八肋游仆虫NMD通路的初步研究

无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)是一种重要的mRNA质量监测机制,可以识别和降解含有提前终止密码子(premature termination codons,PTCs)的异常转录本,但其详细的分子机制还没有完全阐释清楚。纤毛虫是真核生物进化最早的一个分支,对其NMD途径的研究有助于阐明高等生物基因表达调控的进化与分子机制。该研究从纤毛虫八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)基因组中鉴定并克隆得到NMD因子EuUPF1、EuUPF2、EuY14a、EuY14b和EuMAGO的基因。酵母双杂交和体外pull-down实验分析证实了各因子间的相互作用关系:EuUPF1的CH结构域与EuUPF2的C-端结构域相互作用;Y14的两个同源体(paralogs)EuY14a和EuY14b,作为mRNA结合蛋白,均与EuMAGO发生相互作用,形成真核生物mRNA外显子连接复合体(exon-exon junction complex,EJC)的核心。一方面,EuUPF1的CH结构域与EuY14a直接相互作用,结合到异常mRNA上;另一方面,EuUPF1可以通过EuUPF2与EuMAGO相互作用,后者再与EuY14a和EuY14b相互作用,把EuUPF1锚定到异常mRNA上。总之,EuUPF1通过两种方式结合在mRNA上,招募各种核酸酶,降解异常的mRNA。因为游仆虫基因组中内含子含量低于高等真核生物,而又远高于酵母真菌,因此研究者认为,依赖EJC和不依赖EJC的两种NMD途径可能共存于游仆虫细胞中,但这两种NMD途径具体的分子机制有待深入研究。     

SMG1-UPF1-eRF1-eRF3复合体参与贾第虫无义介导的mRNA降解激活

无义介导的mRNA降解（NMD）是一种重要的真核生物mRNA质量监控途径。NMD可识别并降解含有提前终止密码子（PTC）的异常mRNA（PTC-mRNA）。但NMD途径对PTC-mRNA的识别和降解机制尚无阐明。蓝氏贾第虫（Giardia lamblia）是一种寄生性的原生动物,进化上处于真核生物基部,对其NMD途径的研究有利于了解NMD途径的机制与进化。本研究通过双分子荧光互补实验、酵母双杂交实验和体外pull-down实验,分析了贾第虫的UPF1 (GlUPF1)、SMG1 (GlSMG1)和肽链释放因子（GleRF1、GleRF3）之间的相互作用关系。结果表明,贾第虫的肽链释放因子都能够与GlUPF1发生相互作用,且GlUPF1的CH结构域与GleRF3能够形成较稳定的复合体,而GlSMG1的激酶结构域PIKK能与UPF1的C端和N端结构域相互作用。进一步研究证实,GlSMG1的PIKK结构域能使GlUPF1两种截短体GlUPF1（1~500 aa）和GlUPF1（501~1 304 aa）发生磷酸化修饰,说明GlUPF1 的N端和C端均有GlSMG1的磷酸化位点。进一步分析证实,T111是GlUPF1上的1个磷酸化位点。我们的研究结果表明,贾第虫NMD途径起始阶段,首先在mRNA的PTC处的核糖体上形成SMG1-UPF1-eRF1-eRF3(SURF)复合体,并且GlSMG1磷酸化修饰GlUPF1,由此激活NMD途径,可能招募XRN1和SKI7d等酶参与无义mRNA的降解。     

无义介导的mRNA降解(NMD)

无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD）作为真核细胞中重要RNA监控机制,识别并降解开放阅读框中含有提前终止密码子（premature termination codon,PTC）的mRNA,以避免因截短的蛋白产物积累对细胞造成毒害. NMD还调控正常生理基因的表达,暗示其在真核细胞中扮演重要角色. NMD途径的关键是PTC的识别.本文通过3种模型来分别阐述发现于哺乳动物、酵母等不同有机体的识别机制.通常由NMD因子UPF1（up-frameshift）等被招募至含PTC的mRNA上,借助这些因子组装形成“功能复合体”并激活降解.但目前对于PTC识别后的过程仍认识有限,本文通过综述NMD途径的分子机制以更好地理解其生物学意义.     

