错配修复蛋白Mlh3对四膜虫有性生殖是必需的

DNA错配修复(mismatch repair, MMR)是一种进化中保守的机制,它校正DNA复制过程中产生的错误,维持基因组的稳定性。MMR家族蛋白同时也参与多种DNA相关的生物学功能。本研究从嗜热四膜虫鉴定了一种新的错配修复蛋白MLH3基因,该基因预测编码 319 个氨基酸,在有性生殖期特异表达。免疫荧光定位表明,HA-Mlh3定位在有性生殖期减数分裂的小核和新发育的大核中。MLH3 敲除的突变体细胞株,在有性生殖发育期停滞在两大核和两小核阶段,新大核DNA复制受阻。γ-H2A.X 检测表明,新大核和小核有性生殖后期断裂的基因组不能正常修复,发育中的细胞裂解,不能形成有性生殖后代。结果表明,Mlh3参与四膜虫新大核发育过程基因组的断裂修复和复制,对四膜虫的有性生殖是必需的。     

金属离子促进嗜热四膜虫错配修复蛋白Mlh3核酸内切酶活性

嗜热四膜虫有性生殖过程中生殖系小核延伸并活跃转录,减数分裂过程中染色体同源重组起始于程序化的DNA双链断裂的形成,DNA错配修复系统能够去除DNA复制过程中所引起的错配并促进同源重组。减数分裂特异表达的错配修复因子Mlh3对四膜虫的有性生殖是必需的,然而具体功能并不清楚。本研究人工合成MLH3（TTHERM_001044369）基因,构建重组表达质粒pGEX-MLH3, 转化大肠杆菌BL21（DE3）并获得重组表达的GST-Mlh3蛋白。纯化的GST-Mlh3蛋白在配位不同的金属离子Cu2+、Mn2+、Mg2+后,有效切割超螺旋质粒DNA。ATP和ADP可进一步促进Mlh3的核酸内切酶活性。突变Mlh3中离子结合模体DQHA(X)2E(E)4E中的D117和E123位点,Mlh3D117N/E123A的核酸内切酶活性降低。进一步删除离子结合和ATP结合位点的C端结构域,突变体的核酸内切酶活性进一步降低,表明Mlh3的核酸内切酶活性是离子依赖型。减数分裂期HA-Mlh3免疫共沉淀鉴定了Mlh3可能的相互作用因子链交换蛋白Dmc1、DSB修复蛋白Mnd1、MutS、染色体维持蛋白Smc2和Smc4。结果表明,四膜虫的Mlh3通过金属离子依赖的内切酶活性,以及与其他因子相互作用,在减数分裂错配修复和同源重组过程中发挥重要作用。     

驱动蛋白Kin11调控嗜热四膜虫生殖系小核的减数分裂

驱动蛋白(kinesin)是分子马达蛋白质超家族成员,主要参与囊泡与细胞器的运输、纺锤体组装、有丝分裂和减数分裂等过程。在减数分裂期,不同驱动蛋白发挥功能的调控机制并不十分清楚。嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)中含有14个驱动蛋白家族成员。其中,kinesin-6家族的唯一成员Kin11(TTHERM_00637750),在营养生长期低表达,饥饿期不表达,有性生殖期表达上调。Kin11编码1608个氨基酸,包含1个N端保守的马达蛋白结构域,C端卷曲螺旋(coiled-coil)结构域,并在N端和C端分别含有核定位信号NLS1和NLS2。Kin11在营养生长期和有性生殖期,定位在有丝分裂和减数分裂的小核和纺锤体上,并在有性生殖后期alignment阶段定位于小核上。Kin11与微管蛋白共定位于有丝分裂和减数分裂的纺锤体上。将Kin11的N端含有NLS1的1~400位氨基酸序列截短后,截断突变体定位在有性生殖减数分裂期的小核和纺锤体上。而将其C端含有NLS2的1008~1608位氨基酸残基截短后,截断突变体只能定位在有丝分裂和减数分裂后期的小核及有丝分裂的纺锤体上。敲除KIN11导致减数分裂过程中的纺锤体结构发生异常变化,小核染色体不均等分离与丢失,有性生殖发育停滞。结果表明,嗜热四膜虫驱动蛋白Kin11通过影响纺锤体结构,参与调控四膜虫生殖系小核在减数分裂过程中的正常分离。     

