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1.
[目的]构建牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)菌毛蛋白(FimA)与霍乱毒素B亚基(CTB)重组质粒pET-32a/CTB-FimA,表达纯化CTB-FimA融合蛋白并对其黏膜免疫效果进行研究。[方法]根据GenBank查找FimA基因和CTB基因,利用(Gly4Ser)3连接肽序列构建pET-32a/CTB-FimA原核表达质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),确定IPTG诱导浓度及温度,SDS-PAGE分析目的蛋白的可溶性;采用亲和层析和凝胶过滤层析纯化目的蛋白CTB-FimA;用纯化的目的蛋白作为免疫原鼻腔滴注免疫BALB/c小鼠观察其黏膜免疫效果。[结果]经双酶切和测序鉴定pET-32a/CTB-FimA重组表达质粒构建成功;IPTG最适诱导浓度为0.5 mmol/L,最适诱导温度为23℃,重组蛋白CTB-FimA主要以可溶形式表达;Expasy软件ProtParam工具预测重组蛋白分子量约为72.08 kDa,亲水性总平均值为-0.313;每升发酵液表达CTB-FimA蛋白约100 mg;免疫... 相似文献
2.
[目的]构建小鼠cofilin2原核表达载体并纯化表达产物。[方法]以胚胎期小鼠心脏组织的c DNA为模板PCR扩增cofilin2基因,经酶切连接表达载体PGEX-4T-1后转化入大肠杆菌E. coli BL21感受态细胞中,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达及优化,利用SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝R-250进行染色,检测GST-cofilin2的表达情况。通过谷胱甘肽树脂(Glutathione Resin)亲和层析进行纯化,最后通过Western Blot进行验证。[结果]PCR成功扩增cofilin2基因,双酶切及测序结果表明p GEX-4T-1-cofilin2原核表达载体构建成功,SDS-PAGE鉴定表明,在22℃、200μmol/L的IPTG能诱导出大量可溶性的GST-cofilin2蛋白,分子量为43 k Da。Western Blot验证得到纯化的GST-cofilin2。[结论]成功构建小鼠cofilin2原核表达载体,纯化得到的重组小鼠cofilin2蛋白可用于后续的生物学研究。 相似文献
3.
[目的]在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌spaA基因并纯化重组蛋白。[方法]利用PCR扩增猪丹毒丝菌临床分离株spaA基因,构建重组质粒p GEX-4T-1-spaA,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达融合蛋白GST-SpaA,并优化表达条件。最后采用GST琼脂糖纯化树脂纯化,SDS-PAGE和Western Blotting检测。[结果]成功扩增spaA基因,获得重组表达菌株BL21(DE3)/p GEX-4T-1-spaA;在菌体OD600为0. 9时,加入IPTG至终浓度0. 1 mmol/L,34℃诱导6 h的条件下表达效果最好。经SDS-PAGE检测和纯化后得到大小为97 kDa的GST-SpaA; Western Blotting检测结果表明,GST-SpaA具有良好的免疫原性。[结论]成功在大肠杆菌中表达了SpaA蛋白,经纯化得到具有免疫原性的重组蛋白,为后续研制猪丹毒丝菌SpaA蛋白亚单位疫苗奠定基础。 相似文献
4.
[目的]预测沙眼衣原中类噬菌体衣壳蛋白CtF的空间结构,表达重组蛋白并制备多克隆抗体。[方法]采用SOPMA和I-TASSER等软件预测CtF的空间结构,利用MEGA6分析其系统发育关系;构建重组质粒pET-28a-CtF,转化至E.coli BL21(DE3)中进行克隆表达;纯化重组蛋白免疫ICR小鼠制备多克隆抗体。[结果]CtF蛋白包含八股β桶状核心结构和环形延伸结构,与已知的衣原体噬菌体VP1蛋白遗传距离较近;重组质粒表达相对分子量约为64 kDa的融合蛋白;免疫小鼠获得免疫血清效价达1∶12 800。[结论]CtF蛋白疑似为沙眼衣原体噬菌体的衣壳蛋白;重组质粒表达相对分子量约为64 kDa蛋白,该蛋白免疫原性良好,为进一步研究其功能奠定了基础。 相似文献
5.
