CRISPR/Cas9技术编辑OsRhoGDI2基因导致水稻半矮化

OsRhoGDI2是通过酵母双杂交从水稻幼穗中分离的一个与Rho蛋白家族成员OsRacD相互作用蛋白的编码基因,但功能尚不明确。本研究利用CRISPR/Cas9技术创制水稻OsRhoGDI2基因敲除突变体。检测结果表明,转基因水稻T0代获得2种纯合突变体,T1代获得8种纯合突变体。序列分析显示,在敲除水稻中,该基因的编辑靶点附近发生了碱基的替换或缺失,预期生成丧失RhoGDI保守结构域的截短蛋白。表型比对分析发现,敲除水稻与对照相比,株高显著降低,统计学分析结果显示,敲除水稻株高降低源于第Ⅱ和第Ⅲ茎节的缩短,提示OsRhoGDI2基因可能与水稻株高控制相关。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻ROP基因OsRac5

OsRac5基因属于水稻小G蛋白ROP家族。该基因参与了水稻的育性调节,但是OsRac5在水稻生长发育中的作用尚不清楚。为鉴定该基因的功能,本文采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,构建了该基因的双靶标载体Cas9-OsRac5,并对水稻进行了遗传转化。对转基因水稻的筛选和分子鉴定显示,在T1代获得了10个纯合突变株系。序列分析显示,在OsRac5编辑水稻中,该基因编码区发生了碱基缺失或/和插入,导致预期产生的不同类型OsRac5截短蛋白均丧失小G蛋白的保守结构域。对抽穗期OsRac5编辑水稻的表型进行统计学分析,结果显示,OsRac5编辑水稻与对照在剑叶角度以及剑叶净光合速率上存在极显著差异,其中OsRac5编辑水稻剑叶角度增大67%,剑叶净光合速率减小32.7%。本研究结果提示,OsRac5基因通过调控剑叶角度,影响水稻光合效率,与水稻生长发育密切相关。     

利用CRISPR/Cas9多基因编辑系统在水稻中快速引入遗传多样性

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-核酸内切酶9(CRISPR/Cas9)系统已经成为许多物种特定基因组编辑的强大工具.利用CRISPR/Cas9多基因编辑系统成功构建共敲除水稻(Oryza sativa)中8个农艺性状基因的载体.通过遗传转化实验和DNA测序,发现8个基因在T_0代有较高的突变效率,并且T_0代突变株的突变类型包括杂合突变和纯合突变.此外,还在T_0代突变株中发现了纯合的六突突变株、七突突变株、八突突变株.由于T_0代植物中获得丰富的突变体组合类型,因而,观测到靶基因多样的突变表型.该研究表明,CRISPR/Cas9系统在作物育种过程中快速引入遗传多样性方面的潜力.     

CRISPR/Cas9技术在水稻类受体激酶基因OsBAK1L突变体制备中的应用

植物类受体激酶在植物生长发育及响应外界环境信号刺激中具有重要作用,为了进一步研究水稻类受体激酶OsBAK1L的功能,我们利用CRISPR/Cas9技术对该基因进行定点编辑。OsBAK1L定位在细胞膜上且该基因预测编码蛋白包含三个功能结构域:胞外LRR结构域、跨膜结构域及胞内激酶域。为了进一步理解该蛋白不同结构域上的功能,我们分别在胞外LRR结构域(Target 1)和胞内激酶域(Target 2)上设计该基因定点编辑靶点。将合成的靶位点序列插入入门载体CH,然后与表达载体Cas9进行重组。重组载体通过农杆菌介导方法转入野生型水稻9522中,2个构建分别获得26棵和12棵潮霉素抗性植株。通过对转基因植株的测序分析,找到了3棵和2棵序列发生变化的杂合T_0代植株。T_0代杂合植株自交分离分别获得T_1代两靶位点处纯合子突变体,靶位点1处纯合子突变体株系缺失5个碱基,靶位点2处纯合子突变体株系插入1个碱基,均可造成该基因转录本翻译提前终止。该基因不同结构域上突变体的获得为进一步研究该基因功能提供了重要且稳定的遗传材料。     

