,且诱导效率比EB法高。因此直接分化法是一种经济实用的诱导方法。     

人胚胎干细胞的体外定向分化

人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs）由囊胚期胚胎内细胞团分离培养获得,具有保持未分化状态的无限增殖能力。hESCs具有多向分化潜能,在体内和体外均可分化形成所有三个胚层（外胚层、中胚层、内胚层）的衍生物。hESCs一般在鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast,MEF）饲养层上培养和扩增。为了优化培养条件,目前人们已发展了多种人类细胞饲养层和无饲养层、非条件培养基体系。hESCs可以在体外定向诱导分化为多种细胞类型,为揭示人胚早期发育机制和发展多种疾病的细胞移植治疗奠定了基础。hESCs可以在体外进行遗传修饰,将有助于揭示特定基因在发育过程中的调控和功能。对hESCs的深入研究将极大地推动医学和生命科学的进展,并将最终应用于临床,造福人类。     

人胚胎干细胞培养体系的研究进展

人胚胎干细胞具有广泛的研究前景,建立一个理想的人胚胎干细胞培养系统是利用它的前提.较详细地对目前关于人胚胎干细胞培养体系的研究进展、一些细胞因子对人胚胎干细胞的作用和影响以及体外长期培养对人胚胎干细胞核型的影响进行了综述.     

人胚胎干细胞优化培养的进展

人胚胎干细胞(humanembryonicstemcell,hEScell)是来源于着床前人囊胚内细胞团(innercellmass,ICM)的、具有自我更新能力和分化全能性的细胞。由于hES细胞能在一定条件下分化成三个胚层来源的各种细胞,所以它具有重要的基础研究价值和巨大的临床应用前景,可应用于人早期胚胎发育过程的研究、药物毒物筛选、细胞移植治疗、基因治疗等领域。目前,世界上已经建立了多株hES细胞系,最早建立的hES细胞系是生长在小鼠胚胎成纤维(mouseembryonicfibroblast,MEF)细胞上的,培养体系中含血清等动物源性成分,这些成分可能引起动物源性病原体或支原体的污染,从而限制了hES细胞的临床应用。近年来,科学家们在优化hES细胞的体外培养体系方面做出了很大的努力并取得了长足进展,已经开始采用无血清、无饲养层细胞、无外源性蛋白、成分明确的培养体系进行hES细胞建系及培养,从而在一定程度上解决了上述问题。本文主要从饲养层细胞、无饲养层培养体系、培养基质、细胞因子等方面综述了hES细胞建系和维持其未分化状态的优化培养所取得的最新进展和存在的问题。     

利用逆转录病毒载体建立SMAD2稳定干扰的人胚胎干细胞系

目的:建立SMAD2稳定干扰的人胚胎干细胞系。方法:利用包装细胞获得重组的逆转录病毒,感染人类胚胎干细胞,为干扰组ShSMAD2、载体组VECTOR和野生型组WT;经荧光筛选获得阳性克隆;Realtime-PCR检测SMAD2 mRNA的表达。结果:带GFP荧光标记的SMAD2特异性shRNA逆转录病毒感染人类胚胎干细胞后,获得稳定干扰SMAD2表达的人胚胎干细胞系。经检测shSMAD2组SMAD2 mRNA表达较VECTOR和WT组明显降低,VECTOR和WT组之间无明显差异。结论:通过SMAD2特异性shRNA逆转录病毒载体构建了稳定干扰SMAD2的人类胚胎干细胞。     

人胚胎干细胞向生殖细胞分化的研究进展

小鼠胚胎干细胞体外已成功诱导分化为配子细胞,人胚胎干细胞理论上也具备分化为生殖细胞的潜能。本文从影响人胚胎干细胞体外向生殖系分化的基因调控和干细胞小生境（niche）方面进行综述,并指出胚胎干细胞在生殖医学及不孕治疗中的研究方向和应用前景。     

胚胎干细胞向造血干/祖细胞定向诱导分化的研究进展

胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)是指由胚胎内细胞团(inner cell mass,ICM)细胞经体外抑制培养而筛选得到的细胞,具有无限增殖潜能,在体外可以向造血细胞分化,有可能为造血干细胞移植和血细胞输注开辟新的来源．此外,ES细胞向造血干/祖细胞的定向诱导分化也为阐明哺乳动物造血发育的细胞和分子机制提供了良好的体外模型．对ES细胞向造血干/祖细胞定向分化的研究进展进行了综述．     

人孤雌胚胎干细胞在人包皮成纤维细胞饲养层上的生长状态

人孤雌胚胎干细胞(human parthenogenetic embryonic stem cells,hPESCs)体外培养常需饲养层的支持以保持干细胞特性.通过原代培养获得人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblasts,hFFs)并将其制备成饲养层,使hPESCs在hFFs上进行体外培养及传代.倒置显微镜下观察hPESCs的生长状态,采用碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP)检测、核型分析和体内分化实验研究hPESCs的生物学特性及分化潜能,以探索hFFs能否长期支持hPESCs的生长并维持其未分化状态.经原代培养成功获得了hFFs,通过形态学观察和免疫细胞化学染色鉴定符合成纤维细胞的生物学特性;在hFFs上生长的hPESCs克隆形态规则,不易分化;已成功在体外培养20余代,hPESCs仍能够保持基本生物学特性和正常核型,在裸鼠体内可形成含有3个胚层组织成分的畸胎瘤.作为人源性饲养层,hFFs可长期支持hPESCs的生长并维持其未分化状态.     