嗜热四膜虫δ微管蛋白基因的克隆、鉴定及细胞定位

微管蛋白(tubulin)在细胞的结构和功能中发挥着重要作用, α微管蛋白和 β微管蛋白是组成微管的主要因子,γ微管蛋白促使α和β微管蛋白二聚体组装为微管结构. 然而, 4种新的微管蛋白δ-,ε-,ζ-, 和η- tubulin在细胞中的功能并不完全清楚. 本研究从嗜热四膜虫大核基因组数据库中鉴定了一种新的编码δ微管蛋白基因（Tetrahymena delta tubulin 1, TDT1, TTHERM_00335970, http://www. ciliate. org）, TDT1基因转录产生1 326 bp和 1 363 bp两种不同的转录本, 1 326 bp的转录本编码441个氨基酸的多肽; 而1 363 bp的转录本含有37 bp未剪切的内含子序列, 从而导致开发读框发生移码突变现象. 实时荧光定量PCR结果表明, TDT1基因在四膜虫细胞营养生长和有性生殖过程中都有表达, 且在有性生殖过程中的表达显著上调. 免疫荧光定位表明, TDT1蛋白不仅定位于四膜虫基体和有性生殖期conjugation junction结构, 而且在四膜虫的大核和小核中也有定位. TDT1基因敲除发现,该基因不能通过表型分配完全被巴龙霉素抗性基因替代, 结果表明, TDT1蛋白在四膜虫细胞中可能具有多种不同的功能, 它的正常表达对四膜虫细胞的生存是必需的.     

过表达周期蛋白Cyc28影响四膜虫的有性生殖进程北大核心CSCD

真核生物的细胞周期通过连续的激活和失活特定的周期蛋白/周期蛋白依赖性激酶复合物活性进行调控。嗜热四膜虫含有34种周期蛋白,有性生殖期特异表达的周期蛋白Cyc2和Cyc17在四膜虫小核减数分裂中发挥重要功能。本研究从嗜热四膜虫中鉴定出一种新的周期蛋白CYC28(TTHERM_00082190)基因,预测编码266个氨基酸。实时荧光定量PCR表明,CYC28在有性生殖时期特异表达,且在4 h表达水平最高。通过同源重组构建获得MTT1启动子调控下的HA-CYC28突变体细胞。免疫荧光定位表明,HA-Cyc28定位在细胞质和凋亡的亲本大核中。分别构建CYC28敲除突变株和RNA干扰细胞株,对CYC28敲减突变体细胞的分析发现,营养生长和有性生殖期突变细胞发育正常。然而,过表达株Cyc28突变体引起原核染色体排列异常,原核不能完成有丝分裂形成配子核,有性生殖进程终止。结果表明,Cyc28参与细胞的有性生殖进程,它的正常表达和降解对原核有丝分裂的完成是必需的。     

过表达周期蛋白Cyc28影响四膜虫的有性生殖进程

真核生物的细胞周期通过连续的激活和失活特定的周期蛋白/周期蛋白依赖性激酶复合物活性进行调控。嗜热四膜虫含有34种周期蛋白,有性生殖期特异表达的周期蛋白Cyc2和Cyc17在四膜虫小核减数分裂中发挥重要功能。本研究从嗜热四膜虫中鉴定出一种新的周期蛋白CYC28 (TTHERM_00082190)基因,预测编码266个氨基酸。实时荧光定量PCR表明,CYC28在有性生殖时期特异表达,且在4 h表达水平最高。通过同源重组构建获得MTT1启动子调控下的HA-CYC28突变体细胞。免疫荧光定位表明,HA-Cyc28定位在细胞质和凋亡的亲本大核中。分别构建CYC28敲除突变株和RNA干扰细胞株,对CYC28敲减突变体细胞的分析发现,营养生长和有性生殖期突变细胞发育正常。然而,过表达株Cyc28突变体引起原核染色体排列异常,原核不能完成有丝分裂形成配子核,有性生殖进程终止。结果表明,Cyc28参与细胞的有性生殖进程,它的正常表达和降解对原核有丝分裂的完成是必需的。     