小麦穗部发育多效基因的遗传分析与基因定位

在小麦育种材料中首次发现一种穗部发育萎缩且花器官明显退化,但茎、叶等其他器官发育正常的突变体sda1(spike development atrophy 1)。用显微镜观察突变体sda1的花器官,用碘-碘化钾鉴定其小孢子育性;以‘陕麦94’为父本,突变材料sda1为母本构建F2群体,调查各主要农艺性状,灌浆期测定穗部及穗下茎可溶性糖含量、旗叶光合性能(净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率),对该突变体进行遗传分析;利用SSR微卫星标记,通过混合分离分析(BSA)和群体连锁分析进行基因定位,进一步探索该基因功能。结果表明:(1)小麦突变体sda1雄蕊发育畸形,雌蕊发育萎缩,小孢子几乎全部丧失育性。(2)对突变体sda1原株系中表型正常植株的后代分离统计分析结果证明,该突变性状由1对隐性核基因控制,并命名该基因为SDA1。(3)在F2群体中,突变株抽穗期较正常株延迟4d;穗部及穗下茎可溶性糖含量分别显著高于正常株30.6%和11.0%,但突变株与正常株的抽穗持续时间(均为8d)和光合性能无显著差异。(4)经基因定位分析初步确定SDA1位于小麦6B染色体WMC398和BARC136标记之间,与两标记的遗传距离分别为2.2cM和2.1cM。推测认为,SDA1是一个控制抽穗期与器官发育的多效基因,且该基因突变影响植株的糖分转化与利用。     

应用CRISPR/Cas9技术在杨树中高效敲除多个靶基因

CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于细菌、酵母、动物和植物中的基因组定点编辑技术。本课题组在前期工作中利用该系统在毛白杨(Populus tomentosa Carr.)中率先实现了对内源基因—八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene dehydrogenase, PDS)基因的定点敲除。为研究靶点的设计和选择对该系统介导的杨树内源基因敲除效率的影响,本文分析了不同单向导RNA(Single-guide RNA, sgRNA)结合毛白杨PDS(PtPDS)靶基因DNA序列后对突变效率的影响。结果发现sgRNA与靶基因间的碱基错配会导致突变的效率降低,甚至不能突变,其中3′端的碱基配对更为重要。进一步测序分析发现,该系统能同时敲除杨树基因组上两个同源的PDS编码基因(PtPDS1和PtPDS2),突变率分别达86.4%和50%。研究证明该系统可快速高效地敲除两个以上的内源基因,获得多重突变体杨树株系。利用该技术,本课题组已获得多个杨树转录因子及结构基因的敲除突变体株系,为将来开展基因功能研究和杨树遗传改良奠定了基础。     

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得水稻OsYUCCA1基因突变体

为研究植物激素生长素在模式作物水稻中的功能,我们利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,设计水稻生长素合成基因Os YUCCA1的两个靶位点,构建Os YUCCA1基因的敲除载体。通过对Os YUCCA1基因序列分析,将合成的靶点序列插入含hsp Cas9n的载体中,再与p CAMBIA1300重组,构建基因编辑载体,通过农杆菌介导的方法转化水稻品种9522。从78棵转基因苗中鉴定得到针对Os YUCCA1的3种突变类型,包括26棵在外显子第260号碱基处插入碱基A或T两种类型纯合突变和22棵在外显子第447号碱基处插入A、444号碱基C被T替换、445号碱基G被C替换的杂合突变类型。通过分析,发现3种突变株系都存在移码现象而使氨基酸提前终止致使基因突变。本研究成功利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除了水稻Os YUCCA1基因,为进一步研究Os YUCCA1基因功能提供了理论参考依据。     

