共表达伴侣蛋白对重组毕赤酵母产米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶发酵过程的影响

[目的]通过共表达伴侣蛋白Erolp和PDI获得米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达.[方法]利用毕赤酵母基因重组菌高密度发酵的方法,在7L发酵罐水平上分析共表达伴侣蛋白菌株(BH128)与非共表达伴侣蛋白菌株(H238)对脂肪酶表达的差异.[结果]在相同条件下,BH128发酵产酶能力高于H238,最高酶活可达到2 338.7U/mL,最大比生长速率达到0.02 h-1,最大产物比形成速率达到944.5 U/(gDCW·h),最大底物比消耗速率也能达到0.15 gmethanol/(gDCW·h),分别是H238的1.7、0.5、4.1和1.3倍,且发酵周期缩短了20h.[结论]毕赤酵母基因重组菌BH128通过共表达伴侣蛋白Ero1p和PDI,提高了米根霉脂肪酶的产量,而且缩短了发酵周期,为工业化生产奠定了基础.     

FAD依赖的葡萄糖脱氢酶多拷贝毕赤酵母菌株的构建及高效表达

通过体外多拷贝构建实现FAD依赖的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)在毕赤酵母(Pichia pastoris)X33菌株中的高效表达。将前期构建的经密码子偏好性优化FAD-GDH基因插入到pPICZαA质粒中，通过同尾酶法酶切酶连构建含1～4个表达盒的重组表达质粒，分别电转至毕赤酵母X33中，成功筛选到各种重组菌株。qRT-PCR测定结果表明，载体所含的表达盒数目与嵌合进毕赤酵母基因组中的GDH基因拷贝数之间存在正相关关系。重组菌在试管水平用甲醇诱导72 h,酶活达到最高，其中4拷贝的转化子表达水平最高；选择1拷贝和4拷贝转化子进行10 L发酵罐扩大培养，1拷贝菌株诱导108 h酶活达到最高697.125 U/mL,4拷贝菌株诱导132 h酶活达到最高1 063.279 U/mL,比1拷贝酶活提高52.52%。结果表明通过增加目的基因拷贝数策略有助于提高FAD-GDH的表达量，为其进一步扩大生产提供参考。     

耐热α-半乳糖苷酶的高效表达及酶学性质初探

[目的]实现耐热α-半乳糖苷酶在毕赤酵母中的高效表达,并初步研究其酶学性质。[方法]克隆来源于埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)的α-半乳糖苷酶基因TEgal,构建p AO815-TEgal重组表达载体,采用DNS法测定其水解活性及酶学性质;通过薄层层析研究其水解底物谱;并构建TEgal基因多拷贝表达框,实现了该基因的高效表达。[结果]TEgal对棉籽糖水解活性最高9. 5 U/m L,最适温度75℃,最适pH值3. 5; Na~+、K~+对TEgal有促进作用,Mg~(2+)、Co~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)、Fe~(2+)、Zn~(2+)均能抑制酶活,多拷贝重组表达菌株活性最高为22. 4 U/m L。[结论]成功构建耐热α-半乳糖苷酶高效表达菌株,通过提升基因剂量将酶活和蛋白含量提高了135%和356%。     

费希尔曲霉脂肪酶在毕赤酵母中的优化表达及高密度发酵

【背景】脂肪酶广泛应用于纺织、食品、药品、皮革等工业领域,其在微生物中的异源表达研究进一步促进了脂肪酶产品的生产和应用。【目的】实现来源于费希尔曲霉的脂肪酶在毕赤酵母中的高效异源表达,探究其合适的表达及发酵条件,提高产量,降低成本。【方法】对费希尔曲霉的脂肪酶编码基因进行密码子优化后,应用pPIC9k质粒整合到毕赤酵母GS115基因组上,构建高产脂肪酶Lip605的毕赤酵母工程菌;并通过响应面发酵条件优化、筛选最适伴侣蛋白和高密度发酵相结合的方法,综合提高脂肪酶表达量。【结果】确定高产脂肪酶毕赤酵母工程菌的最优摇瓶发酵产酶条件为:甲醇3.103%(体积比),生物素0.4 mg/L,酵母粉11.5 g/L,酵母基础氮源培养基(yeast nitrogen base,YNB) 13.4 g/L,初始pH 6.4,装液量50 mL/250 mL,转速220 r/min,温度24°C,培养时间40 h。优化后的胞外脂肪酶酶活达到72.34 U/mL,较优化前提高了5.8倍;进一步选择12个伴侣蛋白分别与脂肪酶Lip605进行共表达,其中共表达伴侣蛋白Rpl10(pPICZA-RPL10)效果最佳,可使Lip605表达量进一步提高46.8%;在此基础上,经过10 L发酵罐分批补料的高密度发酵,工程菌株发酵142 h,胞外脂肪酶酶活最高达到680 U/mL,蛋白浓度为15.89 g/L。【结论】应用复合策略有效提高了脂肪酶Lip605在毕赤酵母中的发酵产量,为其进一步工业化生产奠定了良好的基础。     

