巴西橡胶树HbCRK1的克隆及表达分析

钙离子依赖蛋白激酶相关激酶(CDPK-related kinase, CRK)在植物对生物和非生物胁迫抗性中具有重要作用。为了揭示CRK家族成员在橡胶树抗逆机制中的作用,本研究从巴西橡胶树品种热研7-33-97叶片中克隆了一个CRK基因,其推导氨基酸含有特征性STKc_CAMK结构域,命名为HbCRK1。该基因在树皮、花、叶片和胶乳中均有表达,在叶片中的表达量最高;在干旱、机械伤害、白粉菌侵染和激素处理下均显著上调。本研究结果表明HbCRK1受逆境反应诱导,参与橡胶树抗逆响应的生理和分子机制,为揭示HbCRK1基因的功能和橡胶树抗逆响应的研究提供理论指导。     

巴西橡胶树HbMKK4基因的克隆及表达分析

采用RACE技术,从橡胶树‘热研7-33-97’中克隆了1个促分裂原活化蛋白激酶的激酶(MKK)基因HbMKK4。该基因全长cDNA序列1 580bp,编码框1 059bp,编码352个氨基酸,含有S_TKc结构域,其编码蛋白的分子量为38.83kD,理论等电点为9.36。实时荧光定量PCR结果显示,HbMKK4在橡胶树的根、树皮、胶乳及叶片中均有表达。割胶、茉莉酸甲酯和乙烯利均能上调胶乳中HbMKK4基因的表达,基因相对表达量分别在割胶后2h、茉莉酸甲酯处理8h和乙烯利处理4h后达到最高。研究结果推测HbMKK4可能通过MAPK信号途径参与茉莉酸信号途径的响应,可能在天然橡胶生物合成调控中起关键作用。     

巴西橡胶树HbCMK基因的克隆及表达

根据植物CMK(4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol Kinase,CMK)的同源序列设计引物,通过RT-PCR结合RACE的方法在橡胶树中获得了与其相应的CMK基因,命名为HbCMK.序列分析表明HbCMK长1 415 bp,编码388个氨基酸,该氨基酸序列与长春花(Catharanthus roseus)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、甜菊(Stevia rebaudiana)、丹参(Salvia miltiorrhiza)、烟草(Nicotiana benthamiana)和水稻(Oryza sativa)的CMK相似性分别达到72.6%、72.5%、71.9%、70.9%、69.0%和66.9%.半定量RT-PCR结果显示,HbCMK的表达具有组织差异性,在愈伤组织中大量表达,在叶片和胶乳中微量表达,乙烯诱导胶乳HbCMK的表达,伤害对HbCMK的表达几乎没有影响.本实验结果为进一步了解MEP途径在橡胶树胶乳中的作用和天然橡胶生物合成的调控奠定了基础.     

巴西橡胶树 HbNAC1基因启动子的克隆及序列分析

NAC转录因子是植物特有的一类转录调控因子,在植物的生长发育、激素调节和境胁迫应答中具有重要的功能。为研究NAC转录因子在巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)抗逆胁迫中的功能,本项目组根据巴西橡胶树NAC转录因子-HbNAC1基因序列,通过Genome Walking方法从巴西橡胶基因组DNA中获得了长度为1861bp的HbNAC1基因的5’调控区片段,序列分析表明该段序列含有一个典型的真核生物核心启动子区域,转录起始位点T位于起始密码子上游52bp处。该启动子序列除了含有TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外,还具有茉莉酸响应元件以及大量光顺式作用元件和逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,这表明HbNAC1基因在橡胶树逆境胁迫应答过程具有重要功能,其启动子可能是一个光诱导型和组织特异性启动子。     

巴西橡胶树一个编码含有C2结构域蛋白cDNA的克隆及表达分析

本研究根据从巴西橡树胶乳cDNA文库中获得的一个EST片段的序列信息设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码含有C2结构域蛋白的cDNA(命名为HbC2)。序列分析表明,HbC2长为1185bp,含有813bp的阅读框,140bp的5'-UTR和232bp的3'-UTR,编码270个氨基酸,分子量为30.9KD,等电点为6.29,含有保守的C2结构域。半定量RT-PCR分析表明HbC2在花、芽、叶、胶乳和树皮中都有表达,其中在胶乳中表达量最高。茉莉酸可抑制HbC2的表达,乙烯对HbC2的表达没有影响。此研究为进一步研究C2蛋白基因在橡胶树中的生物学功能奠定基础。     

