自噬与非小细胞肺癌对吉非替尼耐药关系的实验研究

目的:探讨细胞自噬与非小细胞肺癌对Gefitinib耐药的相关性,寻找逆转非小细胞肺癌对Gefitinib耐药的新靶点。方法:以体外培养的人非小细胞肺癌Gefitinib敏感细胞PC-9与Gefitinib耐药细胞PC-9/GR为研究对象,通过MTT法检测Gefitinib对PC-9及PC-9/GR细胞存活率的影响;Western blot检测Gefitinib对PC-9及PC-9/GR细胞中自噬相关蛋白LC3的表达的影响;流式细胞术检测自噬诱导剂雷帕霉素和Gefitinib对PC-9/GR细胞凋亡率的影响。结果:PC-9/GR细胞Gefitinib IC50为PC-9细胞的200倍以上,具有非常明显的耐药性。PC-9/GR细胞中LC3II的表达显著低于PC-9/GR细胞(P0.05)。Rapamycin联合Gefitinib作用于PC-9/GR细胞可以明显提高其细胞凋亡率(P0.05)。结论:细胞自噬减弱与非小细胞肺癌对Gefitinib耐药有关,诱导细胞自噬可能逆转非小细胞肺癌对Gefitinib耐药。     

细胞自噬在吉非替尼治疗非小细胞肺癌中的作用及其机制研究

目的:观察吉非替尼对非小细胞肺癌细胞自噬的影响,并探讨其机制。方法:将BalB/CA-nu品系裸小鼠分成两组,各组20只,均造肺癌模型,其中吉非替尼治疗组小鼠在肺癌组模型的基础上给予吉非替尼25mg/kg 14d,停药后剖杀。取组织切片,通过免疫荧光、RT-PCR以及Western blot的试验方法检测自噬相关基因Beclin1和MAPLC3的表达。结果:免疫荧光、RT-PCR以及Western blot的试验方法检测均发现肺癌组小鼠组织中Beclin1和MAPLC3表达较低,而在吉非替尼处理组中,Beclin1和MAPLC3的表达明显升高,差异有统计学意义。结论:吉非替尼可以通过增强细胞自噬从而发挥对非小细胞肺癌的抑制作用。     

Mcl-1参与非小细胞肺癌对吉非替尼耐药的实验研究

目的:探究人髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)是否参与非小细胞肺癌对吉非替尼的耐药。方法:应用Western blot检测Mcl-1在吉非替尼敏感细胞PC-9和耐药细胞H1975表达差异;梯度浓度的吉非替尼作用于PC-9细胞后,Western blot实验检测B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)家族中抗凋亡蛋白的表达变化;应用Western blot实验检测Mcl-1在PC-9和H1975细胞内降解速度差异。结果:Mcl-1在PC-9细胞内的表达明显低于H1975细胞,差异有统计学意义(P0.05),并且随着吉非替尼作用浓度的升高,Mcl-1表达逐渐降低,而Bcl-2和Bcl-x L表达基本不变,并且PC-9细胞内Mcl-1降解更迅速,半衰期明显缩短。结论:非小细胞肺癌对吉非替尼耐药可能与Mcl-1的表达量上调,降解速度减慢,半衰期延长有关。     