Monitoring the Differentiation and Migration Patterns of Neural Cells Derived from Human Embryonic Stem Cells Using a Microfluidic Culture System

Microfluidics can provide unique experimental tools to visualize the development of neural structures within a microscale device, which is followed by guidance of neurite growth in the axonal isolation compartment. We utilized microfluidics technology to monitor the differentiation and migration of neural cells derived from human embryonic stem cells (hESCs). We co-cultured hESCs with PA6 stromal cells, and isolated neural rosette-like structures, which subsequently formed neurospheres in suspension culture. Tuj1-positive neural cells, but not nestin-positive neural precursor cells (NPCs), were able to enter the microfluidics grooves (microchannels), suggesting that neural cell-migratory capacity was dependent upon neuronal differentiation stage. We also showed that bundles of axons formed and extended into the microchannels. Taken together, these results demonstrated that microfluidics technology can provide useful tools to study neurite outgrowth and axon guidance of neural cells, which are derived from human embryonic stem cells.     

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell populations. These cultures contain the cells of interest, but are also contaminated with undifferentiated ESCs, non-neural derivatives and other neuronal subtypes.  This limits their use in in vitro and in vivo applications, such as in vitro modeling for drug discovery or cell replacement therapy. To help overcome this, reporter cell lines, which offer a means to visualize, track and isolate cells of interest, can be engineered. However, to achieve this in human embryonic stem cells via conventional homologous recombination is extremely inefficient. This protocol describes targeting of the Pituitary homeobox 3 (PITX3) locus in human embryonic stem cells using custom designed zinc-finger nucleases, which introduce site-specific double-strand DNA breaks, together with a PITX3-EGFP-specific DNA donor vector. Following the generation of the PITX3 reporter cell line, it can then be differentiated using published protocols for use in studies such as in vitro Parkinson’s disease modeling or cell replacement therapy.     

人胚胎干细胞培养建系及其应用

简要概述了自1998年首次建立hES细胞系以来近6－7年国内外的现况、分离培养建系、鉴定标准和冻存技术发展、定向诱导分化及其应用等方面的研究进展。     

人类胚胎干细胞系H9培养和分化中细胞异质性的发现

目的:在人类胚胎干细胞系H9培养和分化过程中探讨该细胞系的异质性。方法:对人类胚胎干细胞系H9进行体外未分化培养和诱导分化,鉴定其多潜能性和分化状态;在诱导其向拟胚体细胞的分化过程中,检测多潜能相关基因及分化特异基因的表达情况。结果:发现多潜能相关基因(Oct4、SOX2和Nanog)和种系特异性基因(Cdx2、Bachurary、SOX1、Fgf5和AFP)并不限于分别在未分化细胞和分化细胞中表达。结论:提示H9细胞系在培养过程中的非基因异质性现象,为进一步认识胚胎干细胞的自我更新和多潜能性提供了有意义的参考。     

人胚胎干细胞向神经上皮祖细胞的诱导分化

人胚胎干细胞具有自我更新和多向分化潜能,是研究早期胚胎发育和细胞替代治疗的重要细胞来源.采用一种与小鼠成纤维细胞共培养的方法进行人胚胎干细胞的神经诱导,可产生高纯度的神经上皮祖细胞,其神经上皮特异性基因的表达有一定的时空性;诱导生成的神经上皮祖细胞具有增殖潜能并可分化为神经元和星型胶质细胞,是潜在的神经干细胞.人胚胎干细胞来源的神经上皮祖细胞为研究神经发育和神经诱导提供了新材料,也为神经系统疾病的细胞替代治疗提供了新的细胞来源.     

从人胚胎干细胞畸胎瘤中有效获取间充质干细胞和神经前体细胞

通过人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESC)体外分化方法和畸胎瘤形成可以分化获得多种成体细胞．但目前尚不清楚是否可以从hESCs畸胎瘤中分离某些特异性细胞．通过体外筛选方法,有效地从hESCs畸胎瘤中分离出神经前体细胞(neural progenitor cells,NPCs)和间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)．这种hESCs畸胎瘤来源的NPCs和MSCs与体内神经前体细胞和间充质干细胞有着相似的分子标记和特性,并具有进一步的分化潜能——分别可以诱导成为神经元、神经胶质细胞、脂肪细胞和骨骼细胞等．根据人胚胎干细胞畸胎瘤中含有不同分化阶段的外胚层、中胚层和内胚层的组织或细胞,认为人胚胎干细胞畸胎瘤可以作为另一个细胞来源以获取多种(包括人胚胎干细胞体外分化难以得到的)各种前体/干细胞和终末分化细胞．