[目的]旨在原核表达Ets-1基因,纯化获得GST-Ets-1融合蛋白。[方法]以SD大鼠脑垂体cDNA为模板,利用PCR扩增含有Bam HI和Not I酶切位点的Ets-1基因;然后将其克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中,将正确的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3);用IPTG诱导表达,再利用Magne GST particles亲和纯化GST-Ets-1融合蛋白;最后通过Western blot鉴定此融合蛋白。[结果]成功构建pGEX-4T-1-Ets-1原核表达载体;30℃条件下,0.2 mmol/L的IPTG能诱导出大量的可溶性GST-Ets-1蛋白;经Magne GST particles纯化的GST-Ets-1蛋白可被识别ETS-1的抗体特异识别。[结论]纯化的GST-Ets-1蛋白可用于后续的生物学研究。 相似文献
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鸡γ干扰素的可溶性表达及纯化产物的抗病毒活性 总被引:3,自引:0,他引:3
【目的】克隆鸡γ-干扰素(chIFN-γ)基因,大肠杆菌表达及产物纯化与活性检测。【方法】通过RT-PCR方法用ConA刺激的20日龄SPF鸡的脾脏淋巴细胞中扩增出chIFN-γ成熟蛋白基因cDNA,克隆至原核表达载体pET-32a (+),构建重组表达质粒pET-32a (+)-chIFN-γ,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,利用镍柱亲和层析法纯化可溶性蛋白,并进行SDS-PAGE、Western blot鉴定。利用MDCK-VSV系统测定抗病毒活性。【结果】克隆得到456 bp 的chIFN-γ成熟蛋白编码基因,大肠杆菌中成功表达chIFN-γ蛋白,分子量约为31.0 kDa,能与抗His的单克隆抗体和兔源多抗血清发生特异性反应。表达蛋白一部分形成包涵体,另一部分以可溶形式存在,可溶性蛋白经镍柱在天然条件下的纯化得率为3.0 mg/mL。生物学活性试验表明,1:32 稀释纯化的重组chIFN-γ (rchIFN-γ)孵育MDCK细胞后能抵抗100TCID50的VSV攻击。【结论】通过镍柱天然纯化获得的rchIFN-γ具有较好的抗病毒活性,为研制新型抗病毒干扰素制剂奠定基础。 相似文献
7.
目的:克隆人抗酶抑制因子-1(ornithine decarboxylase antizyme inhibitor-1,OAZI-1)cDNA,建立在大肠杆菌中原核表达并纯化人OAZI-1蛋白的实验技术。方法:巢式RT-PCR法从人A549总RNA中扩增人OAZI-1 cDNA并构建pET-28a/OAZI-1原核表达质粒。该质粒转化大肠杆菌原核表达菌BL21(DE3)后IPTG诱导表达。诱导表达出的重组蛋白用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。SDS-PAGE和Western法检测重组OAZI-1蛋白的表达和纯化。结果:成功克隆出编码全长人OAZI-1的cDNA序列,并构建出原核表达质粒pET-28a/OAZI-1。DNA测序分析,重组质粒中的OAZI-1 cDNA无突变,与6×His标签框架对接正确。重组质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中后,可用IPTG诱导表达出重组OAZI-1蛋白,该重组蛋白可用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。结论:成功建立了人抗酶抑制因子的原核表达和纯化的实验方法,为后续OAZI-1的功能研究奠定了基础。 相似文献
