利用手持技术开展中学生物科学探究——探究过氧化氢酶的最适pH

以"探究过氧化氢酶的最适pH"为例,将数字化传感技术与生物科学探究有机结合,进行定量实验探究。通过改进实验并结合传感技术开展探究得到过氧化氢酶的最适pH为9.5,为中学生物科学教学提供参考。     

“探究pH对过氧化氢酶活性的影响”的实验教学

"探究pH对过氧化氢酶活性的影响"的实验,常因多种因素而不能达到既简便又定量的效果,通过改进实验装置,学生能直接观察到在不同的pH值条件下过氧化氢酶活性的差异,并能相对准确收集数据,以量化实验结果,利于学生理解酶活性受pH影响的概念。改进后的实验既保证实验科学、严密,又省时省力。     

“探究pH对过氧化氢酶的影响”实验装置设计

"探究pH对过氧化氢酶的影响"实验装置的设计对该实验尤为关键。结合学校实验条件,利用现有器材搭建新型实验装置,简化了实验步骤。     

探究温度对酶活性影响的实验设计与实施

"新陈代谢与酶"是高中生物学"新陈代谢"一章的一个课题.早在1986年,我校就组织学生通过实验探究酶及其作用特性.1996年7月,周湘老师曾在<生物学通报>发表一篇文章--"酶与代谢"一节的实验探究法教学,文章中提到对酶活性的影响因素的实验探究,本组教师曾先后尝试用唾液淀粉酶催化淀粉水解、过氧化氢酶催化H2O2分解来研究温度和pH对酶活性的影响,但实验效果均不是很理想.     

“实验探究pH影响过氧化氢酶活性”的教学组织

在"探究pH对过氧化氢酶的影响"实验中,浙科版教材选用反应小室展开实验。对原实验装置提出以下改进:反应在试管中进行;利用气排分配器使各组实验同时进行;利用单向阀使反应产生的气体仅从一个导管释放;利用滴斗与橡皮管形成U形管,观察滴斗中单位时间内产生的气体体积。改进后的实验可同步观察各组实验现象,直观且效果明显。     

探究pH值对3种生物材料中过氧化氢酶活性的影响

通过测量注射器内酶促反应前、后的气体变化量,研究了3种生物材料中过氧化氢酶的活性在pH值为6.2~8.0范围内的差异。结果表明,pH值对过氧化氢酶的活性有较大影响,在此范围内,酶的活性呈现先升高再降低的趋式。其中猪肝粗酶液、马铃薯块茎粗酶液以及酵母菌粗酶液中的过氧化氢酶活性分别在pH值为6.8、7.2和7.0时达到最强,在pH值为8.0时活性均最弱。     

嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.F26过氧化氢酶的分离纯化及性质研究

从一株低度嗜盐、兼性嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp．F26中纯化得到一种碱性过氧化氢酶,并对该酶进行了性质研究。纯化过程经硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、凝胶过滤层析及疏水层析四步最终获得电泳纯的目标酶(纯化58．5倍)。该过氧化氢酶的分子量为140kD,由两个大小相同的亚基组成。天然酶分子在408nm处显示特征吸收峰(Soret band)。吡啶血色素光谱显示了酶分子以原卟啉Ⅸ(protoheme Ⅸ)作为辅基。计算获得酶的表观米氏常数为32．5mmol／L。该过氧化氢酶不受连二亚硫酸钠的还原作用影响,但被氰化物、叠氮化物和3．氨基．1,2,4-三唑(单功能过氧化氢酶的专一抑制剂)强烈抑制。以邻联茴香胺、邻苯二胺和二氨基联苯胺作为电子供体测定酶活时,该酶不显示过氧化物酶活性。同时,酶的N-端序列比对结果说明,该过氧化氢酶与单功能过氧化氢酶亚群有一定的相似性,而与双功能过氧化氢酶亚群及猛过氧化氢酶亚群均没有同源性。因此,本文将纯化的碱性过氧化氢酶定性为单功能过氧化氢酶。此外,该酶具有热敏感的特点,且酶活在pH5～9的范围内不受pH影响,此后,活性随着pH的升高而升高,并在pH 11处有明显的酶活高峰。20℃、pH 11条件下的酶活半衰期达49h。在pH 11的高碱条件下表现出最高活力和一定的稳定性,这在已报道的过氧化氢酶中还未见描述。同时,该酶也显示了良好的盐碱稳定性,0．5mol／L NaCl、pH 10．5条件下的酶活半衰期达90h。另一方面,本文所研究的过氧化氢酶是第一个来源于嗜碱微生物的同源二聚体单功能过氧化氢酶,也是第一个来源于天然碱湖的单功能过氧化氢酶,它能部分地反映出细胞抗氧化体系对相应环境的适应情况。     

嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.F26过氧化氢酶的分离纯化及性质研究

从一株低度嗜盐、兼性嗜碱芽孢杆菌Bacillussp .F2 6中纯化得到一种碱性过氧化氢酶 ,并对该酶进行了性质研究。纯化过程经硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、凝胶过滤层析及疏水层析四步最终获得电泳纯的目标酶 (纯化 58.5倍 )。该过氧化氢酶的分子量为140kD ,由两个大小相同的亚基组成。天然酶分子在40.8nm处显示特征吸收峰 (Soretband)。吡啶血色素光谱显示了酶分子以原卟啉Ⅸ (protohemeⅨ )作为辅基。计算获得酶的表观米氏常数为 32.5mmol/L。该过氧化氢酶不受连二亚硫酸钠的还原作用影响 ,但被氰化物、叠氮化物和 3-氨基-1,2 ,4-三唑 (单功能过氧化氢酶的专一抑制剂 )强烈抑制。以邻联茴香胺、邻苯二胺和二氨基联苯胺作为电子供体测定酶活时 ,该酶不显示过氧化物酶活性。同时 ,酶的N_端序列比对结果说明 ,该过氧化氢酶与单功能过氧化氢酶亚群有一定的相似性 ,而与双功能过氧化氢酶亚群及猛过氧化氢酶亚群均没有同源性。因此 ,本文将纯化的碱性过氧化氢酶定性为单功能过氧化氢酶。此外 ,该酶具有热敏感的特点 ,且酶活在Ph 5～ 9的范围内不受pH影响 ,此后 ,活性随着pH的升高而升高,并在pH11处有明显的酶活高峰。20℃、pH11条件下的酶活半衰期达49h.在pH11的高碱条件下表现出最高活力和一定的稳定性,这在已报道的过氧化氢酶中还未见描述。同时,该酶也显示了良好的盐碱稳定性,0.5mol/L NaCl、pH10.5条件下的酶活半衰期达90h.另一方面,本文所研究的过氧化氢酶是第一个来源于嗜碱微生物的同源二聚体单功能过氧化氢酶,也是第一个来源于天然碱湖的单功能过氧化氢酶,它能部分地反映出细胞抗氧化体系对相应环境的适应情况。     

“调查底物浓度对过氧化氢酶活性的影响”一节英国课堂的探究教学设计

以英国中学的“调查底物浓度对过氧化氢酶活性的影响”一节观摩教学为例,介绍如何以过氧化氢溶液浓度为自变量、过氧化氢酶酶活性为因变量探究酶的高效性特征;在实验操作中掌握酶的固定化技能;重视学生的动手和合作能力,重视培养学生的问题分析思维能力.点评并反思本节教学设计能动,以利于探究教学的错答.     

猪肝过氧化氢酶提取条件的研究

过氧化氢酶又称触酶,专一分解过氧化氢,溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚。传统方法是从牛、马或人的红细胞、肝、肾中通过选择性沉淀法、缓冲液提取法、层析法等提取过氧化氢酶。本研究以猪肝为原料对过氧化氢酶的提取条件进行了试验。根据猪肝过氧化氢酶在pH5．3—8．0有活性、最适pH为7．0、溶于水的特性,采用水浸提法提取猪肝过氧化氢酶。先选择影响提取的主要因素(浸提时间、温度、料水比)分别作为单因素进行梯度实验,确定其合适范围;再通过进一步的正交实验得到猪肝过氧化氢酶提取条件的优化组合,并综合后处理中固液分离的要求,确定最佳提取条件,即料水比15、浸提温度25℃、浸提时间8h。     

碱性过氧化氢酶高产菌的筛选、鉴定及发酵条件优化

从纺织厂的车间污水分离获得菌株WSHDZ-01,其产过氧化氢酶酶活为600U/mL,酶活的pH范围为5.0~12.0。根据对该过氧化氢酶生产菌的形态和生理生化特征的分析和16SrDNA序列分析,鉴定该菌为枯草芽孢杆菌。通过对该菌株发酵培养基中碳氮源的优化,其最佳碳源为10g/L的葡萄糖,氮源为5g/L的NaNO3,在此条件下产酶达3258U/mL。此外,该菌株所产过氧化氢酶的最适反应pH为11.0,最适温度为55℃,在pH11.0和50℃下保持15min后,剩余酶活仍达98%以上。     