RanGTPase激活蛋白RanGAP在嗜热四膜虫细胞中的定位及功能

RanGTPase激活蛋白（RanGTPase activating protein,RanGAP）和Ran相互作用,提高了Ran GTPase水解GTP的效率. RanGAP参与细胞内核质运输、纺锤体组装、核膜重建和异染色质的组装．生物进化过程中,不同生物的RanGAP表现出结构和功能的多样性．本研究从嗜热四膜虫大核基因组中鉴定出1个保守的RanGTPase激活蛋白基因RanGAP（TTHERM_00766430）．实时荧光定量PCR表明,RanGAP在四膜虫营养生长、饥饿和有性生殖过程中均有表达,且在有性生殖4～6 h表达水平最高．免疫荧光定位表明,在营养生长期、饥饿期及有性生殖的早期,RanGAP定位于细胞质中| 在有性生殖后期, RanGAP定位于凋亡的大核中．过表达RanGAP的细胞增殖速率下降,大核分裂和胞质缢缩异常, 产生无大核细胞．敲减RanGAP的细胞大核形态异常,细胞增殖速率下降,无丝分裂受到抑制,进而产生无大核细胞．RanGAP的过表达或敲除分别引起四膜虫RAN1,RanBP1和RCC1基因的表达下调或上调．结果表明,RanGAP通过Ran信号通路调控了嗜热四膜虫无性生殖过程中大核的无丝分裂,并可能参与了有性生殖过程中亲本大核的凋亡．     

周期蛋白Cyc2的过量表达及突变抑制嗜热四膜虫有性生殖发育

周期蛋白在细胞增殖过程中呈现周期性表达变化,不同的周期蛋白通过结合周期蛋白激酶(cyclin-dependent kinase,CDKs)及靶向特定蛋白质参与细胞有丝分裂和减数分裂过程的精确调控。嗜热四膜虫有性生殖期特异表达的B3型周期蛋白Cyc2(cyclin 2,Cyc2)对减数分裂的启始是必需的,但Cyc2蛋白的分子调控机制并不清楚。本研究通过0.1μg/mL和0.3μg/mL镉离子诱导突变细胞株OE-CYC2-B2086和OE-CYC2-CU428中CYC2基因在金属硫蛋白1基因(metallothionein gene 1,MTT1)启动子调控下上调表达。实时荧光定量PCR检测突变株OE-CYC2-B2086和OE-CYC2-CU428中CYC2的转录水平分别上调7.8倍和9.8倍。细胞有性生殖发育进程的荧光显微观察发现CYC2的表达上调并不影响有性生殖前期减数分裂的启始,但是干扰四膜虫有性生殖后期中新大核和新小核的正确形成。同时突变株OE-CYC2-B2086和OE-CYC2-CU428交配后,在镉离子诱导下不能产生有性生殖后代,但是该突变株分别和两种不同野生型细胞或CYC2敲除的突变细胞株交配能够恢复产生3%,15%或32%的有性生殖后代,有性生殖发育异常程度与CYC2的表达水平成正相关。进一步突变Cyc2第312位磷酸化位点丝氨酸为丙氨酸,获得CYC2单位点突变细胞株CYC2-S312A-B和CYC2-S312A-C。丝氨酸单位点突变阻止了四膜虫有性生殖期小核减数第1次分裂起始。结果表明周期蛋白2的表达水平和磷酸化修饰影响了不同阶段细胞核的功能,周期蛋白2对四膜虫有性生殖发育的正常进行是必需的。     

