基于RNAi技术的转基因植物监管现状及其面临的育种领域的挑战

RNA干扰（RNA interference,RNAi）在植物、动物和真菌的生长、发育、病毒防御和转座子失活中起着至关重要的作用。目前已成功利用RNAi技术培育出抗病虫和品质改良等具有优良性状的生物技术产品,为农业绿色发展提供了强有力的支撑。然而,目前RNAi的相关机制尚未完全明确,基于RNAi技术的转基因植物面临着一些亟待解决的问题,同时,对于RNAi转基因植物应用的安全高效监管也需进一步完善。基于此,对RNAi转基因植物的监管现状及其面临的育种上的挑战进行了综述,并对存在的问题提出了解决建议,以期为RNAi技术进一步应用于农业植物改良育种提供新思路,并为其监管评价提供依据。     

RNAi转基因作物安全评价研究进展

在秀丽隐杆线虫中首次发现双链RNA(dsRNA)能特异性地导致基因沉默(RNAi)现象后,人们开始大量地研究RNAi技术,并将其应用于功能基因的研究,来提高作物的抗性和改良遗传育种等。本文详细介绍了RNAi的技术原理,并且对RNAi技术与传统转基因技术的区别进行分析,阐述了该技术具有重要的生物学意义,以及在农作物害虫防治领域的占据独特优势。基于RNAi技术存在的潜在脱靶效应,从改良植物、靶标生物和生态环境的3个方面具体分析该技术可能存在的风险,为RNAi技术的风险评估提供参考。由于RNAi技术仍存在风险,为了维护生态多样性和保障人们的人身安全,应尽快建立起符合实际需求的安全性评价方法,本文针对RNAi转基因作物的环境安全和食用安全2个方面的评估方案进行概述。RNAi技术对减少害虫数量、提高水稻产量、降低种植成本以及减少化学农药污染、促进农业可持续发展来说具有重要意义,但该技术仍存在风险,需要进一步监管和研究,建立完善的生态评价系统,让RNAi技术在农业生产上发挥作用。     

RNA干扰在植物抗根结线虫病基因工程应用中的研究进展

植物根结线虫病对农业生产的危害连年加重,以轮作和化学农药为主的传统防治难以满足现代农业生产的需要.以常规的抗性育种和表达外源蛋白为主的抗线虫转基因育种主要受限于抗性基因的匮乏.而近来RNA干扰技术的应用为抗线虫基因工程带来新的突破,通过构建RNA干扰载体,在转基因植物中表达寄生线虫重要基因的dsRNA或siRNA,并经口针取食被导入线虫体内,并引发线虫的系统性RNA干扰反应,导致其出现寄生、发育、代谢、运动等障碍甚至致死,从而使转基因植物实现对寄生线虫的抗性.本文综述了RNAi介导的抗根结线虫基因工程方面的研究进展,分析探讨了这种新的策略的特点并展望了它的应用前景.     

RNA干扰技术在植物线虫基因功能研究及虫害防治方面的应用

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是双链RNA（double—stranded RNA,dsRNA）介导的同源mRNA特异降解的过程,具有高效性、非绝对特异性和表型可遗传性。其在遗传育种、基因功能研究、药物研发等各方面具有广泛的运用前景。近年已应用到植物线虫基因功能的研究中。随着对植物线虫基因组及基因功能研究的不断深入。RNAi技术在植物线虫防治方面的研究也取得了很大进展。     

RNA干涉及其在棉花研究中的应用

RNA干涉(TNA interference,RNAi)技术是一门新兴的基因阻断技术,可通过将外源双链RNA导入细胞介导同源靶基因mRNA序列的降解,使靶基因表达沉默,是一种转录后的基因沉默现象.目前,RNA干涉技术在植物研究中已经得到广泛应用.本文简介了植物的RNA干涉研究及RNAi表达载体的构建,综述了RNAi在棉花基因功能和功能基因组学研究、棉花品质性状的遗传改良和棉花的抗虫抗病研究中的应用进展及其在棉花研究中存在的主要问题和应用前景.     

