病原微生物快速检测方法及研究进展

近年来,随着现代生物技术的快速发展,人类基因组计划的完成,尤其是生物化学、分子生物学、免疫学、生物仪器及计算机理论与技术的进步,新的诊断技术和方法不断涌现并被广泛应用于微生物检测,使得疾病诊断的水平有了很大的提高。根据目前国内外研究的动向,本文对一些常规及新型检测技术的原理、特点及应用做一综述。     

鼠伤寒沙门氏菌多重PCR检测方法的研究

分别根据沙门氏菌16S rRNA、质粒毒力基因spvC、致病基因invB、fimA序列设计4对引物,对沙门氏菌株及非沙门氏株菌基因组DNA进行多重PCR检测。结果该方法能检测出6.3×10² 个cfu/ml纯培养的沙门氏菌,人工染菌食品模拟检测结果显示,熟鸡肉初始含菌量为17cfu/g、全脂奶粉为11cfu/g、生牛肉为13.6cfu/g,经过8h增菌,PCR检测为阳性。该体系能鉴定产生多种毒力因子的沙门氏菌,特异性强、敏感性高,为检测和鉴定沙门氏菌株提供了一个新方法。     

沙门氏菌的快速检测

沙门氏菌检测方法发展迅速。本文就生化方法、免疫学方法、ＤＮＡ探针杂交方法、多聚酶链反应（ＰＣＲ）方法对近年来出现的沙门氏菌快速检测作简要综述     

食源性沙门氏菌检测方法的研究进展

沙门氏菌(Salmonella)是一百多年前发现的一种病原体,是一种常见的重要人畜共患 病原菌,它不仅可以引起胃肠炎,还会引起伤寒、败血症及肠外灶性感染等多种症候群.在 世界各地的食物中毒中,沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第二位,因而受到了人们强烈的 关注,而沙门氏菌的检测方法正是人们关注的焦点之一.近年来,沙门氏菌检测技术有了很 大的进展,由十分困难的传统分离培养法到免疫学检测方法发展成为今天的分子生物学检测 技术.毫无疑问,检测方法的进展在便利沙门氏菌检测的同时,也将为更好地了解沙门氏菌奠定基础.综述了食源性沙门氏菌的概况以及其检测方法的研究进展.     

利用厚度剪切模传感器在线快速检测鼠伤寒沙门氏菌

鼠伤寒沙门氏菌的浓度和生长用厚度剪切模（ＴＳＭ）传感器在线进行了测定．通过实验发现该法简单、实时和快速．该传感器的响应和细胞浓度之间存在良好的线性关系,相关系数为０．９７４．细菌的生长初始期即延滞期和对数生长期可以用该装置在线测定．影响测定的诸因素也进行了讨论,如培养基和电解质是关键的因素．测定的最佳浓度范围为１．２５×１０５～１×１０１０细胞／升．     

伤寒沙门氏菌及其抗原检测方法的近年进展

伤寒病的诊断,来自病原学的证据最为可靠。检测伤寒特异性抗体,对诊断有重要的参考价值,但特异抗原刺激机体产生有关抗体,有一定的时间过程,而且受各种因素影响。在一些免疫功能紊乱或缺陷的患者中,检测抗体往往易产生假阳性或假阴性反应,而检测抗原则可     

胶体金免疫层析法快速检测沙门氏菌

为了建立一种简便快速的胶体金免疫层析法(GICA)用于检测沙门氏菌,将抗沙门氏菌多抗用抗原吸收法封闭与其他肠道杆菌的交叉反应,标记胶体金溶胶制成探针,采用多膜复合的方法制成免疫层析条。结果表明该层析条灵敏度为2.1×106cfu/ml,不与其他肠道杆菌反应,37℃放置33天,检测结果无差异。该方法灵敏度高,简便快速,无需特殊仪器设备,有良好的开发应用前景。     

纳米金新型基因芯片检测系统的研制及其在临床病原微生物快速检测中的应用

本研究在纳米放大基因芯片检测专利技术的基础上 ,研制纳米金新型基因芯片检测系统 ,从而充分利用纳米金与银反应可将信号放大 10 6倍的优势以取代目前通用的荧光、同位素、酶标等信号报告材料 ,实现芯片技术与纳米技术的有机结合 ,使之具有设备简单 ,技术稳定易于掌握 ,灵敏度高 ,应用范围广等特点。并在此基础上构建针对临床常见致病菌的实用型纳米金基因芯片 ,从而为临床致病性病原微生物的快速、简便、准确诊断探索一条新的途径。试验的主要方法及结果如下 :(1)扩增实验表明 :引物巯基修饰后必须经过TCEP预还原处理 ,才能获得较好的P…     