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目的:在大肠杆菌中表达苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒P6.9蛋白并制备抗体,研究P6.9的自身互作。方法:用PCR方法扩增p6.9基因,将其分别克隆到原核表达载体pMAL-c2x、pGEX-4T-1、pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。选取可溶性较好的融合蛋白纯化后免疫家兔制备抗体。然后利用该抗体进行Western blot检测、分析P6.9的自身互作。结果:构建了pMAL-P6.9、pGEX-P6.9、pET-P6.9三种原核表达质粒,分别在大肠杆菌中经IPTG诱导表达产生了与预期分子量相符的MBP-P6.9(49.4kDa)、GST-P6.9(32.9kDa)、HIS-P6.9(12.5kDa)融合蛋白。制备了P6.9的多克隆抗体,能与P6.9蛋白发生特异反应。Pull-down结果表明P6.9自身互作。结论:获得了兔抗P6.9的多克隆抗体,为深入研究P6.9的功能提供了检测工具。证明了P6.9之间的互作,说明该蛋白功能的发挥可能是通过多聚体起作用的。 相似文献
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为了解人类肠道病毒68型3A蛋白可溶区的结构,本研究构建了EV-D68 3A蛋白可溶区的原核表达载体,在大肠杆菌中表达、纯化并对其结构进行了初步研究。首先,采用PCR的方法扩增EV-D68 3A(1~61)基因片段,克隆至原核表达载体pET-28a-His-SUMO中,转化进入BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达出His-SUMO-3A(1~61)融合蛋白。经Ni-NTA树脂亲和层析初步纯化后得到大量融合蛋白,利用ULP酶酶切去除His-SUMO标签,通过Ni-NTA树脂亲和层析、阴离子交换层析柱、分子筛层析等方法分离标签并进一步纯化目的蛋白。最后通过化学交联反应检测目的蛋白的多聚化状态。结果显示,利用pET28a-His-SUMO-3A(1~61)原核表达载体能够在大肠杆菌中成功表达出大量可溶性的融合蛋白;经过多步纯化方法得到了大量高纯度的目的蛋白,平均每升大肠杆菌可得到约5mg目的蛋白,纯度达95%以上;通过化学交联反应证明了该蛋白的多聚化存在形式。本研究成功建立了EV-D68 3A蛋白可溶区的表达和纯化系统,为进一步获得3A蛋白晶体、研究3A蛋白功能以及设计以3A为靶点的抗病毒药物奠定了基础。 相似文献
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重组人肝刺激物在原核细胞中的表达与纯化 总被引:3,自引:0,他引:3
利用基因重组技术 ,构建成人肝刺激因子 (hHSS)和谷胱甘肽转移酶 (GST)融合表达载体 ,转化大肠杆菌BL 2 1(DE3 ) ,以His·Tag亲和层析纯化表达产物 ,FactorXa切割分离hHSS单体 ,并检测其生物学活性。结果显示 ,在pET 4 2a表达体系中hHSS以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在 ,GST hHSS表达量占菌体可溶性蛋白的3 0 % ;FactorXa切割GST与hHSS之间肽腱 ,得到 3 3和 15kD两条蛋白带 ,经Western杂交证实 3 3kD条带为GST ,而 15kD条带的分子量与hHSS基因序列推测蛋白结果相符。经His·Tag再次纯化可获得hHSS单体 ,初步证实重组hHSS具有促进肝癌细胞增殖活性 相似文献
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[目的]表达纯化穿透支原体(Mycoplasma penetrans)铁蛋白(Ferritin)并利用生物信息学方法分析该蛋白的生物学特性。[方法]从NCBI网站上查到Mpe Ferritin的DNA和蛋白序列,并合成Ferritin基因,设计PCR引物,以合成基因为模板扩增Ferritin片段,将其与pET15b载体连接,将连接产物转化到大肠杆菌Top10感受态细胞。挑取阳性菌落,利用PCR和测序验证,提取质粒pET15b-Ferritin并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导目的蛋白表达,并使用Ni2+亲和法纯化Ferritin蛋白。然后用生物信息学方法分析Ferritin蛋白的生物学特性。[结果]Mpe Ferritin基因全长为540 bp,编码180个氨基酸。成功构建重组质粒pET15b-Ferritin,表达并纯化得到Ferritin蛋白。Ferritin蛋白定位于细胞质,无信号肽。它的α-螺旋占71.5%,β-转角占6.7%,延伸链占5.0%,无规卷曲占16.8%。由24个同源Ferritin蛋白分子组成24聚体。[结论]通过基因工程方法纯化得到Ferritin蛋白并分析了Ferritin的生物学性质。 相似文献