植物MicroRNA介导的基因调控在作物改良中的应用潜能

植物Micro RNAs(mi RNAs)是长度约22个核苷酸的內源、单链、非编码、小分子RNA,通过降解或抑制靶m RNA介导转录后沉默。随着高通量测序技术及各种研究技术的进步,越来越多的micro RNA被测序和验证,为利用基因工程手段进行作物改良提供了丰富的候选基因资源。综述了mi RNAs在生物胁迫、非生物胁迫和植物生长发育等方面的最新研究进展,同时分析了mi RNAs介导的基因调控在作物改良中的应用潜能,并介绍了几种基于mi RNA作用机制的植物基因工程改良作物的转基因新技术,如靶基因RNAi,人工mi RNAs(ami RNAs),Target Mimics(TM),超表达mi RNA-resistant tagerts;也讨论了基于mi RNA作用机制的转基因技术所面临的风险和挑战。     

生物育种新技术作物的安全管理

生物育种新技术（new breeding techniques,NBTs）是指基于分子生物学工具进行作物分子育种的一类新技术,可以短期内使作物产生新的有利性状,促进作物新品种的开发,如基因编辑技术、RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术、同源转基因技术等。这些新技术目前正在全球农业育种中广泛应用,并且已有部分作物新品种获准商业化生产。然而,针对生物育种新技术产生的作物新品种的安全性和安全管理政策,全球尚未达成统一共识,对其安全监管的思考也不尽相同,限制了这些作物新品种的研发和商业化应用进程。综述了现阶段全球主要发达国家对于生物育种新技术作物的安全性和监管方面实施的管理政策和法规,以期对我国生物育种新技术作物的安全性管理政策的制定提供一定的借鉴。     

人工 microRNA 技术研究进展

RNA干扰（RNAi）是由双链RNA触发的在mRNA水平进行的特异靶序列的基因沉默现象,广泛存在于动物、植物和病毒中,主要包括小干扰RNA（siRNA）及微小RNA（miRNA）两种作用途径。人工miRNA（amiRNA）是将天然miRNA的成熟序列替换成人工设计的靶向其他感兴趣基因的反义序列,通过天然miRNA的生成和作用途径达到RNAi的效果,具有干扰效果明显、作用迅速、毒性低等优点,拥有广阔的应用前景。我们对基于amiRNA的基因沉默技术进行了较为系统的介绍和总结,梳理了该技术的优缺点和适用范围,并展望了其进一步发展的方向和应用前景。     

水稻重复序列RRD3:植物启动子及其在RNA干涉中的应用

RRD3是通过复性动力学从水稻基因组中克隆到的一个中度重复序列,序列分析揭示其含有多个保守的启动子元件,包括4个TATA-boxes和CAAT-box,在Escherichia coli及哺乳动物表达系统中均表现出启动子活性。我们将RRD3片段插入到植物启动子捕获载体pCAMBIA1391Z中,检测RRD3片段是否在植物中也有启动子活性,转基因烟草再生植株和水稻愈伤组织均显示了gusA基因的表达,表明其在单子叶和双子叶植物中均可行使启动子功能。基于RRD3的双效启动子特性,我们设计并构建了植物通用双元RNAi载体pCRiRRD3,适于进行植物的RNA干涉实验研究。我们在植物RNAi载体pCRiRRD3的内含子(200bp)的上下游分别引入了2个多克隆位点,方便了正义及反义片段的接入。转基因烟草植株的GUS组织化学及荧光定量分析表明该载体可有效进行RNA沉默。这些研究结果表明,利用单子叶和双子叶双效活性的RRD3启动子而构建的植物RNAi载体,可同时有效地应用于大部分单子叶和双子叶植物的RNAi实验及研究。     