巴西橡胶树HbNTL1基因启动子的克隆与序列分析

膜结合NAC转录因子(NTLs)是植物NAC转录因子家族中一类C端具有跨膜结构域(transmembrane motifs,TMs)的转录调控因子,在植物生长发育、激素调节和逆境胁迫应答中具有重要的功能。根据巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)膜结合类NAC转录因子HbNTL1基因cDNA序列,利用基因组步移的方法从巴西橡胶树叶片基因组DNA中克隆获得了HbNTL1基因上游1 718 bp的调控片段。序列分析表明,该段序列含有一个典型的真核生物核心启动子区域,转录起始位点A位于起始密码子上游206 bp处。该启动子序列除了含有多个TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外,还存在赤霉素、茉莉酸和脱落酸等激素响应元件以及大量逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,如ABRE、DOFCOREZM、MYBCORE、W-box和MYCCONSENSUSATHSE等反应元件,表明HbNTL1转录因子可能是一个逆境胁迫相关NAC转录因子,在橡胶树抵御逆境胁迫的生理过程中具有重要功能。     

巴西橡胶树HbγGCS基因克隆及表达分析

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（TGCS）是细胞内谷胱甘肽（GSH）生物合成的限速酶,GSH在植物许多生理过程中发挥重要作用。本研究采用简并PCR和RACE技术获得巴西橡胶树γGCS基因全长cDNA序列,命名为HbTGCS（GenBank登录号：GU997638）。该基因全长2187bp,最长开放阅读框为1572bp,编码523个氨基酸。进化分析结果表明HbγGCS属双子叶植物γGCS亚类,同葡萄γGCS分为一组,与单子叶植物的亲缘关系较远。半定量RT-PCR结果表明HbγGCS基因在胶乳、叶片、树皮、花中均有表达,以花中表达量最大。健康橡胶树胶乳中HbγGCS达量高于死皮树。HbγGCS表达受乙烯、茉莉酸、过氧化氢、机械伤害、干旱、低温和高盐调控。     

巴西橡胶树一个AP2／EREBP转录因子的克隆及表达分析

本文采用RACE技术从巴西橡胶树中鉴定出一个AP2／EREBP转录因子。该转录因子全长cDNANl225bp,最长开放阅读框699bp,预测编码蛋白包含232个氨基酸;序列比对分析发现,该转录因子具有一段保守的AP2／EREBP结构域,与拟南芥Soloist（At4g13040）具有较高的相似性,将该基因命名HbSoloist。半定量胙PcR分析结果表明,HbSoloist在巴西橡胶树的胶乳、叶片、树皮和花中均有表达。与健康橡胶树相比,死皮树胶乳HbSoloist表达量明显下降。研究发HbSoloist表达受乙烯利、茉莉酸和低温处理调控,表明HbSoloist基因可能在巴西橡胶树乙烯、茉莉酸和低温反应中发挥作用。     

巴西橡胶树HbHEV3基因的克隆和表达分析

根据EST序列信息,通过RT-PCR获得了一个编码橡胶素前体的基因,命名为HbHEV3。HbHEV3编码区cDNA长度为630bp,编码209个氨基酸。预测的HbHEV3蛋白包含1个信号肽,1个具有几丁质结合特性的Hevein结构域和1个Barwinn结构域,HbHEV3与橡胶树及其他植物中类似蛋白具有很高的同源性。分离获得了HbHEV3起始密码子上游1 050bp的启动子序列,该序列含有众多应答激素和胁迫信号元件。实时荧光定量PCR分析结果表明,HbHEV3在所检测的组织中均有表达,其中在胶乳中的表达量最高,乙烯诱导能显著上调胶乳中HbHEV3的表达。研究表明,HbHEV3可能参与了橡胶树乙烯介导的防御反应,并在橡胶凝集过程中具有重要功能。     