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将去除信号肽编码序列的鹅IL-2基因克隆到原核表达载体pET-28a (+), 构建了重组表达质粒pET-28a (+)-goIL-2, 转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞, 经IPTG诱导, 实现了重组鹅IL-2(rgoIL-2)蛋白在大肠杆菌中的表达。SDS-PAGE和Western-blotting分析显示, 表达蛋白的分子量约为15.0 kD, 能被抗鹅IL-2单克隆抗体特异识别。可溶性分析表明表达蛋白大部分以包涵体形式存在, 部分以可溶形式存在, 非变性电泳可见可溶性蛋白存在单体和多聚体组分。镍柱亲和层析法纯化的rgoIL-2蛋白过滤后, 利用?KTA FPLC(快速蛋白分离纯化系统)进行逐级分离, 非变性电泳可见单一的鹅IL-2可溶性蛋白单体。体外生物学活性分析显示鹅IL-2可溶性蛋白单体能刺激鹅淋巴细胞增殖。这为进一步研究鹅IL-2的生物学功能及其临床应用奠定基础。 相似文献
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将去除信号肽编码序列的鹅IL-2基因克隆到原核表达载体pET-28a (+), 构建了重组表达质粒pET-28a (+)-goIL-2, 转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞, 经IPTG诱导, 实现了重组鹅IL-2(rgoIL-2)蛋白在大肠杆菌中的表达。SDS-PAGE和Western-blotting分析显示, 表达蛋白的分子量约为15.0 kD, 能被抗鹅IL-2单克隆抗体特异识别。可溶性分析表明表达蛋白大部分以包涵体形式存在, 部分以可溶形式存在, 非变性电泳可见可溶性蛋白存在单体和多聚体组分。镍柱亲和层析法纯化的rgoIL-2蛋白过滤后, 利用?KTA FPLC(快速蛋白分离纯化系统)进行逐级分离, 非变性电泳可见单一的鹅IL-2可溶性蛋白单体。体外生物学活性分析显示鹅IL-2可溶性蛋白单体能刺激鹅淋巴细胞增殖。这为进一步研究鹅IL-2的生物学功能及其临床应用奠定基础。 相似文献
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人IGF-1在大肠杆菌中的可溶表达和纯化 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:在大肠杆菌中的可溶表达和纯化人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)。方法:根据hIGF-1的氨基酸序列和大肠杆菌密码子偏爱性,利用重叠延伸PCR的方法合成hIGF-1DNA序列,构建表达载体,在大肠杆菌OrigamiB(DE3)中与硫氧还蛋白TrxA融合表达,并通过盐析和镍柱亲合层析进行纯化。结果:SDS-PAGE分析显示,重组融合蛋白以可溶形式存在,分子量约为28kDa,占上清总蛋白的50%以上。经盐析和镍柱亲合层析进行纯化,目标蛋白纯度可达到90%左右。结论:复合干扰素在大肠杆菌中的高效可溶表达。 相似文献
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抗菌肽GK1在大肠杆菌中的融合表达 总被引:1,自引:1,他引:1
为高效表达抗菌肽GK1并避免GK1的高抗菌活性对大肠杆菌宿主菌的致命影响, 将经改造后的人胰岛素原(mhPI)与GK1的融合基因(mhPI-GK1)克隆到表达载体pET28a中, 构建出表达质粒pET28a-mhPI-GK1, 转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达, 表达量占菌体总蛋白的20%。经CNBr裂解、阳离子交换层析和RP-HPLC纯化后, 每升发酵液可获得5.7 mg纯度大于97%的重组GK1。质谱检测显示重组GK1的分子量为2794.0 D, 抑菌活性实验表明纯化后的重组GK1和化学合成GK1具有相同的抗菌活性。为利用基因工程方法大规模生产GK1奠定了基础。 相似文献