发根农杆菌介导丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶1基因RNA干扰载体的转化

目的：利用发根农杆菌ACCC10060介导丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶1基因（SmGGPS1）RNA干扰（RNAi）载体转化丹参叶片,生成SmGGPS1的RNAi转基因毛状根。方法：根据已克隆到的SmGGPS1特异区域设计并合成2段RNAi序列,分别插入RNAi双元载体pK7GWIWG2D（Ⅱ）中,构建2个含卡那霉素（Kan）和绿色荧光蛋白（GFP）双筛选标记的植物表达载体pK7GWIWG2D（Ⅱ）-SmGGPS1-RNAi2和pK7GWIWG2D（Ⅱ）-SmGGPS1-RNAi3;利用带有上述2个RNAi载体的发根农杆菌ACCC10060侵染丹参叶片,诱导生成转基因毛状根;通过Kan抗性筛选和GFP绿色荧光观察统计转化率。结果：分别得到SmGGPS1-RNAi2和SmGGPS1-RNAi3转基因毛状根301根和399根,平均转化率为60.34%。结论：首次建立了发根农杆菌介导的外源基因转化丹参的体系。     

RNAi技术在作物品质改良中的应用

RNA干涉(RNAi)是由同源性内源或外源dsRNA引起的序列特异性基因沉默现象,在动、植物和真菌中广泛存在并被证实。目前已应用RNAi技术在改善油脂的品质、改良淀粉品质、提高营养物质或降低有害物质含量、提高抗褐化能力、提高果实耐贮性、进行代谢调控以获得目的次生代谢物等方面进行了作物品质改良研究。作为一种下调表达技术,该技术在研究植物基因功能和改良作物品质等领域有良好的应用前景。本文重点从上述六个方面对近年来应用RNAi技术在作物品质改良研究方面进行了回顾并对其存在的问题作了初步探讨。     

RNA干扰技术在昆虫学领域研究进展

RNA干扰(RNAi)是生物体内源基因发生转录后特异性降解的一种生理现象,广泛存在于生物体内。RNAi主要由小干扰RNA诱发阻碍目的基因的翻译或转录,造成目标信使RNA沉默。RNAi具有高效、特异性强等优点,被广泛应用于昆虫基因功能研究,并显示出了开发新型病虫害管理策略的巨大潜力。主要阐述了RNAi的沉默机制,双链RNA转入昆虫体内的几种方式,以及RNAi技术在不同目昆虫中研究的最新进展。最后,对RNAi技术存在的不足之处进行了简单总结,还对RNAi技术在害虫防治中的应用进行了展望,以期为该技术广泛应用于农业害虫防治提供理论支持。     

Feasibility,limitation and possible solutions of RNAi‐based technology for insect pest control

Abstract Numerous studies indicate that target gene silencing by RNA interference (RNAi) could lead to insect death. This phenomenon has been considered as a potential strategy for insect pest control, and it is termed RNAi‐mediated crop protection. However, there are many limitations using RNAi‐based technology for pest control, with the effectiveness target gene selection and reliable double‐strand RNA (dsRNA) delivery being two of the major challenges. With respect to target gene selection, at present, the use of homologous genes and genome‐scale high‐throughput screening are the main strategies adopted by researchers. Once the target gene is identified, dsRNA can be delivered by micro‐injection or by feeding as a dietary component. However, micro‐injection, which is the most common method, can only be used in laboratory experiments. Expression of dsRNAs directed against insect genes in transgenic plants and spraying dsRNA reagents have been shown to induce RNAi effects on target insects. Hence, RNAi‐mediated crop protection has been considered as a potential new‐generation technology for pest control, or as a complementary method of existing pest control strategies; however, further development to improve the efficacy of protection and range of species affected is necessary. In this review, we have summarized current research on RNAi‐based technology for pest insect management. Current progress has proven that RNAi technology has the potential to be a tool for designing a new generation of insect control measures. To accelerate its practical application in crop protection, further study on dsRNA uptake mechanisms based on the knowledge of insect physiology and biochemistry is needed.     