ROR1激活AKT/FOXO1信号介导非小细胞肺癌吉非替尼耐药

EGFR-TKI靶向治疗在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）综合治疗中显示出重要作用;然而,耐药性却极大限制其临床治疗效果。受体酪氨酸激酶样孤儿受体（receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1, ROR1）是I型受体酪氨酸激酶家族中的成员,在肿瘤发生发展中发挥重要作用。本研究拟探讨ROR1介导非小细胞肺癌吉非替尼耐药的作用及机制。采用吉非替尼反复诱导非小细胞肺癌HCC827细胞,建立吉非替尼耐药细胞株HCC827/GR。应用荧光定量PCR和Western 印迹检测HCC827/GR内ROR1的表达。采用shRNA的方法体外检测ROR1敲除前后HCC827/GR对吉非替尼耐药的变化,采用体外检测ROR1过表达前后HCC827对吉非替尼耐药的变化。体内检测ROR1敲除前后HCC827/GR对吉非替尼耐药的变化。Western 印迹检测HCC827/GR内ROR1下游信号分子的活化。实时荧光定量PCR及Western 印迹结果显示,HCC827/GR耐药细胞中的ROR1 mRNA和蛋白质表达水平显著高于HCC827敏感细胞。体外干扰ROR1表达,可明显增强HCC827/GR耐药细胞对吉非替尼的敏感性 (IC50 15.3±3.69 vs. 4.2±1.38),增加吉非替尼诱导的细胞凋亡 (20.5±2.52 vs. 41.8±3.74)。体外过表达ROR1显著增强HCC827敏感细胞对吉非替尼的耐药性(IC50 0.8±0.52 vs. 2.2±0.87)。体内裸鼠移植瘤实验同样发现,干扰ROR1能增强HCC827/GR移植瘤对吉非替尼的敏感性。进一步研究发现,AKT/FOXO1信号在HCC827/GR耐药细胞中异常活化,而干扰ROR1能够抑制AKT的磷酸化,并上调FOXO1的表达。上述结果表明,ROR1参与非小细胞肺癌吉非替尼耐药,抑制ROR1能够逆转吉非替尼耐药,其机制与ROR1调控AKT/FOXO1信号有关。     

参附注射液联合奥西替尼治疗晚期EGFR阳性非小细胞肺癌患者疗效及对患者免疫功能的影响

摘要 目的：探讨分析参附注射液联合奥西替尼治疗晚期EGFR阳性非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）患者疗效及对患者免疫功能的影响。方法：选择2018年6月~2020年12月我院收治的EGFR突变阳性晚期NSCLC患者96例,随机分为观察组50例、对照组46例,对照组给予奥西替尼口服治疗,观察组在对照组基础上给予参附注射液,两组均治疗16周。比较两组治疗临床疗效、免疫功能指标及患者生活质量评分结果。结果：治疗前,两组T淋巴细胞亚群水平和EORCT-QLQ-C30评分差异均无统计学意义（P>0.05）;治疗后,与对照组相比,观察组患者治疗有效率、CD4⁺/CD8⁺比值、功能领域及总体健康状况评分均显著增加,而外周血CD8⁺水平、症状领域评分均显著降低（P<0.05）。结论：参附注射液联合奥西替尼治疗晚期EGFR阳性NSCLC患者可有效提高临床治疗效果,改善患者机体免疫功能并提高患者生活质量,值得临床推广。     

ERCC1对H520细胞Mdr1及SP细胞的影响分析

目的:分析ERCC1对H520细胞中Mdr1及SP细胞比例的影响。方法:利用RNA干扰技术构建ERCC1-shRNA重组质粒表达载体,转染并筛选出阳性稳定转染的H520细胞;采用RT-PCR和WesternBlot的方法检测ERCC1对H520细胞多药耐药1(Mdr1)的影响;采用流式细胞仪检测ERCC1对H520细胞SP细胞比例的影响。结果:RT-PCR检测出Mdr1 mRNA在含有ERCC1-shRNA的H520细胞和含有空载体的细胞中和内参的A比值分别为0.423±0.147和0.468±0.02(n=5),两者有显著性差异;Western-Blot检测出Mdr1蛋白浓度在含有ERCC1-shRNA的H520细胞较含有空载体的细胞中明显降低。含有ERCC1-shRNA的H520细胞SP细胞比例达到0.8%,而含有空载体的H520细胞的SP细胞比例则达到2.2%。结论:RNA干扰技术可以构建重组质粒,稳定转染的H520细胞能被筛选出,当ERCC1基因被抑制时,Mdr1基因也会收到抑制,同时使H520细胞SP细胞比例明显降低。     