蓝氏贾第虫无义mRNA的降解

无义介导的mRNA降解途径（nonsense-mediated mRNA decay,NMD）作为细胞内的一种重要的mRNA质量监控机制,可以降解含有提前终止密码子（premature termination codon,PTC）的异常转录本,从而避免截短蛋白质对细胞的毒害,但其详细的分子机制有待进一步阐释。蓝氏贾第虫（Giardia lamblia)作为一种寄生性单细胞原生动物,进化地位特殊,对其NMD途径的研究有利于阐明基因表达调控的分子和进化机制。本研究通过酵母双杂交及体外pull-down实验分析了贾第虫NMD途径因子上游移码蛋白1(Giardia lamblia up-frameshift 1,GlUPF1)、贾第虫RNA结合蛋白（Giardia lamblia HRP1, GlHRP1）、贾第虫核糖核酸外切酶（Giardia lamblia Ski7p,GlSki7p、Giardia lamblia XRN1,GlXRN1）之间的相互作用关系。结果表明,GlUPF1全长与GlHRP1、GlXRN1(1~500 aa)、GlSki7p间均可发生相互作用。而且GlUPF1的CH结构域和C端结构域分别与GlHRP1、GlXRN1（1~500 aa）、GlSki7p相互作用。说明GlUPF1在贾第虫NMD途径中作为招募平台,在无义mRNA识别和降解过程中发挥重要作用。为此,结合本实验室之前的研究结果,我们提出原生动物贾第虫的NMD途径：在提前终止密码子处SURF(SMG1-UPF1-eRF1-eRF3)复合物形成后,GlUPF1被磷脂酰肌醇3-激酶(suppressor with morphogenetic effect on genitalia 1,SMG1)磷酸化修饰, NMD途径激活,随后GlUPF1与HRP1相互作用,将转录本标记为NMD底物;GlUPF1进而招募下游贾第虫5′-3′核糖核酸降解酶GlXRN1、贾第虫3′-5′ 核糖核酸降解因子GlSki7p,最终降解靶标mRNA。     

真核生物细胞中的无义介导mRNA降解机制

真核生物细胞具有不同的机制用于监视转录本的准确性以保证翻译产物的完整性与正确性．无义介导mRNA降解(NMD)的作用对象主要是由于编码氨基酸的密码子突变为终止密码子,而使翻译提前终止的无义mRNA,其降解方式是直接进行5′端脱帽和5′→3′方向的水解。     

抑制Rent1表达对HeLa细胞黏附能力的影响

Rent1是无义介导的mRNA降解(NMD)通路中的关键因子之一,通过引导含有提前出现的终止密码子(PTC)的mRNA至P-body,从而引发mRNA降解.为了进一步研究Rent1的生理功能,应用RNA干扰(RNAi)技术抑制Rent1的表达.试验发现,抑制Rent1的表达能够增强HeLa细胞对纤维粘连蛋白的黏附能力,另外,抑制Rent1的表达能够增加整合素基因ITGA2、ITGA3、ITGA6、ITGB5的表达.     

植物中XRN家族的研究进展

XRN家族是一类5′-3′核酸外切酶家族,主要参与rRNA的成熟加工以及特异mRNA的降解过程,在动物、植物以及微生物的生长发育过程中起着重要的作用.对XRN家族在植物生长发育过程中的功能进行了综述,XRN家族在植物中主要参与rRNA加工过程、miRNA途径、外源mRNA降解过程以及乙烯信号通路.     

八肋游仆虫含绿色荧光蛋白基因的大核人工染色体的构建

为研究八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)相关基因的功能,构建了八肋游仆虫大核人工染色体(macronuclear artificial chromosome of E. octocarinatus,EoMAC-G),其两端为克隆自八肋游仆虫大核β2-微管蛋白基因的5′和3′非编码区和两侧的端粒序列,中间为多克隆位点和密码子优化后的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP-Eo) 报道基因. 用脂质体转染方法将携带有EoMAC－G的pBTub-Tel载体转入八肋游仆虫大核,分析EGFP-Eo基因在八肋游仆虫细胞中的表达. 荧光显微镜观察发现,EGFP-Eo产生的荧光均匀分布于八肋游仆虫细胞质中. 在细胞进行有丝分裂的情况下,荧 光可持续20 d以上. 相比pEGFP-N1质粒转化的游仆虫,人工染色体中的EGFP-Eo基因表达的荧光亮度强、稳定且持续时间长. Western 杂交分析进一步证实,外源EGFP-Eo基因在细胞中过量表达. 通过细菌喂食法进行纤毛虫RNA干扰实验,抑制了外源EGFP-Eo基因在八肋游仆虫细胞中的表达. 利用构建的人工染色体不仅可以在八肋游仆虫细胞内表达外源基因,对目的蛋白质进行活细胞实时动态的定位分析,还可通过RNA干扰的方法调控外源基因在纤毛虫细胞中的表达,便于进一步分析目的蛋白质的功能.     