耐过氧化氢的锰过氧化物酶对三苯甲烷类染料的脱色

[目的]从一株白腐菌Trametes sp.SQ01中获得一种新型的锰过氧化物酶,探讨该酶的底物特异性和对过氧化氢的耐性,以及其对三苯甲烷类染料的脱色能力.[方法]通过丙酮沉淀和DEAE-cellulose 52柱层析法纯化锰过氧化物酶.利用UV-2010紫外可见分光光度法研究锰过氧化物酶对过氧化氢的耐性,同时,用紫外可见分光光度计对三苯甲烷类染料脱色效果进行分析.[结果]通过两步纯化,获得了均一性的锰过氧化物酶.该酶的最适pH和温度分别是4.5和70℃,在pH 3.0-8.0时,酶活相对稳定.该酶在二价锰离子存在下能够氧化2,6-二甲氧基苯酚、愈创木酚、2,2＇-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)和过氧化氢等化合物,同时也能作用二价锰离子.在与这些底物反应中,最适底物为过氧化氢(Km为3.7 tmmol/L).该酶具有抗过氧化氢漂白能力,锰过氧化物酶与高浓度的过氧化氢(2.5 mmol/L)作用60 min后仍能保持70％的活性.在所测试的染料中,锰过氧化物酶对结晶紫的脱色率最高达到65.8％.二价锰离子和过氧化氢对锰过氧化物酶脱色能力的影响进行研究,与孔雀绿相比,锰离子和过氧化氢对活性艳蓝脱色的影响很小.[结论]Trametes sp.SQ01锰过氧化物酶对过氧化氢的耐受性,以及对三苯甲烷类染料的高效脱色能力表明该酶在染料脱色降解方面有着广阔的应用前景.     

大鼠肝脏过氧化氢酶的分离纯化及性质

根据过氧化氢酶的催化特性,采用盐析,透析,离心等技术,从大鼠肝脏中分离纯化过氧化氢酶,提纯倍数达到26倍,酶活性回收率为57%。为一般实验室分离纯化大鼠过氧化氢酶提供了一种有效的方法。酶学性质研究表明,该酶最适温度为37℃,最适pH值为7.5,在此条件下,以过氧化氢为底物的Km值为56 mmol.L-1。     

“比较过氧化氢在不同条件下的分解”实验改进

通过实验证明,香菇中含有大量过氧化氢酶,用香菇代替动物肝脏进行"比较过氧化氢在不同条件下的分解"实验,可以降低实验风险,提高学生的实验参与度,减轻教师准备实验的工作量。用排水法改进实验,通过比较量筒中收集到相同体积水所需的时间长短比较过氧化氢在不同催化剂下的分解速率,变定性实验为定量实验,直观地得出酶的催化效率较无机催化剂高的结论。     

管氏肿腿蜂寄生和注射其毒液对黄粉虫过氧化氢酶基因表达的影响

为了探究管氏肿腿蜂Scleroderma guani寄生和注射其毒液对寄主黄粉虫Tenebrio molitor蛹中过氧化氢酶表达的影响,采用RT-PCR克隆黄粉虫过氧化氢酶基因,利用生物信息学软件分析基因序列结构特性,采用实时荧光定量PCR技术分析该基因的表达特征,使用试剂盒测定过氧化氢酶活性。克隆获得的黄粉虫过氧化氢酶基因编码阅读框序列长1 620 bp,编码539个氨基酸。该基因编码的氨基酸序列中含有催化氨基酸位点(His-71、Asn-183和Tyr-393)以及过氧化氢酶家族的3个保守基序：近端活性位点序列(FDRERIPERVVHAKGXG)、NADPH结合位点(XXHQXXXXFXD)和血红素配体结合位点(RXFXYXDXH)。被管氏肿腿蜂寄生和注射其毒液后,黄粉虫蛹中的过氧化氢酶基因的表达量显著上调,其血淋巴和脂肪体中的过氧化氢酶活性显著升高。研究结果表明,管氏肿腿蜂毒液能调控黄粉虫过氧化氢酶基因的表达。     

以Fe(III) 改性胶原纤维为载体固定过氧化氢酶

将胶原纤维用三价铁改性后作为载体,通过戊二醛的交联作用将过氧化氢酶固定在该载体上。制备的固定化过氧化氢酶蛋白固载量为16.7 mg/g,酶活收率为35％。研究了固定化酶与自由酶的最适pH、最适温度、热稳定性、贮存稳定性及操作稳定性。结果表明：过氧化氢酶经此法固定化后,最适pH及最适温度与自由酶相同,分别为pH 7.0和25 ℃;但固定化酶的热稳定性显著提高,在75 ℃保存5 h后,仍能保留30％的活力,而自由酶则完全失活;固定化酶在室温下保存12 d后,酶活力仍保持在88％以上,而自由酶在此条件下则完全失     