siRNA干扰UGT1A1基因表达对结直肠癌细胞CPT-11化疗敏感性的影响

目的:研究siRNA干扰UGT1A1基因表达对HT-29细胞CPT-11化疗敏感性的影响.方法:realtime PCR,western blot方法检测UGT1A1 mRNA和蛋白表达.采用四甲基偶氮唑蓝显色法(MTT)观察HT-29细胞对CPT-11化疗敏感性的影响.结果:UGT1A1-siRNA可显著抑制HT-29细胞中UGT1A1 mRNA和蛋白的表达(P<0.01).Con组与MOCK组IC50值分别为25.13和24.87,干扰组IC50值为12.23(P<0.05,VS Con或MOCK组).结论:转染UGT1A1-siRNA可显着增加结直肠癌HT-29细胞对CPT-11化疗的敏感性.     

Jagged 1与Delta1对树突状细胞的影响

Jagged 1与Delta1是Notch信号通路中的两个配体,近来研究表明,它们能影响树突状细胞的分化和成熟,并通过树突状细胞等抗原提呈细胞介导T辅助细胞的不同分化,可能为免疫性疾病的临床治疗提供新的药物靶点.     

逆转录病毒载体介导MGMT和MDR1基因增强人脐血CD34＋细胞对联合化疗抗性的研究

To explore whether human umbilical cord blood hematopoietic progenitor cells transduced with human O6-methylguanine-DNA-methyltransferase (MGMT) and multidrug resistance gene (MDR1) increase resistance to 1,3-Bis(2-Chloroethy1)-1-Nitrosourea (BCNU) and P-glycoprotein effluxed drugs, the present authors obtained a full length cDNA fragment encoding MGMT from liver tissue of a patient with cholelithiasis by RT-PCR. A bicistronic retroviral vector G1Na-MGMT-IRES-MDR1 cDNA was constructed and transfected the packaging cell lines GP + E86 and PA317 by electric performation method, using the medium containing VCR and BCNU for cloning selection and ping-ponging supernatant infection between ecotropic producer clone and amphotropic producer clone, cord blood CD34+ cells were enriched with a high-gradient magnetic cell sorting system (MACS), and then transfected repeatedly with supernatant of retrovirus containing human MGMT and MDR1cDNA under stimulation of hemapoietic growth factors. PCR, RT-PCR, Southern blot, Northern blot, Western blot, FACS and MTT assay were used to evaluate the transfer and expression of the double genes in cord blood CD34+ cells. The cDNA encoding MGMT was verified by DNA sequencing and the bicistronic retroviral vector was confirmed by restriction endonuclease analysis. The purity of cord blood CD34+ cells was approximately 92% and recover rate was 75%, the highest titer of recombinant amphotropic retrovirus in the supernatant was up to 5.8 x 10(5) cfu/ml. The efficiency of gene transduction was 18% and 20% tested by colony formation and PCR, respectively. No helper virus was found by both nested PCR and rescue assay. The results showed that dual drug resistance genes have been integrated into the genomic DNA of cord blood CD34+ cells and expressed efficiently. The MTT analysis showed a 4.5 to 7.8-fold increase of resistance of transducted cells to BCNU and P-glycoprotein effluxed drug as compared with the nontransduced cells. This study provided a foundation for ameliorating combination chemotherapy toxicity in tumor clinical trial.     