PTC下游翻译重启导致NMD途径的逃逸

无义突变介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)途径是真核生物体内一种重要的mRNA监督质控机制,它降解含有由无义突变、错误剪接、移码突变等产生的提前终止翻译密码子(premature translation termination codon,PTC)的mRNA,从而防止这种mRNA翻译产生的截短型蛋白质对机体造成的伤害.研究发现,一些含有PTC的mRNA发生了NMD途径逃逸,但具体机制仍不清楚.本研究将成视网膜细胞瘤基因1(retinoblastoma gene 1,RB1)作为NMD途径的靶基因,构建mini-RB1基因,包括外显子1~14(c DNA)、内含子14-外显子15-内含子15和外显子16~27(c DNA)的三部分序列,将其构建到真核表达载体pc DNA 3.1(-)中.根据人类基因组突变数据库选择3个突变位点W99X、G310X和R467X,构建相应无义突变体.分别将mini-RB1基因野生型和无义突变体转入He La细胞进行表达.用qRT-PCR检测发现,W99X无义突变体与野生型相比mRNA的水平无显著差异.为了进一步证实mini-RB1(W99X)发生了NMD逃逸,利用NMD途径抑制剂放线菌酮和转录抑制剂放线菌素D,分别处理转入野生型的mini-RB1基因及其无义突变体mini-RB1(W99X)的哺乳动物细胞,发现mini-RB1基因无义突变体的mRNA水平与野生型无明显差异,说明含有W99X无义突变的mini-RB1基因的mRNA发生了NMD逃逸.Western印迹检测mini-RB1基因的蛋白质表达发现,在无义突变位点W99X下游重新起始了蛋白质的翻译,因此,PTC下游蛋白质翻译的重新起始可能是导致无义mRNA逃逸NMD途径监控的主要原因.     

PTC下游翻译的重新起始导致NMD途径的逃逸

无义突变介导的mRNA降解（nonsense mediated mRNA decay, NMD）途径是真核生物体内一种重要的mRNA监督质控机制, 它降解含有由无义突变、错误剪接、移码突变等产生的提前终止翻译密码子（premature translation termination codon, PTC）的mRNA, 从而防止这种mRNA翻译产生的截短型蛋白质对机体造成的伤害. 研究发现, 一些含有PTC的mRNA发生了NMD途径逃逸, 但具体机制仍不清楚.本研究将成视网膜细胞瘤基因1 (retinoblastoma gene 1, RB1)作为NMD途径的靶基因, 构建mini-RB1基因,包括外显子1～14(cDNA)、内含子14 外显子15 内含子15和外显子16～27(cDNA) 的三部分序列, 将其构建到真核表达载体pcDNA 3.1(-)中.根据人类基因组突变数据库选择3个突变位点W99X、G310X和R467X, 构建相应无义突变体.分别将mini RB1基因野生型和无义突变体转入HeLa细胞进行表达.用qRT-PCR检测发现, W99X无义突变体与野生型相比mRNA的水平无显著差异.为了进一步证实mini- RB1（W99X）发生了NMD逃逸, 利用NMD途径抑制剂放线菌酮和转录抑制剂放线菌素D, 分别处理转入野生型的mini RB1基因及其无义突变体mini-RB1（W99X）的哺乳动物细胞, 发现mini-RB1基因无义突变体的mRNA水平与野生型无明显差异, 说明含有W99X无义突变的mini-RB1基因的mRNA发生了NMD逃逸.Western印迹检测mini-RB1基因的蛋白质表达发现, 在无义突变位点W99X下游重新起始了蛋白质的翻译, 因此,PTC下游蛋白质翻译的重新起始可能是导致无义mRNA逃逸NMD途径监控的主要原因.     