玉米赤霉烯酮降解酶多拷贝毕赤酵母菌株的构建及高效表达

通过密码子优化、体外多拷贝构建实现玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)降解酶基因(zlhy-6)在毕赤酵母GS115菌株中的高效表达。按酵母密码子偏好性优化zlhy-6基因的密码子,与α因子信号肽编码序列一起合成,插入到pAO815质粒中,通过酶切酶连构建含1–6个表达盒的表达质粒,将其转入毕赤酵母GS115菌中,获得ZEN降解酶重组菌株。重组蛋白分子量为28.9 kDa,与预期一致。重组菌用甲醇诱导3 d,蛋白浓度达最高,之后下降;在pH 5.0、4.5条件下诱导培养,表达量最高;每天添加0.8%的甲醇、接种量10%表达水平最高;4拷贝的转化子表达水平最高,三角瓶发酵3 d,酶活性达到10 U/mL。在1 g玉米渣中添加0.1–0.5 mL发酵上清液,水解24 h,玉米渣中ZEN的降解率为44.08%–75.51%。研究结果为ZEN降解酶工业生产及在食品饲料中的应用奠定了基础。     

mdlA基因在毕赤酵母中的高效表达及表达产物性质研究

将编码甘油单-二酰酯脂肪酶(MDGL)的基因mdlA插入到分泌表达质粒pPIC9K中,通过电激将线性化的重组质粒整合到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,筛选出H is Mut 表型菌株,进一步用G418筛选获得高拷贝转化子,并用PCR方法鉴定。诱导培养后,SDS-PAGE表明MDGL在毕赤酵母中得到有效表达。表达产物在温度40℃,pH7.5具有最高活性,其发酵液酶活可达到325U/mL,以橄榄油为底物时没有检测到活性。表达产物与甘油三酰酯脂肪酶共同作用时产生的脂肪酸量比甘油三酰酯脂肪酶单独作用提高了93.5%。     

来源于软化芽孢杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶在毕赤酵母和枯草杆菌中的表达

通过PCR扩增软化芽孢杆菌α-CGT酶基因,将基因片段分别克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K和大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pMA5中,分别转化毕赤酵母KM71和枯草杆菌WB600。结果表明,重组毕赤酵母发酵上清液中α-CGT酶活性仅0.2U/mL,重组枯草杆菌产酶达到1.9U/mL。对重组枯草杆菌发酵条件进行了优化,当以TB为出发培养基,初始pH6.5,温度为37oC时,摇瓶培养24h后α-CGT酶环化活性达到4.5U/mL(水解活性为3200IU/mL),是野生菌株软化芽孢杆菌表达量的9.8倍。     