稻香相关基因OsBADH2在“吉粳88”中的基因编辑研究

近年来稻米的香味品质受到消费市场的格外重视。水稻OsBADH2基因是影响稻米香味的重要基因,选择优质粳稻品种,针对该基因进行基因编辑,有望创制出香味品质优异的粳稻材料。本研究通过分析OsBADH2基因外显子序列的保守性,选择了3个特异性靶点,分别构建了U6启动子驱动的包含不同靶点的gRNA表达盒,并将其连入植物基因编辑表达载体。利用基因枪介导的瞬时转化体系,对非香型粳稻品种"吉粳88"进行遗传转化,T_0代共获得847株再生材料。经高分辨率溶解曲线(High Resolution Melting,HRM)分析和测序验证,24株T_0代材料的OsBADH2基因编辑靶点发生了不同类型的编辑。在T_1代材料中获得了7类不含转基因成分,且OsBADH2基因靶点纯合的基因编辑后代材料。本研究结果表明基于基因枪介导的瞬时转化体系,转化再生过程中省略了抗性筛选过程,并辅以高效的HRM检测,能够在T_1代即获得位点发生纯合编辑且无转基因成分的基因编辑后代材料。本研究获得的OsBADH2基因编辑的"吉粳88"后代材料也为培育香味品质改良的粳稻品种提供了新材料。     

缺失OSR结构域功能的GS3蛋白正向调控水稻籽粒大小

水稻种子粒型是影响产量的重要因素。GS3基因是水稻第一个被克隆的粒型基因,主要调控籽粒的粒长和粒重。GS3蛋白包含N端的OSR(Organ size regulation)和C端的Cys-rich功能结构域。GS3基因主要存在4种自然变异类型,分别为GS3-1至GS3-4。其中,GS3-1编码全长GS3蛋白;GS3-2编码的蛋白质插入1个氨基酸;GS3-3导致GS3完整蛋白缺失,表现为籽粒变长;GS3-4编码N端的OSR结构域,表现为籽粒明显变短。截至目前,在水稻自然变异中仍未发现仅编码C端的Cysrich结构域的GS3变异类型,其对籽粒大小的调控也不清楚。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在DNA序列两侧设计靶点删除大片段序列,创制出仅编码C端Cys-rich功能结构域的突变类型gs3-5,并获得纯合突变株系。与受体背景中花11相比,gs3-5纯合突变株系表现为粒长和千粒重增加。上述结果表明OSR结构域是GS3蛋白作为籽粒大小的负调控因子所必需的,为进一步解析OSR结构域对籽粒大小的调控以及探索新的育种改良方法提供了参考。     

利用CRISPR/Cas9构建稳定遗传的斑马鱼WHSC1L1纯合突变体

本研究以斑马鱼为研究对象,成功构建组蛋白甲基化酶WHSC1L1基因敲除的纯合突变体,为研究WHSC1L1在胚胎发育早期组蛋白甲基化修饰的影响提供模型。采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑通过http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/和http://crispr.mit.edu/网站分别对靶位点序列特征和脱靶可能性打分,设计高活性的single-guide RNA(sgRNA)通过TA克隆测序检测到F_0突变效率高达75%,通过F_0代雌雄交配,对得到13条F_1代成体进行逐一剪尾鳍鉴定基因型,得到6条WHSC1L1基因缺陷的纯合突变体,6条纯合体均为同一种突变类型,且突变类型为移码突变。通过设计高效率的sgRNA可以直接通过F_0代雌雄交配获得纯合突变体省去了F_0代与野生型交配确定突变率的步骤。本研究得到WHSC1L1基因缺陷的纯合体,为研究胚胎发育过程中由此基因突变引起的组蛋白甲基化修饰变化对胚胎发育的影响及机制提供了有力的帮助。     