嗜热四膜虫SPO11基因缺陷型细胞株的基因表达变化分析

有性生殖的关键过程是通过减数分裂产生生殖细胞,而减数分裂的一个重要环节是进行基于DNA双链断裂的同源染色体重组。在同源染色体重组过程中,SPO11蛋白催化产生DNA双链断裂,从而起始同源染色体的重组。因此,研究SPO11基因缺失在减数分裂过程中所引起的基因表达变化有助于在转录组水平上了解该基因的作用。本研究通过对嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)野生型和SPO11敲除细胞株在接合生殖时期2 h、3 h、4 h、5 h四个时间点的转录组进行高通量测序。通过差异表达基因分析和功能富集分析,发现SPO11基因敲除之后嗜热四膜虫在接合生殖时期2 h时,与DNA代谢过程和DNA复制相关基因的表达发生变化,推测SPO11基因敲除导致的减数分裂过程异常可能与DNA代谢过程和DNA复制相关。     

嗜热四膜虫Ran结合蛋白1的表达对大小核分裂的影响

Ran是细胞内的一种具有GTP酶活性的功能蛋白,可以调节染色体稳定性、细胞核组建以及核质运输等多种细胞进程．Ran结合蛋白1（Ran-binding protein 1, Rbp1p ）是Ran的必要调控因子,促进Ran-GTP水解为Ran-GDP．本研究从嗜热四膜虫大核基因组中鉴定出1个保守的Ran结合蛋白基因RBP1(TTHERM_00158040, http://www.ciliate.org)．实时荧光定量PCR表明,RBP1在四膜虫营养生长和有性生殖过程中都有表达,且在有性生殖过程中表达水平提高．免疫荧光定位表明,在营养 生长期Rbp1p定位于细胞质中．过表达RBP1或敲减RBP1后,细胞生长速率下降,大核的无丝分裂异常,细胞分裂末期产生了无大核的异常细胞,同时过表达RBP1导致了多小核的产生．结果表明,Rbp1p影响四膜虫细胞核的分裂进程,它的正常表达对细胞增殖过程起到重要的调节作用．     

自噬相关蛋白Atg4.1过表达促进嗜热四膜虫亲本大核程序化降解

细胞核自噬在真核生物进化过程中具有重要作用,然而不同生物中的自噬分子调控机制并不完全清楚。嗜热四膜虫有性生殖过程中亲本大核的程序化降解是一种独特的细胞核选择性自噬。该研究从嗜热四膜虫中鉴定出一种自噬相关基因Tt ATG4.1(TTHERM_00526270),编码677个氨基酸。Tt ATG4.1在营养生长期和饥饿期不表达,在有性生殖期2 h特异表达,亲本大核开始降解的anlagen时期表达量最高。通过同源重组构建获得MTT1启动子调控表达的ATG4.1突变株,免疫荧光定位显示, Atg4.1定位在细胞质和降解的亲本大核上。过量表达Atg4.1导致anlagen时期亲本大核未能正常凝缩,且细胞核膨大。通过自噬体和溶酶体荧光探针标记发现过量表达Atg4.1不影响亲本大核的酸化,但相比于野生型细胞,过表达Atg4.1细胞株中,亲本大核的降解更快。研究表明自噬相关蛋白Atg4.1参与调控嗜热四膜虫有性生殖中亲本大核程序化降解。     

嗜热四膜虫染色体浓缩调节因子(RCC1)的定位及功能

真核细胞中染色体浓缩调节因子(regulator of chromosome condensation 1,RCC1)是RanGTPase唯一的鸟嘌呤核苷酸交换因子.染色质结合的RCC1和RanGTPase相互作用,催化细胞核内RanGDP向RanGTP的转化,进而调控了核质间的定向运送、有丝分裂期纺锤体的组装以及核膜的形成.本实验从原生生物嗜热四膜虫大核基因组中鉴定了1个新的RCC1(TTHERM_00530380)基因.该基因全长2 541 bp,包含2个内含子序列,开放阅读框为2 181 bp,编码726个氨基酸.实时荧光定量PCR表明,RCC1在四膜虫营养生长、饥饿以及有性生殖时期都有表达,且在有性生殖转录水平达到最高.免疫荧光定位分析表明,HA-RCC1在营养生长和饥饿时期,定位于大核和小核中;在有性生殖时期,定位于亲本大核、减数分裂的小核、新生成的大核和凋亡的大核中.过表达RCC1导致大核的无丝分裂异常,细胞增殖变慢,最终产生无大核的后代细胞.敲减RCC1导致了多小核的产生.结果表明,RCC1参与调控了四膜虫细胞核的分裂,RCC1的正常表达对核分裂以及细胞增殖起到重要的调控作用.     