沙门氏菌检测技术研究进展

沙门氏菌(Salmonella)是一种常见的人畜共患病原菌,不仅能引起动物伤寒、霍乱,还会导致人类胃肠炎、败血症等疾病,严重威胁人、畜的生命健康,由其引起的食品安全事件高居所有食源性致病菌之首。食品中沙门氏菌的快速、准确检测是预防与控制沙门氏菌传播蔓延的重要手段。随着生物学、化学、物理等学科的快速发展,沙门氏菌的检测技术已从传统的分离培养和生化鉴定,发展到免疫学、分子生物学、电化学、传感器、生物芯片等快速、高通量检测,尤其是近年来与纳米技术、光谱学、质谱学以及代谢组学等的结合使用,为沙门氏菌快速、准确、灵敏的检测方法提供了新的发展方向。本文在参阅国内外最新研究报道的基础上,对各种方法进行总结阐述,并对沙门氏菌未来检测技术的发展动向予以分析。     

扩增内标在沙门氏菌PCR检测方法中的应用

在PCR反应体系中添加了一条人工构建的扩增内标片段,以指示沙门氏菌PCR快速检测中出现的假阴性。对9株沙门氏菌和15株非沙门氏菌进行PCR检测,结果显示所有沙门氏菌都能扩增到一条invA基因中的374bp特异性片段,而模板来源于非沙门氏菌时则只能扩增到一条513bp扩增内标片段。灵敏度试验显示,该PCR检测体系对猪霍乱沙门氏菌纯DNA模板的检测灵敏度为12．8fg／μL,如果将增菌时间确定为8h,则该检测体系对人工染菌牛乳中沙门氏菌的检测灵敏度可以达到起始浓度为8cfu／25mL。采用上述方法检测了80份污染严重的样品,证实此方法可以有效地排除假阴性,提高检测准确率。     

重组酶介导等温核酸扩增方法快速检测土壤沙门氏菌

【背景】沙门氏菌(Salmonella)是一种可以引起人畜患病的致病菌,也是最主要的食源性细菌之一。土壤中的沙门氏菌可通过蔬菜等植物进入人体,引发食物中毒。但由于土壤性质及其他微生物的干扰,如何快速甄别土壤是否受到沙门氏菌的污染仍是一个难题。【目的】建立一种快速、灵敏检测土壤沙门氏菌的实时重组酶介导等温核酸扩增(Real-Time Recombinase Aided Amplification,RT-RAA)方法。【方法】针对沙门氏菌invA基因序列设计特异性引物和探针,构建含有invA基因待检片段的重组质粒,评价RT-RAA方法的灵敏度;分别以肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、福氏志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的基因组DNA为模板,评价RT-RAA方法的特异性;RT-RAA方法用于番茄、生姜土壤中沙门氏菌的检测,同时用平板培养法进行验证。【结果】RT-RAA方法可用于重组质粒中invA基因片段的检测,在39℃条件下,20 min内即可获得检测结果,最低检测质粒拷贝数为10拷贝/反应,而且与大肠杆菌、福氏志贺氏菌和金黄色葡萄球菌无交叉反应。土壤样品DNA的RT-RAA检测结果显示,供试番茄土已被沙门氏菌污染,而生姜土则没有,与平板培养结果一致。【结论】RT-RAA方法具有灵敏度高和特异性强的特点,可用于土壤沙门氏菌污染的快速检测。     

食源性沙门氏菌耐药性检测及相关质粒

[目的]测定390株沙门氏菌的抗生素药敏性,研究部分多重耐药株中质粒与其宿主耐药表型之间的关系及其在接合过程中对耐药性水平转移的影响.[方法]使用选择性培养基分离到沙门氏菌并通过PCR确认后,按照琼脂稀释法测定分离株对供试抗生素的药敏性,试剂盒提取代表性多重耐药株中的质粒,HindⅢ酶切,DPS软件分析电泳后质粒图谱.通过接合试验研究质粒在抗生素抗性水平转移中的作用.[结果]沙门氏菌分离株对四环素耐药最为普遍(58.2%),其次为链霉素(42.8%)、卡那霉素(39%)和氨苄青霉素(38.2%),对头孢西丁、氯霉素、庆大霉素、头孢曲松、阿莫西林甲氧苄啶、头孢替呋钠和萘啶酮酸的耐药率分别为27.2%、26.9%、21%、19%、18.2%、17.9%、14.6%和12.3%.抗性质粒编码的相同或相似沙门氏菌耐药表型与其中所含的耐药质粒并不呈现出严格的对应关系.质粒携带的抗性基因可通过接合作用转移,接合效率在2.4×10-4到5.6×10-1之间.[结论]食源性沙门氏菌对常用抗生素的多重耐药已经成为普遍现象,抗性质粒的同源性与其宿主耐药表型无直接相关性,其携带的耐药基因可通过接合作用在不同细菌种属之间高频传递.     

免疫金渗滤试验检测食品中沙门氏菌的研究

分别用抗沙门氏菌多价抗体和葡萄球菌A蛋白包被胶体金制备探针,采用免疫渗滤法可检出85%的引起食物中毒的沙门氏菌,灵敏度为2.4×107cfu/ml.对最常见的鼠伤寒、猪霍乱和肠炎沙门氏菌,检出率达100%.人工染菌的食品样品经简单处理,即可用于检测.该方法简单快速,适合现场检测之用.     