巴西橡胶树的分子生物学研究进展

巴西橡胶树是一种重要的热带经济作物,由于橡胶树体内橡胶含量多,且容易采收,所以橡胶树一直是天然橡胶的商业来源。相比于模式植物和粮食等经济作物来说,分子生物学研究显滞后。,而且橡胶树是多年生乔木,经济性状多集中于胶乳,因此研究难度大,研究也不多,本就巴西橡胶的分子生物学方面的研究进行综述。     

橡胶树胞质型谷胱甘肽还原酶基因的克隆与表达分析

根据橡胶树GR1基因（Hb GR1）部分序列设计特异引物,运用RACE和RT-PCR技术克隆Hb GR1全长c DNA序列;运用DNAMAN、MEGA 6.06、Prot Param及Signal P 4.1 Server等生物信息学软件对Hb GR1序列、GR1系统进化关系及Hb GR1的基本理化性质和亚细胞定位等进行分析;利用实时荧光定量PCR技术研究Hb GR1的表达模式;构建原核表达载体p EASYE1-Hb GR1,并将其转入大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导融合蛋白原核表达。获得2 082 bp的Hb GR1全长c DNA,其中5′非编码区293 bp,3′非编码区298 bp,开放阅读框长1 491 bp,共编码496个氨基酸,其编码的蛋白分子质量约为53.68 k Da,理论等电点p I为6.18。序列分析发现Hb GR1无信号肽,在氨基酸水平上与其他植物GR1具有很高的同源性,包含植物GR典型的NADH结合结构域、二聚体结构域和高度保守的GGTCV[I/L]RGCVPKK[I/L]LVY基序。对植物GR进行系统进化分析表明,Hb GR1属于双子叶植物GR分枝,与同属大戟科的蓖麻亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明Hb GR1在橡胶树胶乳、叶片、树皮和花中均表达;Hb GR1表达受死皮、乙烯、茉莉酸、过氧化氢和伤害调控。SDS-PAGE电泳结果表明重组质粒p EASY-E1-Hb GR1在大肠杆菌BL21（DE3）中有效表达一个分子量约为55 k Da的融合蛋白。     

巴西橡胶树环锌指蛋白基因克隆及其分子特性

在先前的研究中通过抑制缩减杂交获得了一个在巴西橡胶树胶乳中特异表达的片段（HbSSH10）,该片段含有“RING finger”或“C3HC4”保守序列。根据HbSSH10的序列信息设计引物并通过3’-RACE和5＇-RACE的方法,获得了一个全长的cDNA（HbRZF）。该cDNA含有589个核苷酸,含有完整的阅读框架,编码156个氨基酸。从它推导出的氨基酸序列中含有“RING finger”或“C3HC4”保守区（氨基酸100～144）。该氨基酸序列与Poncirus trifoliata、Arabidopsis thaliana和Thellungiella halophila的环锌指蛋白的同源性分别为48％、52％和50％。Northern杂交分析表明HbRZF在胶乳中大量表达,在叶片中微量表达,而在根和花中几乎没有表达。茉莉酸处理可以诱导胶乳中HbRZF的表达,而乙烯对胶乳中HbRZF的表达基本上没有影响。     

巴西橡胶树HbCMT的克隆与表达分析

通过PCR和RACE技术克隆了巴西橡胶树中一个染色质甲基化酶(Chromomethylase, CMT)基因（HbCMT）。HbCMT长2697 bp,含有2556 bp的阅读框,编码851个氨基酸。推测HbCMT分子量为95.67 KD,等电点为5.38,氨基酸序列与可可、葡萄、黄瓜、鹰嘴豆、番茄、拟南芥CMT家族成员的同源性分别为77％、74％、72%、67%、64%和52%。定量PCR分析表明HbCMT在巴西橡胶树的根、树皮、叶、胶乳中均有表达,其中在胶乳中表达量最低,此外HbCMT在橡胶树自根幼态无性系的胶乳中表达比老态无性系胶乳中的表达低。     