斑马鱼tbx2b调控心脏房室间隔发育的功能研究*

tbx2是早期心脏发育的关键基因。为进一步探究其对房室间隔(AVC)发育的影响,研究利用CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术,成功构建了斑马鱼tbx2b突变体。通过T7E1酶切对其F₀进行敲除效率检测,结果显示平均敲除效率约为57.5%。F₁进一步筛选获得tbx2b杂合突变体,测序结果显示突变类型为11 bp碱基缺失的移码突变。tbx2b杂合子内交获得纯合子,tbx2b纯合突变体在5 dpf死亡并出现早期心脏环化异常表型。斑马鱼整胚原位杂交实验显示在3 dpf tbx2b纯合突变体中, 心脏腔室分化特异性标志基因nppa、nppb表达上调并异位表达在AVC,而AVC发育关键基因has2的表达消失。高效构建tbx2b突变体并初探其对下游基因的影响,为后续深入研究tbx2b对心脏AVC发育的作用奠定了基础,同时加深了人们对早期心脏调控网络的认识。     

供氮水平对盐胁迫下水稻叶片光合及叶绿素荧光特性的影响

为了解供氮水平对不同时期盐胁迫下水稻(Oryza sativa)叶片光合及叶绿素荧光特性的影响, 以2个北方常规粳稻(Oryza sativa subsp. japonica)品种为材料, 在5个氮水平下进行培养, 于分蘖期、孕穗期和抽穗期分别进行盐胁迫处理, 测定分析了水稻叶片光合及叶绿素荧光参数的变化。结果表明, 与对照相比, 盐胁迫下水稻叶片的净光合速率(P_n)、蒸腾速率(T_r)、气孔导度(G_s)和表观叶肉导度(AMC)均显著降低, 在分蘖期、孕穗期和抽穗期分别以2N、1N和1/2N水平下降低的百分率最小; 气孔限制值(L_s)则显著增加, 分别以2N、1N和1/2N水平下增加的百分率最大。盐胁迫下, 与对照相比, PSII的实际光合效率(ΦPSII)、表观光合量子传递效率(ETR)和光化学淬灭(qP)均显著降低, 在分蘖期、孕穗期和抽穗期分别以2N、1N和1/2N水平下降低的百分率最小; 非光化学淬灭(NPQ)呈增加的变化趋势, 与对照相比, 分别以2N、1N和1/2N水平下增加的百分率最小。以上结果说明盐胁迫下水稻孕穗后, 供氮水平适量降低有利于减缓叶片光合作用的下降, 提高其抵御盐害能力。     

采用CELⅠ酶粗提物高效鉴定CRISPR/Cas9介导的基因突变

CRISPR/Cas9是新兴的基因组编辑技术,该技术操作简单、效率高,已成为目前最主流的基因组编辑技术。利用该技术进行突变体创制,对基因功能研究和育种应用具有重要的意义,而快速、高效、低成本的基因编辑个体鉴定是其中的重要环节。本研究对影响CELⅠ粗提物鉴定CRISPR/Cas9介导的水稻基因编辑个体的条件,包括蛋白用量及作用时间、PCR反应缓冲液等条件进行了探索,并将整个检测体系集成于一管操作。同时,采用CELⅠ粗提物检测了CRISPR/Cas9介导水稻stn1突变的T_0代植株及后代,对杂合突变、纯合突变及双等位突变的鉴定策略进行了探讨;该方法检测正确率经测序验证达100%。上述结果表明,采用CELⅠ粗提物检测突变体与已有方法比较具有廉价、快速和高效的特点。     