多拷贝毕赤酵母重组菌表达GCL摇瓶优化和高密度发酵

目的:构建高效表达白地霉脂肪酶的毕赤酵母重组菌株,并对筛选得到的菌株进行摇瓶发酵条件优化和分批补料高密度发酵工艺研究。方法:将诱导型表达载体pPIC9K-gcl电转化至毕赤酵母GS115。通过橄榄油-罗丹明B平板和摇瓶发酵筛选高脂肪酶活力的重组菌株,运用基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR 法确定其拷贝数,并对菌株进行摇瓶发酵条件优化。在此基础上,研究重组菌在3L 发酵罐中的高密度发酵工艺。结果:筛选得到一株具有3 个白地霉脂肪酶基因拷贝的菌株GS115/pPIC9K-gcl 78#,初始酶活力为220 U/ml。当摇瓶发酵条件为甲醇诱导96 h,每24 h甲醇添加量1 %,接种量2 %,培养基初始pH 7.0,500 ml摇瓶装液量50 ml,甲醇诱导温度25℃ 时酶活力达735 U/ml。3L 发酵罐高密度发酵176.5 h,酶活力达到3360 U/ml,总蛋白含量达到4.30 g/L,且发酵过程中细胞活性一直保持在96 % 以上。结论:基因拷贝数与重组菌株的产酶水平呈正相关,摇瓶优化可显著提高重组菌株的产酶能力,为白地霉脂肪酶的工业化生产奠定了技术基础。     

基于基因的重新设计与高通量筛选策略选育解脂耶氏酵母脂肪酶高产菌株

脂肪酶（EC 3.1.1.3）是应用广泛的工业用酶。高效的脂肪酶产生菌是脂肪酶工业生产和应用的前提。通过基因的重新设计与合成技术优化了解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）脂肪酶YLL的密码子,并实现了其在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的高效表达;通过高通量筛选策略获得了更高效的脂肪酶基因工程菌菌株SILVER。在14 L发酵罐条件下,菌株SILVER酶活达40 500 U/ml、蛋白质含量达2.52 g/L发酵液,为该类脂肪酶的产业化奠定了基础。     

mdlA基因在毕赤酵母中的高效表达及表达产物性质研究*

将编码甘油单-二酰酯脂肪酶(MDGL)的基因mdlA插入到分泌表达质粒pPIC9K中,通过电激将线性化的重组质粒整合到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,筛选出H is+Mut+表型菌株,进一步用G418筛选获得高拷贝转化子,并用PCR方法鉴定。诱导培养后,SDS-PAGE表明MDGL在毕赤酵母中得到有效表达。表达产物在温度40℃,pH7.5具有最高活性,其发酵液酶活可达到325U/mL,以橄榄油为底物时没有检测到活性。表达产物与甘油三酰酯脂肪酶共同作用时产生的脂肪酸量比     

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)碱性脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达

将来自枯草芽孢杆菌的碱性脂肪酶基因经密码子优化,全基因合成后克隆到pPICZαA载体,构建了pPICZαA-bsl分泌型重组质粒,该重组质粒经限制性内切酶PmeI线性化后使用LiCl法转化到毕赤酵母X-33,经过筛选获得分泌表达碱性脂肪酶的重组毕赤酵母X-33/pPICZαA-bsl。摇瓶发酵液上清酶活最高可达4.78 U/mL,初步研究了该脂肪酶的酶学性质,其最适作用温度为40-60℃,最适pH9.0,且具有高度耐碱的特性。该重组脂肪酶对旧新闻纸具备较明显的脱墨能力。     

利用游离型表达质粒强化毕赤酵母表达木聚糖酶

巴斯德毕赤酵母是用途广泛的蛋白表达系统。目前用于毕赤酵母的质粒主要以整合型质粒为主,很少见到游离的质粒用于外源基因的表达。文中通过将来源于酵母自身的自主复制序列连接到酵母整合型表达载体pGAP中构成自主复制的游离型表达载体pGAPZαA-PARS,将该载体用于表达木聚糖酶基因。转化毕赤酵母后同传统的整合型表达菌株相比,以甘油为碳源时最高酶活达到343 U/mL,比整合型表达提高了45.9%。同时游离载体表达重组酶比活相对整合表达提高了81.2%。为了节约发酵成本,进一步研究了分别以甘油、葡萄糖、蔗糖、混合碳源(蔗糖︰甘油=1︰2)等不同碳源下游离型重组菌株的表达水平。发现甘油表达水平最高,蔗糖最低,但是以工业葡萄糖为碳源时产酶成本最低。由于pGAP载体不需要以甲醇为碳源,因而文中所构建的游离载体pGAPZαA-PARS极大促进了毕赤酵母在食品行业中的应用。同时,游离型载体可大幅度提高表达水平,为进一步研究提高GAP启动子的高效表达奠定了基础。     

洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的基因改造及其在毕赤酵母中组成型和诱导型的表达

【目的】克隆洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)脂肪酶基因,实现其在毕赤酵母中快速、安全和稳定性的大量表达。【方法】首先设计引物扩增B.cepacia脂肪酶基因,然后应用生物信息学方法分析B.cepacia和毕赤酵母整体密码子使用情况、脂肪酶基因信号肽及密码子偏好性。在此基础上,运用overlap PCR对脂肪酶基因中低使用频率密码子进行改造并同时降低基因的G+C含量,获得优化的脂肪酶基因。再分别把原始和优化的脂肪酶基因导入载体pGAPZα和pPIC9K中,获得组成型表达载体pGAPlipW、pGAPlipO和诱导型表达载体pPIClipW、pPIClipO。分别将所得4种载体转入GS115中,得到一系列工程菌。经发酵和NTA树脂纯化后,对脂肪酶的酶学性质进行了初步研究。【结果】4种工程菌的脂肪酶活力分别为pPIClipW37.8U/mL,pPIClipO129.5U/mL,pGAPlipW40.2U/mL和pGAPlipO184.3U/mL。改造后脂肪酶活力比原始脂肪酶提高了4.6倍。酶学性质研究表明,脂肪酶在60℃时活力最高,在40℃-65℃范围内非常稳定;脂肪酶最适pH值为9.0,在pH6.0-pH10.0范围均表现很好的稳定性。【结论】通过overlap PCR改造后的脂肪酶显著提高了其在毕赤酵母中的表达效率,且GAP启动子比AOX1启动子更适合于B.cepacia脂肪酶的表达。大量表达的重组脂肪酶的性质与野生脂肪酶的性质相同,符合生产要求。     

扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的克隆与表达

利用PCR技术,从扣囊复膜孢酵母的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase）基因（BGL1）,长度为2596 bp,连接到pGEM-T载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使之位于α-因子信号肽下游,且与之同框,构建成重组质粒pSHL9K.通过电转化将重组质粒pSHL9K插入到Pichia pastoris GS115菌株染色体中,获得高效表达BGL1基因的毕赤酵母重组工程菌株.重组酶的最适温度为50℃,最适pH为5.4.培养基中β-葡萄糖苷酶活性最高可达47U/mL.     

黑曲霉h408阿魏酸酯酶基因的克隆及在毕赤酵母中的高效表达

【目的】实现在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中高效表达黑曲霉(Aspergillus niger)h408阿魏酸酯酶A基因(AnfaeA),并对重组酶特性进行表征。【方法】采用重叠延伸PCR扩增黑曲霉h408的阿魏酸酯酶A基因。将AnfaeA基因和毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,成功构建重组质粒pPIC9K-Anfae,经线性化后电转化P.pastoris GS115,透明圈法筛选活性高的转化子后进行诱导表达。利用紫外吸收法测定温度及pH对重组阿魏酸酯酶活性的影响。【结果】成功从A.niger h408中克隆得到阿魏酸酯酶A的cDNA基因(GenBank:KF911349),并实现了其在P.pastoris GS115中的高效表达。该基因长度为783bp,含有1个开放阅读框架(ORF),编码260个氨基酸,Blast分析显示该基因和GenBank中黑曲霉阿魏酸酯酶序列同源性为99%。翻译的氨基酸序列含有脂酶典型的活性盖子和催化三联体结构。从转化板上获得1株编号为pPIC9K-Anfae5的转化子阿魏酸酯酶活性最高,酶活达24.72 U/mL,比活力为40.84 U/mg,比黑曲霉出发菌株(22.1 mU/mL)提高了1100倍左右。重组阿魏酸酯酶的最适pH为5.0,且在pH 4.0-9.0稳定性较好;最适反应温度50℃,在40-60℃时较稳定。【结论】阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的高效分泌表达为其在饲料工业和造纸工业等工业化应用提供了前提,也为后续改进酶学特性的定向进化奠定实验基础。     

Expression of Humicola insolens (NC3) endo-β-glucanase Ⅱgene in Pichia pastoris and anylysis of enzymic properties