应用RNAi技术培育抗TMV病毒转基因烟草

利用烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白基因构建RNAi干涉载体, 通过叶盘法转化至烟草K326 和龙江911两个栽培品种。对转基因株系的荧光定量PCR分析表明, 不同转基因株系的病毒RNA靶序列都得到一定程度的降解, 抗病性鉴定结果证实, 转基因K326和龙江911两个栽培品种的转基因材料分别有83％和90％转基因株系对TMV呈现免疫级抗性。     

转基因RNAi技术在动物抗病毒育种中的应用

病毒对动物和人类健康都是极大的威胁,抗病毒疫苗虽然能在一定程度上预防病毒病,但目前几乎还不能对变异的传染病进行抗病毒治疗。尽管RNA干扰研究到目前才短短十几年,其作用机理已基本清楚。RNAi能够非常有效的抑制病毒体内复制,其介导的抗病转基因动物的研究相继取得了阶段性进展,抗疯牛病转基因羊和牛,抗内源性逆转录病毒猪以及抗核型多角体病毒病的转基因家蚕已经成功获得。尽管如此,目前的研究主要还是集中在细胞水平及小鼠模型方面,获得的转基因动物种类和数量有限,但为培育动物抗病毒品种提供了理论依据和技术支撑。随着转基因技术的不断的进步和成熟, RNA干扰技术将成为动物抗病毒育种中最有应用前景的方法之一。     

pSAT RNA interference vectors: a modular series for multiple gene down-regulation in plants

RNA interference (RNAi) is a powerful tool for functional gene analysis, which has been successfully used to down-regulate the levels of specific target genes, enabling loss-of-function studies in living cells. Hairpin (hp) RNA expression cassettes are typically constructed on binary plasmids and delivered into plant cells by Agrobacterium-mediated genetic transformation. Realizing the importance of RNAi for basic plant research, various vectors have been developed for RNAi-mediated gene silencing, allowing the silencing of single target genes in plant cells. To further expand the collection of available tools for functional genomics in plant species, we constructed a set of modular vectors suitable for hpRNA expression under various constitutive promoters. Our system allows simple cloning of the target gene sequences into two distinct multicloning sites and its modular design provides a straightforward route for replacement of the expression cassette's regulatory elements. More importantly, our system was designed to facilitate the assembly of several hpRNA expression cassettes on a single plasmid, thereby enabling the simultaneous suppression of several target genes from a single vector. We tested the functionality of our new vector system by silencing overexpressed marker genes (green fluorescent protein, DsRed2, and nptII) in transgenic plants. Various combinations of hpRNA expression cassettes were assembled in binary plasmids; all showed strong down-regulation of the reporter genes in transgenic plants. Furthermore, assembly of all three hpRNA expression cassettes, combined with a fourth cassette for the expression of a selectable marker, resulted in down-regulation of all three different marker genes in transgenic plants. This vector system provides an important addition to the plant molecular biologist's toolbox, which will significantly facilitate the use of RNAi technology for analyses of multiple gene function in plant cells.     

MicroRNA-mediated gene regulation: potential applications for plant genetic engineering

Food security is one of the most important issues challenging the world today. Any strategies to solve this problem must include increasing crop yields and quality. MicroRNA-based genetic modification technology (miRNA-based GM tech) can be one of the most promising solutions that contribute to agricultural productivity directly by developing superior crop cultivars with enhanced biotic and abiotic stress tolerance and increased biomass yields. Indirectly, the technology may increase usage of marginal soils and decrease pesticide use, among other benefits. This review highlights the most recent progress of transgenic studies utilizing various miRNAs and their targets for plant trait modifications, and analyzes the potential of miRNA-mediated gene regulation for use in crop improvement. Strategies for manipulating miRNAs and their targets in transgenic plants including constitutive, stress-induced, or tissue-specific expression of miRNAs or their targets, RNA interference, expressing miRNA-resistant target genes, artificial target mimic and artificial miRNAs were discussed. We also discussed potential risks of utilizing miRNA-based GM tech. In general, miRNAs and their targets not only provide an invaluable source of novel transgenes, but also inspire the development of several new GM strategies, allowing advances in breeding novel crop cultivars with agronomically useful characteristics.