拟南芥agl16突变体的创制及功能鉴定

AGL16是调控拟南芥气孔密度和ABA含量的重要负调控转录因子,在拟南芥抗旱反应过程中发挥重要的作用。为了获取拟南芥agl16突变体材料,采用棉花叶皱缩病毒(CLCrV)介导的VIGE系统筛选靶向敲除拟南芥AGL16的sgRNA,同时利用农杆菌介导的浸花法将完整编辑载体转化野生型拟南芥,创制了拟南芥agl16突变体并进行抗旱性鉴定。结果表明：(1)利用CLCrV介导的VIGE系统筛选获得2个能靶向敲除AGL16基因的sgRNA,同时构建AtU6 26∷AtAGL16 sgRNA1 35S∷Cas9 Ter p1300编辑载体转化野生型拟南芥Col 0,筛选获得靶位点缺失4 bp的agl16纯合突变体(AGL16: 4)。(2)抗旱表型性鉴定结果显示,干旱处理18 d后,大部分野生型植株干枯死亡,而突变体植株受胁迫的表型相对较轻;复水后,野生型和突变体植株的存活率分别为34.5%(10/29)和75%(27/36)。(3)与野生型相比,干旱胁迫下AGL16: 4纯合突变体植株叶片单位面积气孔数量减少、离体叶片失水率显著降低,但二者的单株种子量并没有发生明显的改变。研究认为,AGL16: 4纯合突变体的抗旱性较野生型明显增强,且种子量与野生型基本一致,表明AGL16基因可作为作物抗旱育种理想的候选靶基因;所获得的agl16突变体为后期从农作物中克隆的AGL16同源基因进行功能回补验证提供了有利的转基因受体材料。     

禾谷镰刀菌中FgPDE1基因的敲除及其功能的研究

目的:旨在敲除禾谷镰刀菌Fusarium graminearum Fg PDE1基因,确定其缺失突变体表型,从而分析该基因的生物学功能。方法:应用Split-marker技术构建含有潮霉素基因敲除盒,通过PEG介导原生质体转化,PCR筛查抗潮霉素转化子以获得缺失突变体ΔFg PDE1,根据突变体表型变化及致病性的检测对Fg PDE1基因的功能进行分析。结果:采用Split-marker技术,成功构建了Fg PDE1基因敲除盒;PEG介导转化禾谷镰刀菌原生质体后成功获得转化子。经PCR筛查,得到3个PCR确认的敲除突变体;表型观察发现,ΔFg PDE1菌落的外型及菌落生长速度与野生型没有明显差异。孢子侵染西红柿果实实验证明:以西红柿为侵染宿主,相对于野生型,突变体致病性没有明显减弱;但突变体分生孢子产量显著下降。结论:Fg PDE1基因可能与禾谷镰刀菌分生孢子的形成有关。     

一个显性卷叶突变体z2的遗传分析与精细定位

叶片的适度卷曲对水稻理想株型育种具有重要意义。在水稻T-DNA插入突变体库中获得一个叶片外卷突变体z2,突变体表型出现在分蘖期;与野生型相比,农艺性状无明显差异,光合作用效率高于野生型。对突变体和野生型的石蜡切片研究表明,突变体叶片泡状细胞数量(8-9个)明显多于野生型(4-5个)。z2卷叶性状遗传稳定,由一对显性核基因控制。以z2纯合突变体为母本,籼稻Dular为父本进行杂交构建F2代定位群体,利用图位克隆的方法,将该基因初定位于水稻第2号染色体的In Del1812与In Del1870标记之间,物理距离为580 kb。     

CRISPR/Cas9介导基因组编辑培育糯稻不育系WX209A

糯稻作为特种稻米每年在我国和广西都有一定比例的消费,为了培育高产糯稻品种,本研究利用CRISPR/Cas9介导基因组编辑技术将高产的非糯性品种转为糯性品种,对水稻优良保持系209B中的W_x位点进行定点编辑,并转育成糯稻不育系WX209A。209A又名银丰A,是优良籼稻不育系,已组配出一批水稻品种在广西、广东、江西等地进行大面积推广。本研究针对该保持系的Wx基因选择合适的靶位点,构建sgRNA表达盒与 YLCRISPR/Cas9载体连接,利用农杆菌介导转化209B;对T_0、T_1代转化植株定点编辑位置进行PCR检测和测序分析及测定转化植株精米直链淀粉含量,筛选出无外源转化原件的纯合保持系WX209B并转育出不育系WX209A。结果表明,T_0代材料中Wx位点的突变频率高达69.2%,其中纯合缺失突变率占26.9%;对T_1代纯合突变体的调查分析结果表明,多数W_x基因突变体能显著降低直链淀粉含量,所获得的糯稻保持系WX209B直链淀粉含量仅1%,糯性品质优良,其他形态、经济性状没发生显著的改变,所转育的糯稻不育系WX209A具有重要的利用价值。     