[目的]在毕赤酵母中表达特异腐质霉Humicola insolens的中性内切葡聚糖酶Ⅱ,并对其性质加以研究.[方法]利用RT-PCR的方法,以特异腐质霉(Humicola insolens)NC3总RNA为模板,克隆到中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因(egⅡ的cDNA.将其插入表达载体pPIC9K,重组质粒经线性化后电击转化毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115.[结果]SDS-PAGE和酶活的检测结果均表明:egⅡ基因在毕赤酵母中成功表达.重组酶的部分酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为70℃,且在65℃以下具有较好的热稳定性.最适反应pH为6.5,在pH 6.0-7.0之间有较好的稳定性.[结论]用重组毕赤酵母可高效表达外源中性内切葡聚糖酶,为其今后在工业应用奠定了基础.     

黑曲霉纤维二糖水解酶基因cbhA在毕赤酵母中异源表达

[目的]对黑曲霉纤维二糖水解酶cbhA基因进行了克隆和在毕赤酵母中的真核表达。[方法]采用PCR方法扩增黑曲霉纤维二糖水解酶A(Cellobiohydrolase A,CBHA)基因,获得的DNA序列与cbhA基因表现出高度相似,推导出的氨基酸序列与真菌CBHA酶也高度相似,属于糖基水解酶第7家族。将扩增得到的cbhA基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,与α-因子信号肽序列形成融合蛋白,进一步通过电转化方法将线性化质粒p PIC9K-cbhA转化至毕赤酵母GS115菌株进行表达。[结果]在甲醇诱导下,重组菌株CMC比酶活力是对照的2.5倍,SDS-PAGE分析结果也确认了cbhA基因在重组菌株GS115/p PIC9K-cbhA中的表达。对该酶性质的分析表明,重组CBHA酶水解CMC底物最适p H值为5.0,最适温度为55℃。[结论]黑曲霉纤维二糖水解酶基因cbhA的克隆和其真核表达工程菌株的构建,为获得纤维二糖水解酶A高产菌株,实现纤维素酶多组分的人工组装奠定了基础。     

果胶酶基因剂量效应与水解果胶的工艺研究

[目的]实现烟曲霉果胶酶AFPG基因在毕赤酵母表达并获得高产菌株;阐述果胶酶AFPG的基因剂量效应;探究果胶的水解工艺。[方法]采用PCR技术从烟曲霉扩增AFPG基因并克隆到p AO815载体;用同尾酶构建多拷贝串联表达盒,经线性化的质粒电转到毕赤酵母构建重组工程菌;采用实时荧光定量PCR检测AFPG基因拷贝数;用薄层层析(TLC)技术对果胶的酶解产物进行分析。[结果]SDS PAGE分析表明AFPG基因表达了一个约40 kDa的蛋白;拷贝数为2、3、5的重组子摇瓶发酵,蛋白含量分别为0.24 mg/mL、0.28 mg/mL、0.35 mg/mL;14 L高密度发酵比活为8783 U/mg;该酶最适温度和pH为70℃和5.0;在底物浓度0.7%(W/V),酶量20 U,水解果胶30 min,转化率达到12%。[结论]果胶酶AFPG的表达存在基因剂量效应,5拷贝是2拷贝表达量的1.5倍,可通过构建多拷贝获得高产菌株。果胶酶解效果明显,水解工艺研究为果胶酶的应用奠定基础。     

利用毕赤酵母系统直接分泌表达具有活性的谷氨酰胺转胺酶

使用异源表达系统直接分泌表达具有活性的微生物谷氨酰胺转氨酶(Microbial transglutaminase,MTG)是目前最具前景的MTG生产方法之一,但由于产量较低无法实现工业化生产.毕赤酵母是近年来发展出的高效蛋白表达系统.通过采用pro序列与成熟MTG基因共表达的策略,成功地实现了用重组毕赤酵母分泌表达具有活性的茂原链霉菌Streptomyces mobaraense MTG.进一步通过对pro序列和MTG基因拷贝数以及重组酵母培养条件的优化,最终使得MTG在1L发酵罐中高密度发酵的酶活达到7.3 U/mL,为MTG的工业化生产奠定了基础.