TREM1对软骨细胞线粒体动力学及细胞凋亡的影响

摘要 目的：探讨髓系细胞表达激发受体分子1(triggering receptor expressed on myeloid cells 1,TREM1)对软骨细胞线粒体动力学及细胞凋亡的影响,以期为骨关节炎治疗提供新的研究方向。方法：使用白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）刺激ATDC5小鼠软骨细胞以模拟骨关节炎软骨细胞炎症,qPCR检测白介素-6（IL-6）表达以验证炎性软骨细胞诱导情况,同时检测目标基因TREM1的表达。为观测抑制TREM1对炎性软骨细胞的影响,将细胞分为对照组、IL-1β组及IL-1β+LR12（TREM1抑制剂）组,分别通过Mito-Tracker染色、TUNEL染色观察三组细胞的线粒体动力学和凋亡情况。接着探究过表达TREM1对正常ATDC5软骨细胞的影响,设置空载质粒组、TREM1过表达组及过表达TREM1+LR12处理组,使用Mito-Tracker染色及TUNEL染色检测三组细胞线粒体动力学和凋亡情况。此外,PCR Array检测过表达TREM1对软骨细胞代谢的影响。结果：与对照组相比,IL-1β组IL-6基因表达增加,表明炎性软骨细胞造模成功;TREM1在IL-1β处理后的骨关节炎细胞中表达升高,使用TREM1抑制剂（LR12）处理可有效抑制TREM1的表达,且能明显抑制软骨细胞的炎性因子IL-6的表达。IL-1β组软骨细胞的线粒体动力学失衡和凋亡增加,而IL-1β+LR12组上述情况得到改善。另外,与空载质粒组相比,过表达TREM1组出现线粒体动力学失衡和凋亡增加,但在TREM1+LR12组软骨细胞中线粒体失衡和凋亡增加得到缓解。此外,PCR Array发现过表达TREM1可引起ATDC5细胞的代谢紊乱。结论：TREM1可一定程度损害软骨细胞线粒体动力学平衡及促进细胞凋亡,靶向TREM1可能为骨关节炎治疗提供新的方向。     

FGFR1通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路介导非小细胞肺癌对吉非替尼的耐药

目的:探讨成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)诱导非小细胞肺癌(NSCLC)吉非替尼获得性耐药的机制。方法:用吉非替尼诱导PC9细胞构建耐药细胞株PC9/GR,用CCK-8、平板克隆形成、transwell技术检测细胞的增殖和迁移能力,用流式细胞术检测细胞的凋亡状况,qRT-PCR、免疫荧光和蛋白免疫印迹技术检测基因表达水平。进一步采用FGFR1抑制剂PD173074或si RNA-FGFR1处理PC9/GR细胞,检测细胞的增殖、迁移、克隆形成能力的变化及Akt、p-Akt、m TOR和p-mTOR表达的变化。结果:PC9/GR细胞的增殖、迁移及对吉非替尼的耐受能力显著增强;FGFR1在PC9/GR细胞中的表达水平显著升高;用PD173074处理PC9细胞后,其增殖、迁移能力及对吉非替尼的耐受能力显著下降;敲低FGFR1后Akt和m TOR的磷酸化水平显著下降。结论:FGFR1通过PI3K/AKT/mTOR信号通路介导非小细胞肺癌对吉非替尼的耐药。     

SIRT1在宫颈癌细胞耐药中的作用及其机制研究

摘要目的：探讨沉默交配型信息调节因子2同源蛋白1（silentmatingtypeinformationregulation2homologyl,SIRTl）在宫颈癌化疗耐药中的作用及其机制。方法：体外培养人宫颈癌Hela细胞系和宫颈癌Hela／MMC耐药细胞亚系,westernblotting检测MMC对Hela和Hela／MMC细胞内SIRTl蛋白表达的影响;MTT法检测MMC及Nicotinamide对Hela和Hela／MMC细胞增殖的影响;AnnexinV-PI试验检测Hela／MMC细胞凋亡的亡的情况;RT—PCR方法检测耐药相关蛋白P—gP的mRNA表达情况。结果：正常情况下,Hela／MMC细胞中SIRTl的表达显著高于Hela细胞（P〈0．05）,MMC处理的Hela／MMC细胞中SIRTl的表达显著高于未经MMC处理（P〈0．05）。Nicotinamide对Hela和Hela／MMC细胞具有相似的生长抑制作用,Nicotinamide可使MMC诱导的Hela／MMC细胞凋亡增加,同时降低细胞内P-gP的mRNA表达（P〈0．05）。结论：SIRTl表达下调能显著减轻Hela／MMC细胞对MMC的耐药性,其作用可能与P—gp有关。     