焦磷酸测序检测食品中鼠伤寒沙门氏菌

根据鼠伤寒沙门氏菌的特异序列,分别设计扩增引物和测序引物,建立焦磷酸测序检测鼠伤寒沙门氏菌的方法。针对鼠伤寒沙门氏菌设计特异性扩增引物,对目标片段进行PCR扩增,然后制备单链模板,并利用测序引物进行焦磷酸测序。测序结果表明,6株不同来源的鼠伤寒沙门氏菌均可以扩增出碱基序列为TACAACCGGA GTGCACATTA ATCCCGCAGC的基因片段,而30株阴性对照菌株均未得到扩增。进行BLAST比对表明,该序列与GenBank中鼠伤寒沙门氏菌的碱基序列100%匹配。焦磷酸测序法是一种快速、准确的检测方法,可用于食品中鼠伤寒沙门氏菌的快速检测。     

添加扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法

通过构建人工扩增内标,建立可以有效指示沙门氏菌检测过程可能出现假阴性情况的PCR检测方法。本研究基于沙门氏菌invA基因设计特异性引物,复合法构建扩增内标,建立PCR检测体系。特异性引物LW,对33株沙门氏菌和6株非沙门氏菌标准株进行检测,结果显示,所有沙门氏菌均扩增出385 bp的目标片段,非沙门氏菌则只能扩增出484 bp的扩增内标片段,特异性良好。灵敏度实验表明,该检测体系的灵敏度可达6.35 fg/μL。人工污染实验表明,起始染菌量为3.2 CFU/25 mL时,仅需8h增菌培养便可检出。大量食品样品检测证明,该检测体系确实可以有效的避免PCR检测过程出现的假阴性,提高检测准确性。     

鲜切生菜中沙门氏菌二级生长预测模型的建立

以鲜切生菜为研究对象,比较了修正的Gompertz、Gompertz、Logistic和MMF 4种一级模型对不同温度下鲜切生菜中沙门氏菌生长曲线的拟合情况,发现在36℃、20℃和10℃时,修正的Gompertz模型均为最佳的拟合模型,4℃时沙门氏菌生长受到抑制,对失活/存活曲线进行"镜像化"处理后发现拟合程度相对较低,相关系数为0.962 7,故未用于二级模型中;采用其他温度下的修正的Gompertz模型中的最大比生长速率作为二级模型的响应值,建立平方根二级模型;准确因子和偏差因子对二级模型的准确性验证结果表明,两者均接近1.0,说明所建立的二级模型用于预测鲜切生菜中沙门氏菌生长情况。本研究为鲜切生菜的微生物安全控制提供科学依据。     

沙门氏菌荧光实时定量PCR检测试剂的研制及应用

荧光实时定量PCR技术是近年来广泛应用于沙门氏菌快速检测的现代方法之一,本研究建立了检测沙门氏菌快速、敏感、特异以及准确定量的FQ-PCR方法。采用沙门氏菌fimY基因序列,设计特异引物和探针,通过对Taq酶、Mg2 和引物探针浓度等反应体系和条件的优化,然后进行特异性和适用性实验。最优化结果为:Taq酶用量2.5U;Mg2 浓度为3.75×10-3mol/L;引物浓度为0.65×10-6mol/L,探针浓度为0.30×10-6mol/L;循环条件为step1:95℃2min,step2:95℃5s,60℃40s,40cycles。结果表明该FQ-PCR检测试剂具有快速、简单、灵敏度高、特异性强和适用范围广等优点,可应用于食品卫生监管、商品检验检疫以及临床诊断等领域。     

生物芯片技术及其在病原微生物检测方面的进展

生物芯片 ( biochip)是二十世纪 90年代中期发展起来的一项尖端技术 [1 ] 。它以玻片、硅为载体 ,在单位面积上高密度地排列大量的生物材料 ,从而达到一次试验同时检测多种疾病或分析多种生物样品的目的。基因芯片、蛋白芯片等都属于生物芯片的范畴。生物芯片根据芯片上的探针不同 ,可分为蛋白芯片和基因芯片。如果芯片上固定的是肽或蛋白 ,则称为肽芯片或蛋白芯片。如果芯片上固定的分子是寡核苷酸探针或靶 DNA,则称为基因芯片。生物芯片是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。生物芯片能为现代医学科学及医学诊断…     

基于CRISPR 2类Ⅴ型系统的检测技术开发与研究进展

核酸检测技术以其灵敏度高、特异性强的特点,广泛应用于病原体检测中,在公共卫生管理和临床治疗决策等场景中发挥重要作用。基于CRISPR 2类Ⅴ型系统的核酸检测技术,同时还具备检测方式简单、检测时间短的特点,具有良好的发展前景。该文简要介绍CRISPR 2类Ⅴ型系统的组成、结构、功能与作用机制,总结已开发的基于不同Ⅴ型Cas蛋白的众多检测平台以及这些检测平台的应用场景,并对其未来发展进行简要述评。