以Fe(Ⅲ)改性胶原纤维为载体固定过氧化氢酶

将胶原纤维用三价铁改性后作为载体,通过戊二醛的交联作用将过氧化氢酶固定在该载体上.制备的固定化过氧化氢酶蛋白固载量为16.7 mg/g,酶活收率为35％.研究了固定化酶与自由酶的最适pH、最适温度、热稳定性、贮存稳定性及操作稳定性.结果表明:过氧化氢酶经此法固定化后,最适pH及最适温度与自由酶相同,分别为pH 7.0和25℃;但固定化酶的热稳定性显著提高,在75℃保存5 h后,仍能保留30％的活力,而自由酶则完全失活;固定化酶在室温下保存12 d后,酶活力仍保持在88％以上,而自由酶在此条件下则完全失活;此外,固定化过氧化氢酶还表现出了良好的操作稳定性,在室温下连续反应26次后,相对活力为57％.该研究表明胶原纤维可作为固定化过氧化     

畜禽粪便堆肥过程中酶活性及微生物数量的变化研究

实验选取鸡粪和猪粪进行好氧堆肥发酵,研究畜禽粪便腐熟过程中酶活性和微生物的变化趋势以及相互联系。结果表明:过氧化氢酶活性和纤维素酶活性在堆肥初期较高,随后迅速降低,最终过氧化氢酶维持在9~12ml/g之间,纤维素酶维持在12.37~15.07mg/(kg·h)之间,而脲酶活性变化趋势为"升高-降低-升高"。细菌数量变化趋势为"低-高-低";放线菌为"高-低";真菌为"高-低-高"。通过相关分析发现,放线菌可能是影响堆肥中过氧化氢酶和纤维素酶的关键因素。鸡粪中放线菌与过氧化氢酶呈极显著正相关;猪粪中放线菌与过氧化氢酶和纤维素酶呈显著正相关;鸡粪+猪粪中放线菌与过氧化氢酶和纤维素酶呈极显著正相关。     

Thermus thermophilus HB27锰过氧化氢酶在大肠杆菌中的表达及酶学性质分析

碱性嗜热过氧化氢酶是一种重要的纺织用酶。根据大肠杆菌密码子使用偏爱性,对Thermus thermophilus HB27来源的含锰过氧化氢酶基因进行密码子优化,将优化后的基因连接至表达载体pET28a(+)上,转化到E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达。结果表明在含有14mmol/L Mn2+浓度的培养液中以0.2 mmol/L的IPTG 42℃条件下诱导2 h的情况下,菌体破碎上清液中的酶活力可达25 U/ml。利用Ni亲和层析柱对该Mn-CAT进行纯化,酶学性质研究表明:此酶的最适温度为70℃,最适pH为pH 10.0,在80℃保温2 h,酶活力不损失;pH9.0~11.0的环境中放置2 h后,酶活仅损失约10%,此酶具有良好的工业开发潜力。     

铜对三叶草-土壤酶系统的影响

通过盆栽实验研究了重金属Cu污染对植物(三叶草)-土壤酶(脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶和多酚氧化酶)系统的影响.结果表明,随着Cu浓度增加,脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶和多酚氧化酶活性均逐渐减小,与Cu浓度有高度相关性,蔗糖酶>多酚氧化酶>脲酶>过氧化氢酶.在处理浓度不变情况下,酶活性随时间而变化,且呈现低Cu浓度(<00 mg·kg^-1)时4种酶活性均有所上升,而Cu浓度增高(00～3 000 mg·kg^-1)时各酶活性逐渐下降的趋势.统计分析表明,在每一梯度浓度上,4种酶在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组内均存在显著差异性(P<0.01),与植物受重金属Cu污染时的生长情况一致.随着Cu浓度增加,土壤pH值逐渐下降,而电导率上升;同一Cu浓度下的pH值和电导率均随时间呈缓慢上升趋势,统计分析显示,二者在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组内均存在显著差异性(P<0.01).土壤pH值和电导率与4种土壤酶活性有高度相关性,多酚氧化酶>蔗糖酶>过氧化氢酶>脲酶.这4种酶同时可作为检测土壤环境质量的指标.