WIP1对小鼠B细胞及T细胞发育的影响

目的研究WIP1基因对小鼠骨髓B细胞发育及胸腺T细胞发育的影响。方法流式细胞术测定小鼠骨髓B细胞及胸腺T细胞发育中各阶段的细胞比例。结果虽然WIP1缺失小鼠骨髓B细胞发育各阶段比例正常,但骨髓总体B细胞比例下降;WIP1基因敲除小鼠胸腺发育障碍,CD8/CD4双阴性细胞比例增高,CD8/CD4双阳性细胞比例降低。结论 WIP1基因在小鼠骨髓B细胞及胸腺T细胞的发育过程中起重要作用。     

膜蛋白KCNN1在昆虫细胞Sf9中的表达与纯化

目的:利用昆虫细胞表达系统真核表达并纯化小电导钙激活钾离子通道蛋白1(KCNN1)。方法:以基因重组方法构建杆状病毒穿梭质粒reBacmid-KCNN1,将其转染至杆状病毒/Sf9细胞表达系统表达目的蛋白,并用Western印迹鉴定KCNN1的表达水平;用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱纯化裂解细胞上清中的KCNN1,并用Western印迹鉴定纯化结果。结果:KCNN1在Sf9细胞中高效表达,通过亲和层析获得了纯化的KCNN1。结论:膜蛋白KCCN1在昆虫细胞Sf9中的表达与纯化,为深入研究其分子生物学功能提供了材料,也为全长膜蛋白的体外表达提供了一套可借鉴的实验方法。     

Jagged1在树突状细胞诱导免疫耐受中的作用

Jagged1是Notch信号通路中的一个配体,近来许多研究表明,它能诱导树突状细胞的成熟,并通过促使T淋巴细胞分化成调节性T细胞或II型T辅助细胞,从而诱导免疫耐受。     

FOXO1在胰岛β细胞中的表达及对增殖凋亡功能的影响

胰岛功能受损的分子机制研究是揭示2型糖尿病(T2DM)发病机制的核心问题．FOXO1是胰岛素信号下游的重要靶转录因子,参与胰岛的发育,但在分化成熟的胰岛β细胞中的功能尚未阐明．本研究采用免疫组化方法结合激光共聚焦技术观察FOXO1在胰岛的表达及细胞定位;通过基因介导的转移技术和siRNA干预技术,在培养的大鼠胰腺癌β细胞系（INS-1E）中特异高表达组成性活性的FOXO1(FOXO1-AAA)或抑制其表达水平,观察FOXO1表达水平的改变对β细胞增殖、凋亡的影响．免疫组化结果显示,FOXO1在正常胰腺组织中仅特异地表达在胰岛内．采用胰岛素与FOXO1的免疫荧光双标结合共聚焦观察进一步揭示,FOXO1主要表达在胰岛的β细胞中．Western印迹显示,腺病毒介导的基因转移技术在体外培养的INS-1E细胞中过表达FOXO1-AAA或其特异的siRNA均能有效地上调或抑制其表达水平3H-TdR掺入实验结果显示,降低FOXO1的表达显著促进细胞增殖;反之,高表达FOXO1显著抑制细胞增殖．与之相应,MTT检测结果显示,降低FOXO1的表达对细胞存活有显著促进作用,高表达FOXO1对细胞存活有显著抑制作用．进一步采用流式细胞仪检测细胞凋亡,结果显示降低FOXO1的表达使β细胞凋亡率降低,反之高表达FOXO1使β细胞凋亡率增加．研究结果证实,胰岛β细胞中的FOXO1参与β细胞的存活、增殖、凋亡的调节．病理性高表达FOXO1可能通过阻止β细胞增殖、促进β细胞凋亡从而减少β细胞的数量,在T2DM发生中可能起重要作用．     