NMD机制及其对人类遗传病的治疗意义

无义介导的mRNA降解机制(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)是真核细胞内重要的RNA质量监控机制,能够识别并降解含有提前终止子(premature termination codon,PTC)的mRNA,避免细胞内积累有害的截短蛋白质产物。同时,NMD机制还调控着大量不含PTC的mRNA稳定性,影响其蛋白质产物的含量。现综述了NMD机制的底物、调控因子及其对人类遗传病治疗意义的最新研究进展。     

八肋游仆虫第二类释放因子基因的克隆与序列分析

分离八肋游仆虫 (Euplotesoctocarinatus)大核eRF3基因 ,为进一步研究第二类释放因子结构与功能 ,探讨低等真核生物新生肽链释放机理提供实验素材 .以八肋游仆虫基因组DNA为材料 ,根据已知的第二类释放因子eRF3保守氨基酸序列设计引物 ,扩增克隆了该游仆虫的第二类释放因子基因片段 ,并对其核苷酸序列进行了分析 .根据测得的序列设计特异性引物 ,并利用游仆虫的端粒序列 (C4 A4 C4 A4 C4 A4 C4 )为引物 ,扩增得到该基因的全序列 .序列分析表明 ,该基因位于 2 782bp长的大核染色体上 ,编码区由 2 4 0 0bp组成 ,编码 80 0个氨基酸 ,不含内含子     

嗜热四膜虫腺苷三磷酸结合盒转运蛋白ABCC10基因的可变剪切分析

哺乳动物中腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABCT)可通过可变剪切产生多种转录本,其中含有提前终止密码子(premature terminal codon,PTC)的转录本还可与无义介导的mRNA降解通路(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)作用来调节蛋白的相关功能,但这些现象尚未在低等生物的ABCT研究中发现.该文以单细胞原生动物——嗜热四膜虫为对象,利用转录组数据发现ABCC10基因存在可变剪切,并产生两条转录本(SV1和SV2),其中SV2在第五个内含子处发生内含子保留事件,这段长49bp的序列使SV2发生移码并产生PTC.在构建NMD通路中关键因子UPF1基因的嗜热四膜虫敲降株的基础上,利用实时荧光定量PCR方法检测SV2的转录情况.结果显示:含有PTC的转录本SV2在UPF1敲降株中的转录水平相对于野生型显著增加,说明SV2可被NMD通路降解.这与高等动物中某些ABCC蛋白通过可变剪切引入含PTC转录本,并能被NMD降解的方式一致,推测该方式在真核生物中十分保守,并在真核生物的共同祖先(the last eukaryotic common ancestor)中就已形成.     

真核生物和原核生物mRNA 5′至3′方向的降解机制

RNA降解是基因表达调节的重要途径,影响很多生命活动。近来,m RNA降解机制有了很多新发现,如真核生物中发现了一种m RNA末端尿苷化介导的脱帽机制,和一条不依赖exosome的3′→5′的m RNA降解途径。虽然真核生物与原核生物m RNA降解途径非常相似,通常都有3种:内切降解、5′→3′外切降解和3′→5′外切降解等,但两者m RNA降解途径之间也存在很多差异,如5′→3′方向的外切降解是真核生物m RNA最重要的降解途径之一,但其在细菌中作用非常弱,且只在革兰氏阳性菌中发现。m RNA降解的研究不仅深化了人们对这一过程的认识,而且有助于新型药物的研发,以防御寄生虫、病毒或治疗人类疾病(如癌症)等。文章主要综述了真核生物和原核生物m RNA 5′→3′方向的降解机制,并对其应用前景进行了展望。     

滑动序列对游仆虫中识别+1位和+2位编程性核糖体移码具有关键作用

编程性核糖体移码(programmed ribosomal frameshifting,PRF)广泛存在于生命进化谱系的各个分支,是一种翻译水平上的基因表达调控方式。单细胞真核生物游仆虫(Euplotes)中不仅PRF基因比例高,而且移码类型有+1和+2位两种。本研究从基因组水平对八肋游仆虫(E.octocarinatus)中的+2 PRF基因进行了鉴定,比较分析+1及+2 PRF基因中可能的调控元件。为了探讨游仆虫中滑动序列对移码类型的影响,克隆了八肋游仆虫的+1 PRF基因——η微管蛋白基因,将其构建到含绿色荧光蛋白报告基因的游仆虫大核人工染色体中,转染游仆虫细胞,通过检测GFP的表达来确定不同滑动序列突变体对应的移码类型。结果表明,滑动序列的改变能使游仆虫+1 PRF转变为+2 PRF,且这种移码类型的改变与滑动序列第1个密码子编码何种氨基酸无关。本研究揭示了滑动序列对游仆虫中识别+1和+2位的编程性核糖体移码具有关键作用。     