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[目的]将新筛选出的苍白杆菌菌株中的核糖-5-磷酸异构酶B(Rpi B)克隆到大肠杆菌中进行异源表达优化。[方法]以苍白杆菌菌株基因组为模板PCR扩增Rpi B基因,经酶切连接表达载体p ET-28a后转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达及优化,利用SDS-PAGE分析表达情况。通过LC-MS-MS验证重组酶活性。[结果]SDS-PAGE分析表明,核糖-5-磷酸酶在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白,分子量在19 k Da左右。优化结果表明在16℃下需要IPTG诱导20 h后蛋白表达量最多。重组粗酶液在30℃下转化L-鼠李糖为L-鼠李酮糖,转化率为19%。[结论]成功克隆并表达出来源于苍白杆菌的Rpi B酶,它对其非天然底物糖L-鼠李糖表现出了异构酶活性。 相似文献
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[目的]在大肠杆菌表达系统表达UvrB蛋白,优化其表达和纯化的条件,并初步研究其对抗紫外线伤害的功能。[方法]克隆大肠杆菌MG1655菌株UvrB编码序列,采用酶切连接的方法构建表达载体p Waldo-GFP-UvrB,并转入BL21(DE3)表达菌株诱导蛋白质表达,采用Ni-NTA亲和层析以及分子筛层析的方法纯化蛋白质,采用紫外光刺激的方法研究其细胞内功能。[结果]成功构建UvrB表达载体,获得UvrB在BL21(DE3)中重组菌株,其表达条件为22℃,0. 2 mmol/L IPTG诱导20 h,UvrB以可溶蛋白的形式存在。SDS-PAGE结果显示UvrB蛋白质分子量约76 k Da与预期相符;经纯化后UvrB蛋白质得率约为0. 6 mg/L培养基,纯度> 85%,为其进一步研究奠定了基础。[结论]研究克隆并构建了大肠杆菌UvrB蛋白的原核表达体系,优化了其纯化方案,得到纯度> 85%的可溶UvrB蛋白质,为进一步研究UvrB蛋白质功能奠定了基础。 相似文献
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为进一步深入研究我国人群中轮状病毒主要流行的P[4]、P[6]和P[8]型毒株的受体结合特点及结构基础,本研究将P[4]、P[6]和P[8]型毒株VP8*核心区(VP8*core)基因分别构建到原核表达载体pGEX4T-1和pET30a中,利用大肠杆菌表达获得轮状病毒P[4]、P[6]和P[8]型毒株VP8*核心区蛋白,并通过亲和层析分别纯化得到VP8*core-GST融合蛋白和VP8*-his标签蛋白,SDS-PAGE显示蛋白大小分别为46kDa和20kDa。综上,本研究成功构建了pGEX4T-1-VP8*core和pET30a-VP8*core重组质粒,利用原核表达系统得到VP8*coreGST融合蛋白和VP8*core-his蛋白,为VP8*蛋白的功能和结构研究提供基础。 相似文献
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[目的]构建大肠杆菌功能未知基因ybf E的pET16b、pET32a和p GEX-4T-1三种原核表达系统,通过对比表达水平筛选出最优表达体系,并纯化表达的可溶性Ybf E融合蛋白。[方法]使用pET16b、pET32a和p GEX-4T-1表达质粒构建pET16b-ybf E、pET32a-ybf E和p GEX-4T-1-ybf E原核表达载体,分别转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达Ybf E融合蛋白,对三种表达系统的表达水平进行对比,并对pET16b-ybf E和pGEX-4T-1-ybf E表达体系的裂菌上清中的可溶性Ybf E融合蛋白液分别使用镍柱和GST蛋白纯化柱纯化。[结果]构建了pET16b-ybf E、pET32a-ybf E和p GEX-4T-1-ybf E原核表达体系,并使用IPTG诱导表达Ybf E融合蛋白。ybf E在p GEX-4T-1载体内的表达水平最高,接下来依次为pET16b和pET32a。pET16b-ybf E和p GEX-4T-1-ybf E表达的可溶性Ybf E融合蛋白纯化后浓度分别为86μg/m L和724μg/m L。[结论]成功构建了ybf E基因的三种原核表达系统,筛选出最佳表达体系,可溶性Ybf E融合蛋白得到纯化。 相似文献