KKXX-motif对VKORC1亚细胞定位的影响

目的研究细胞内质网蛋白贮留信号KKXX-motif,对维生素K环氧化物还原酶复合物亚基1（VKORC1）的亚细胞定位的作用。方法利用点突变试剂盒构建VKORC1的KKXX突变体——VKORC1-SSXX;同时应用pEGFP载体构建VKORC1-SSXX和VKORC1-KKXX的绿色荧光融合蛋白表达质粒。瞬时转染HEK293s细胞,观察野生融合蛋白和突变融合蛋白的表达情况。结果野生型融合蛋白荧光分布在胞浆内,而突变型融合蛋白聚集表达。结论KKXX-motif影响了VKORC1的亚细胞定位。     

埃克替尼治疗晚期非小细胞肺癌的疗效及对患者血清相关指标水平的影响

目的:分析埃克替尼对晚期非小细胞肺癌的治疗效果及对血清指标的影响。方法:将86例晚期非小细胞肺癌患者按抽签法分成对照组与观察组,各43例。对照组采用多西他赛治疗,观察组采用埃克替尼治疗。观察并比较两组患者治疗前后血清细胞角蛋白21-1(Cyfre21-1)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)、血管内皮生长因子(VEDF)、自然杀伤(NK)细胞、CD4~+、CD8~+、CD4~+/CD8~+,白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)水平、临床疗效以及安全性。结果:观察组疾病控制率高于对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。治疗后,两组患者血清Cyfre21-1、SCCA、CD8~+、LI-8、TNF-α、MMP-2及MMP-9均低于治疗前,且观察组低于对照组,,差异具有统计学意义(P0.05);治疗后,两组患者血清VEGF水平均降低,且观察组低于对照组,差异具有统计学意义(P0.05);治疗后,两组患者血清NK、CD4~+及CD4~+/CD8~+均高于治疗前,且观察组高于对照组,差异具有统计学意义(P0.05);观察组不良反应发生率低于对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:埃克替尼对晚期非小细胞肺癌的临床效果肯定,可下调血清VEGF表达。     

IL-1β对体外培养NIT-1β细胞胰岛素分泌的影响

利用小鼠胰岛β细胞系NIT 1细胞,对不同时间、不同浓度IL 1β作用下细胞的生长和胰岛素的分泌进行观察,以研究IL 1β对胰岛β细胞胰岛素分泌的影响,探讨细胞因子对胰岛β细胞功能的抑制作用.结果显示在IL 1β作用下,各组NIT 1细胞分泌胰岛素呈不同程度降低,表明IL 1β对NIT 1β细胞系胰岛素的分泌具有显著抑制作用.     

SHIP1在急性髓细胞白血病患者中的表达及对人白血病细胞凋亡的影响研究

目的:探讨含SH2结构域的肌醇1(SHIP1)在急性髓细胞白血病患者中的表达及对人白血病细胞凋亡的影响。方法:采用Western blot检测收集的急性髓细胞白血病患者骨髓中SHIP1的表达。人白血病细胞U937转染SHIP1过表达载体(pEGFP-SHIP1组)及对照空载体(pEGFP组),同时设置对照组,对照组细胞不转染载体,其他步骤同pEGFP-SHIP1组和pEGFP组。流式细胞仪检测48 h的细胞凋亡情况,Western blot检测48 h细胞中SHIP1、Bcl-2、Bax、Akt、p-Akt的表达。结果:急性髓细胞白血病患者骨髓中SHIP1表达明显低于正常人(P0.05)。pEGFP-SHIP1组细胞中SHIP1、Bax表达和凋亡率均明显高于pEGFP组及对照组(P0.01),Bcl-2、p-Akt表达均明显低于对照组(P0.01)。结论:SHIP1在急性髓细胞白血病患者骨髓中表达下调,其可能通过Akt信号促进人白血病细胞凋亡。