NMD逃逸机制及其在疾病治疗中的应用

无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)是指在病理或正常生理情况下mRNA上出现了提前终止密码子(premature termination codon, PTC),从而导致mRNA降解。它是一种广泛存在的mRNA质量监控机制。近年来,在多种疾病中发现某些PTC并未触发NMD,这种现象被称为NMD逃逸(NMD escape),然而其确切机制尚不十分清楚。目前公认的两个学说为:(1) PTC通读,即蛋白的翻译可以顺利通过PTC直至正常的终止密码子,产生全长蛋白;(2)翻译的重新启动,即蛋白翻译在PTC下游的潜在起始点重新开始直至终止密码子,产生N端截短蛋白。目前,通过利用PTC通读,越来越多的药物或小分子已被成功用于无义变异相关疾病的治疗。本文主要综述了NMD逃逸的机制及其在疾病治疗中的应用和进展,以期为进一步了解NMD逃逸及其相关应用概况提供参考。     

八肋游仆虫eRF3 C端的76个氨基酸对于释放因子eRF1a的结合不是必需的

以八肋游仆虫第二类肽链释放因子eRF3基因为模板,用PCR的方法获得eRF3的C端(eRF3C)和C端缺失76个氨基酸的突变体eRF3Ct片段,并构建重组表达质粒pGEX-6p-1-eRF3C和pGEX-6p-1-eRF3Ct,转入大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达。通过Glutathione Sepharose 4B柱亲和层析纯化,重组蛋白GST-eRF3C和GST-eRF3Ct获得纯化。Western blotting分析表明获得的蛋白为目的蛋白。PreScission酶切割后得到eRF3C和eRF3Ct蛋白。体外pull down分析显示eRF3C和eRF3Ct均能与八肋游仆虫第一类释放因子eRF1a相互作用,这表明八肋游仆虫eRF3 C端的76个氨基酸对于释放因子eRF1a的结合不是必需的。     

真核生物无义介导的mRNA降解与肿瘤关系的研究进展

研究发现任何错误剪接、移码、插入等基因突变都可能引入含有提前终止密码子(premature termination codon,PTC)的转录产物,将导致翻译提前终止而产生无生物活性甚至毒害性截短蛋白(truncated proteins)。而无义介导的mRNA的降解(nonsensemediated m RNA decay,NMD)作用机制在基因转录及转录后加工过程中选择性地迅速降解含有提前终止密码子的mRNA,避免产生对细胞正常生理功能有害的截短蛋白,真核生物NMD是转录后m RNA监控的重要环节。肿瘤的发生发展与相应基因的表达有关,NMD可以降解含有PTC的mRNA,学者们认为抑制NMD后肿瘤中某些基因的表达上调,而上调的基因或许在肿瘤的发生发展中其抑癌基因的作用,故学者们抑制肿瘤中NMD后进行测序筛选发生无义突变的抑癌基因。     

八肋游仆虫第二类肽链释放因子核定位信号分析

蛋白质合成终止过程中肽链释放因子负责终止密码子的识别.真核生物第二类肽链释放因子（eRF3）是一类GTP酶,协助第一类肽链释放因子（eRF1）识别终止密码子和水解肽酰 tRNA酯键.之前的研究表明,两类肽链释放因子在细胞核中发挥功能,参与蛋白质合成和纺锤体的组装.本研究根据软件预测结果,构建了一系列八肋游仆虫eRF3的截短型突变体,分析在其N端是否存在引导eRF3的核定位信号.结果表明,在eRF3的N端有两个区域（NLS1:23-36 aa 和 NLS2: 236-272 aa）可以引导eRF3进入细胞核中,而且这两个区域具有典型的核定位信号的氨基酸序列特征. eRF3的核定位与其作为一种穿梭蛋白的功能相一致,即参与细胞有丝分裂纺锤体的形成和无义介导的mRNA降解途径.     

Exosome的功能及作用机制的研究进展

Exosome（外切酶体）是一种包含了至少10种必要组分的蛋白复合,它在真核细胞RNA加工和mRNA3′→5′方向降解过程中都起重要的作用,近两年来,Exosome还被发现在mRNA的质量控制和5′端去帽中起关键作用,随着对mRNA的AREs功能研究的进一步深入和ski复合物的发现,人们对Exosome作用机制的认识取得了突破性进展。