嗜热四膜虫染色体浓缩调节因子(RCC1)的定位及功能分析

真核细胞中染色体浓缩调节因子（regulator of chromosome condensation 1, RCC1）是 RanGTPase 唯一的鸟嘌呤核苷酸交换因子. 染色质结合的RCC1和RanGTPase相互作用,催化细胞核内RanGDP向RanGTP的转化,进而调控了核质间的定向运送、有丝分裂期纺锤体的组装以及核膜的形成. 本实验从原生生物嗜热四膜虫大核基因组中鉴定了1个新的RCC1（TTHERM_00530380）基因. 该基因全长2 541 bp,包含2个内含子序列,开放阅读框为2 181 bp,编码726个氨基酸. 实时荧光定量PCR表明,RCC1在四膜虫营养生长、饥饿以及有性生殖时期都有表达,且在有性生殖转录水平达到最高. 免疫荧光定位分析表明, HA RCC1在营养生长和饥饿时期,定位于大核和小核中|在有性生殖时期,定位于亲本大核、减数分裂的小核、新生成的大核和凋亡的大核中. 过表达RCC1导致大核的无丝分裂异常, 细胞增殖变慢,最终产生无大核的后代细胞. 敲减RCC1导致了多小核的产生. 结果表明,RCC1参与调控了四膜虫细胞核的分裂, RCC1的正常表达对核分裂以及细胞增殖起到重要的调控作用.     

嗜热四膜虫减数分裂研究进展

减数分裂是真核生物有性生殖过程的关键步骤,染色体的行为变化贯穿整个减数分裂的过程。近些年来,借助先进的分子生物学技术和细胞学实验手段,通过对突变细胞株的筛选和评价,单细胞真核模式生物原生动物嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)减数分裂方面的研究取得了长足的进展。本文主要介绍嗜热四膜虫减数分裂的过程,以及在此过程中伴随染色体行为变化的相关基因的功能,从而为进一步探讨嗜热四膜虫减数分裂的分子机制提供有效信息。     

RAN1基因过表达抑制嗜热四膜虫大核无丝分裂

Ran GTPase通过RanGTP/RanGDP循环的形式,参与调控多种细胞增殖方式：包括有丝分裂和减数分裂.敲减RAN1基因可导致嗜热四膜虫大核内微管组装紊乱,从而抑制大核无丝分裂.为进一步分析Ran1在无丝分裂中的功能,本研究将野生型Ran1以及模拟GTP（Ran1Q70L）和GDP（Ran1T25N）锁定形式的Ran1突变体在嗜热四膜虫中过量表达,均导致四膜虫细胞增殖速率下降,并引起大核无丝分裂异常,且这种核异常细胞比率与Ran1过表达量呈正相关.免疫荧光定位结果显示,过表达的HA-Ran1在整个细胞中弥散分布,破坏了正常的Ran1分布形式;而过表达的HA-Ran1Q70L明显集中在大核核膜和胞质中,HA-Ran1T25N则主要定位在大核和小核内,分别与Ran1GTP/Ran1GDP循环的辅助调节因子定位模式一致.以上结果表明,过表达Ran1及其突变体可能影响嗜热四膜虫细胞中正常的Ran1GTP/Ran1GDP循环,进而导致大核无 丝分裂异常.     