一个新的水稻叶绿素缺失黄叶突变体的特征及基因分子定位

从粳稻“嘉花1号”⁶⁰Coγ射线辐照的后代中筛选到一个叶绿素缺失黄叶突变体(yl11), 与野生型“嘉花1号”相比该突变体表现为全生育期植株叶片呈黄色, 叶绿素含量以及净光合速率明显下降, 叶绿体发育不完善, 并且伴随着株高等主要农艺性状的变化。遗传分析表明, 该突变性状受一对隐性核基因(yl11)控制。该突变体与籼稻“培矮64S”杂交生产的F₂、F₃群体中的分离出突变体型920个单株作为定位群体, 利用SSR和InDel分子标记将yl11基因定位在水稻第11染色体长臂上的MM2199和ID21039分子标记之间, 其物理距离约为110 kb, 目前该区域内没有发现与水稻叶绿素合成/叶绿体发育相关已知功能基因。研究结果为今后对该基因的克隆和功能分析奠定了基础。     

利用CRISPR/Cas9技术建立敲除JAK2基因K562细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9技术对K562细胞系JAK2基因进行编辑,构建JAK2基因敲除的K562细胞系。方法:使用CRISPR在线设计工具,针对JAK2基因设计sgRNA,构建Cas9-sgRNA共表达质粒。使用第二代慢病毒包装系统包装慢病毒并感染K562细胞,提取细胞基因组DNA,Sanger测序和TA克隆检测基因编辑活性。无限稀释法将编辑阳性的细胞接种于96孔板并扩培得到单克隆细胞株,提取基因组DNA,Sanger测序和TA克隆分析敲除JAK2单克隆细胞的基因型。结果:成功构建靶向敲除JAK2基因的lentiCRISPRv2-sgRNA3-1质粒。优化方案得到低细胞毒性高转染效率的感染K562细胞慢病毒量。CRISPR/Cas9系统成功在JAK2基因sgRNA3-1识别位点发挥基因组编辑活性,获得纯合敲除JAK2基因细胞株K562-JAK2~(-/-)(两个等位分别发生移码突变,预期编码没有功能的JAK2蛋白)。结论:CRIAPR/Cas9系统通过慢病毒感染方式获得JAK2基因纯合敲除的K562细胞株,该细胞模型可用于研究在慢性髓系白血病中JAK2基因的作用,为构建K562敲除其他基因细胞系提供实验依据,为探究造血分化机制的研究奠定实验基础。     

水稻矮杆多分蘖突变体CA648的光合生理特性分析

本研究分析了水稻矮杆多分蘖突变体丛矮648 (CA648)及对照中花11 (ZH11)在分蘖期叶片的叶绿素含量、光合速率,还原糖、蔗糖含量以及POD酶活力。结果表明,分蘖期ZH11剑叶中叶绿素含量高于CA648。水稻分蘖前期,CA648的净光合速率、气孔导度、蒸腾速率都低于ZH11,胞间CO2浓度高于ZH11;而在分蘖盛期(分蘖期后20 d)两种材料的净光合速率差异显著,ZH11净光合速率比CA648高17.5%,同时CA648的气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率都低于ZH11;而分蘖后期ZH11与CA648净光合速率几乎相同。分蘖盛期CA648叶片还原糖含量明显比对照高;而茎杆还原糖含量与对照无差异。CA648叶片蔗糖含量低于对照,约为ZH11的77.5%;而茎杆的蔗糖含量高于对照,比ZH11高30.7%。两种材料POD酶活力差异明显,其中在分蘖盛期,CA648叶、茎中的POD酶活力分别比ZH11高73.0%、16.8%。