巴西橡胶树胶乳中DUF1262结构域蛋白结构与基因表达分析

为了揭示天然橡胶生物合成酶互作蛋白结构及其在天然橡胶生物合成过程中的功能。本研究以橡胶树胶乳橡胶粒子总蛋白为研究对象,采用免疫共沉淀实验技术以天然橡胶合成关键酶顺式-异戊二烯基转移酶（CPT）抗体从胶乳中捕获了1个含DUF1262结构域的未知功能蛋白。生物信息学分析表明橡胶树基因组中包含50个编码含DUF1262结构域蛋白的基因序列;蛋白质相互作用网络分析表明DUF1262结构域蛋白可能参与调节信号转导或转录调控等过程;荧光定量PCR结果表明编码该蛋白基因的转录本在根、叶、花、枝和胶乳等组织中广泛分布,但在胶乳中表达较低,在树皮表达较高;水杨酸、脱落酸、过氧化氢及干旱处理可增强该基因在叶片中的转录水平。本研究证明DUF1262参与橡胶树逆境反应等生理过程,为揭示胶乳生物合成调控机制提供新线索。     

巴西橡胶树死皮病相关基因HbMyb1的结构分析及表达

对与死皮病有密切关系的HbMybl基因进行了克隆和结构分析。该基因含有一个344bp的内含子和2个外显子。利用Genome Walker的方法获得了1．2kb的5′前年序列核心启动子,分析表明该启动子可能是富含GC和依赖于起始子(Inr)的非典型启动子。Southern杂交分析表明,HbMybl在橡胶树基因组中为2个拷贝。HbMybl在树皮中表达最强,在叶片中最弱。     

巴西橡胶树的脂酰辅酶A还原酶cDNA克隆及其序列分析

从巴西橡胶树差减cDNA文库中筛选到一个与脂酰辅酶A还原酶同源性较高的基因片段,根据该基因片段序列信息,设计特异引物,采用RACE进行差异片段的5’和3’端的扩增,获得长度为1365bp的cDNA克隆R28（GenBank登陆号：AY461413）。序列分析表明,该基因包含1149bp的开放阅读框,5＇-UTR为96bp,3＇-UTR为128bp,编码382个氨基酸,推测其蛋白质的分子量为43．5kDa,等电点为8．97,有一个跨膜螺旋N（187至215位氨基酸）和1个由17个氨基酸组成的信号肽（1至17位氨基酸）。R28含有脂酰辅酶A还原酶的保守（NADP结合蛋白保守区）,推测该基因是一个脂酰辅酶A还原酶基因。     

巴西橡胶树43 kD橡胶粒子膜蛋白基因的cDNA克隆及表达

对43 kD的橡胶粒子膜蛋白进行了分离纯化和其N端氨基酸序列分析,根据N端氨基酸序列,设计一简并引物,通过3'RACE(Rapid Amplification ofcDNA Ends)的方法,获得了43 kD的橡胶粒子膜蛋白的cDNA.该cDNA含有1 385个核苷酸,含有完整的阅读框架,编码381个氨基酸.在终止密码子下游,包含有一个239bp的3'非编码区.该cDNA由5个首尾相连的重复单元组成,每个单元编码76个氨基酸组成的泛素(ubiquitin)单体.编码43 kD橡胶粒子蛋白的基因具有多个拷贝,在胶乳、叶片和树皮都表达.     

巴西橡胶树HbMYB62转录因子基因的克隆和表达分析

R2R3-MYB类转录因子参与包括逆境胁迫反应等多种生物反应。为鉴定橡胶树中MYB转录因子的结构与功能,从橡胶树叶片中克隆HbMYB62全长的cDNA序列。该基因片段大小为1 013 bp,包含945 bp的ORF,编码314个氨基酸残基。其推导的氨基酸序列具有植物HTH_MYB的特异性结构域,并与拟南芥AtMYB62具有高度相似性。qRT-PCR发现HbMYB62主要在橡胶树花中表达,而在树皮、叶和乳胶中表达量较少。其叶片表达量在过氧化氢（H₂O₂）、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）等处理下显著上调。表明HbMYB62与橡胶树的抗逆反应和激素信号传导过程有关,为进一步研究其结构和功能打下基础。