嗜热四膜虫胱硫醚γ-裂解酶Cgl1的表达、定位及功能分析

含硫氨基酸在不同的生物体中具有重要调节功能,转硫途径相关酶促进半胱氨酸的生成和硫化氢产生。本研究从嗜热四膜虫中鉴定一种胱硫醚γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase 1,CGL1,TTHERM_00052400）基因。CGL1在营养生长期高水平表达,而在饥饿阶段和有性生殖期,维持在较低的表达水平。通过密码子优化,人工合成CGL1基因,构建重组表达质粒pGEX-CGL1,转化大肠杆菌BL21(DE3)。E.coli/pGEX-CGL1表达重组蛋白质GST-Cgl1,并通过亲和层析获得纯化。GST-Cgl1裂解胱硫醚产生半胱氨酸,也具有裂解半胱氨酸和同型半胱氨酸产生H2S的活性。进一步构建重组质粒pNEO4-3HA-CGL1和pSMC1hpNEO-CGL1,转化四膜虫细胞,获得带有HA标签和干扰CGL1的突变体细胞株。免疫荧光定位表明,HA-Cgl1生长期定位在亲本大核,饥饿期定位在细胞质,有性生殖前期定位在亲本大核,而在后期定位在胞质中。CGL1干扰的突变体细胞株在有性生殖过程中不能形成合子核,发育中的小核异常降解,产生仅有大核的异常单细胞。结果表明,嗜热四膜虫含有进化中保守的胱硫醚γ-裂解酶Cgl1。Cgl1具有产生和裂解半胱氨酸的活性。Cgl1定位在细胞质和细胞核中,参与了有性生殖过程细胞核的发育。     

抗沉默因子Asf1调控嗜热四膜虫细胞核的稳定性

组蛋白H3/H4的分子伴侣Asf1(anti-silencing factor 1),参与依赖DNA复制及不依赖DNA复制的核小体装配,同时参与转录调控、基因沉默以及DNA损伤修复等过程. 在不同生物中,Asf1具有功能的保守性和多样性．嗜热四膜虫ASF1（TTHERM_00442300）基因编码的蛋白质含有保守的N端结构域和酸性的C端结构域．N端结构域同源序列进化树分析表明,Asf1进化与物种进化一致．实时荧光定量PCR表明,ASF1在四膜虫营养生长、饥饿及有性生殖时期均有表达,且在有性生殖4～6 h转录水平达到最高．免疫荧光定位分析表明,HA-Asf1在营养生长时期以及有性生长时期定位于功能大核和小核中,而在凋亡的大核中信号消失．过表达ASF1导致大核及小核变大,抑制细胞增殖．敲减ASF1后会导致大核形态异常,小核缺失．结果表明,ASF1表达对细胞核的形态和结构维持发挥重要的调控作用．     

一组多功能的错配修复蛋白

错配修复蛋白是DNA错配修复系统中主要功能蛋白质,主要参与DNA复制过程中对错配碱基的识别和修复.近年来研究表明错配修复蛋白还参与DNA损伤信号的传递、细胞周期的调控、减数分裂和有丝分裂等.错配修复蛋白缺陷会增加患肿瘤的危险性或者直接导致肿瘤;由于错配修复蛋白参与了DNA损伤信号传递、周期调控,错配修复蛋白缺陷还会导致细胞对相关抗癌药物产生耐受.     

DNA错配修复系统组成和功能的研究进展

DNA错配修复(Mismatch repair,MMR)系统广泛的存在于从原核到真核的生物体中,是进化上保守的生化通路.MMR系统由一系列特异性修复DNA碱基错配的酶分子(错配修复基因产物)组成.细胞由于此系统的存在使DNA复制保持忠实性,从而保持遗传物质的完整性和稳定性,避免遗传物质发生突变.MMR系统基因的失活会导致自发突变率的明显增加,从而导致微卫星不稳定(MSI),可能引发某些肿瘤发生.近年来,MMR系统的研究越来越受到学者的重视,对MMR作用机制及组成该系统的几种酶蛋白结构与功能方面的研究不断深入,加深了对MMR系统的理解.这些为MMR系统相关的应用研究,尤其是为肿瘤发生奠定了理论的基础.本文重点讨论了错配修复系统的蛋白组成、各蛋白的功能及它们如何相互协调发挥作用的最新研究进展.