白粉菌诱导下感病小麦京411中TCTP基因的表达分析

TCTP广泛存在于动植物及微生物中,参与重要的生物过程。对小麦中克隆到的TCTP基因进行了白粉菌诱导下的表达模式分析,结果发现,在对白粉菌敏感的小麦京411中,白粉菌侵染后TCTP基因应答迅速,且基因表达水平较高。用病毒介导的基因沉默方法沉默京411中的TCTP基因,发现白粉菌成功侵染小麦叶片的比例下降,乳突等抗性结构特征比例上升,H2O2在细胞内的累积水平升高。试验结果表明,TCTP在小麦与白粉菌互作过程中起重要作用。     

利用瞬间表达技术分析小麦抗病相关基因的功能

采用瞬间表达技术分析了TaTBL、TaPK1和TaTST等3个抗病相关基因的功能。首先将这3个小麦抗病相关基因构建入高效表达载体,然后使用基因枪将目标基因和GUS基因载体同时导入到感白粉病小麦品种离体叶片表皮细胞中,用GUS基因标记阳性转化细胞。转化后接种白粉菌孢子,48h后观察转化阳性表皮细胞,研究抗病相关基因表达对白粉菌入侵及吸器形成产生的影响。结果表明,这3个基因在感病小麦品种叶片表皮细胞中的瞬间表达,对白粉菌侵入和吸器形成均有部分抑制作用,在一定程度上增强了表达细胞对白粉菌的抗性。     

Rpfan37在刺槐共生结瘤过程中的功能探究

目的:研究刺槐中与磷脂酰肌醇转运蛋白有较高同源性的基因Rpfan37的功能,为探究相关基因参与豆科植物与根瘤菌共生结瘤过程提供新的思路。方法:通过前期研究,建立豆科植物刺槐与共生根瘤菌互作的抑制差减杂交反交文库,筛选疑似与共生结瘤相关的基因。利用PCR技术快速克隆经实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)分析基因在不同接菌时间及不同植物组织的表达。构建RNA干扰(RNAi)重组载体,转农杆菌介导转化植物根部,接种根瘤菌后验证该基因在刺槐共生结瘤过程的功能。结果:基因表达分析显示,在接菌与未接菌的刺槐根中,处理后第15天,Rpfan37表达均显著上调,但接菌与未接菌处理对该基因表达无显著影响;在成熟的根瘤中,该基因仅为低水平表达。RNAi转化植株的鲜重、株高、根长及结瘤数较对照组显著降低。在显微镜下观察到RNAi植株根毛发育异常;与对照相比,RNAi转化植株形成的根毛卷曲、根毛侵染线及根瘤原基数目均显著降低。根瘤石蜡切片结果显示RNAi植株根瘤中的侵染细胞与对照相比明显减少,分析豆血红蛋白表达发现,RNAi植株中根瘤发育成熟过程明显受阻。结论:在豆科植物刺槐中发现的相关基因Rpfan37能够参与刺槐共生结瘤过程,为研究磷脂酰肌醇转运蛋白在共生结瘤过程中的作用提供了新的理论基础。     

利用小麦微卫星标记定位一个来自野生二粒小麦的抗白粉病基因

培育抗病品种是控制小麦白粉病危害最经济有效而又安全的手段.寻找和创造新抗源是抗病育种的基础工作,是解决抗源单一化问题的有效途径.来自以色列的野生二粒小麦G-305-M对北京地区小麦白粉菌流行小种15号表现免疫,用G-305-M与小麦品种781杂交并用京411回交(G-305-M/781//京411*3),成功地将G-305-M的抗白粉病基因转入普通小麦中.遗传分析表明转入小麦中的抗病性苗期表达受一对显性基因控制,该基因暂定名为MlG.用96对小麦微卫星引物对一个167株的抗性分离家系进行了SSR分析,发现引物WMS570扩增产物在抗感个体间存在多态性.经分离群体验证,抗病基因MlG与小麦染色体6AL上的微卫星位点Xgwm570连锁,遗传距离为14.9±3.0cM,据此将MlG定位于6AL.根据系谱和基因位点分析,推断MlG基因是不同于已知抗白粉病基因的一个新基因.     

磷脂酰肌醇信号在GLUT4囊泡转运中的调控作用

葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)参与胰岛素敏感的脂肪细胞和肌肉细胞中的葡萄糖转运,对机体葡萄糖代谢至关重要。磷脂酰肌醇作为各种蛋白质的定位信号,参与调控细胞生长和新陈代谢,在胰岛素信号转导过程中起着关键作用。在过去的几十年里,关于磷脂酰肌醇信号调控GLUT4囊泡转运方面已有了很大的进展。该文总结了磷脂酰肌醇在GLUT4囊泡转运中的调控作用。     

栽培小麦Brock中与新抗白粉病基因紧密连锁的AFLP分子标记筛选与分析

本研究用225对引物对农艺性状优良但对白粉菌敏感的栽培小麦京411、抗白粉病栽培小麦Brock以及京411与Brock配制的近等基因系进行AFLP分子标记筛选,结果发现只有2对引物组合Pst GAC/Mse TCT(P1)和Pst AGC/Mse ACC(P2)在上述抗感材料中表现出多态性,分别扩增到2个特异片段,将特异片段克隆并测序发现,P1扩增的特异片段长268bp,P2扩增的特异片段长227bp,命名为AFLP标记P1268和P227.用106个京411×Brock的F2单株进行连锁性分析表明,P1268和P2227与抗白粉病基因的遗传距离分别为3.6和1.9cM,与Brock中的抗白粉病基因呈紧密连锁.该两个AFLP标记对小麦抗白粉病基因的积累和分子标记辅助选择育种有重要意义.     

小麦白粉病菌对小麦幼苗光合生理特性的影响

为探讨小麦白粉病菌对不同抗性小麦品种幼苗光合生理特性的影响,本研究采用白粉病强致病力生理小种E09感染高抗小麦白粉病品种青春38、高感小麦白粉病品种龙麦33幼苗,研究接菌后0 d、1 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d小麦叶片总叶绿素含量、光合速率(Pn)、叶片可溶性蛋白、叶片细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性的变化。研究数据表明,接种小麦白粉病菌后,两小麦品种青春38和龙麦33的体内相对叶绿素含量、光合速率及可溶性蛋白含量均不同程度的降低,且感病品种龙麦33降低幅度较抗病品种青春38高。接菌后,两个品种的相对SOD、POD及CAT活性均表现为先升高后降低的变化趋势,相对SOD活性表现为感病品种龙麦33的峰值高于抗病品种青春38的峰值;相对POD活性则是抗病品种青春38的增加幅度极显著高于感病品种龙麦33的增加幅度;相对CAT活性则表现为两品种出现峰值的时间不同,但峰值幅度差异不显著。     

小麦抗白粉病相关基因的转化

利用玉米花青素苷合成调节基因C1-Lc作为报告基因, 通过瞬间表达后愈伤组织表面红色斑点的统计分析, 优化了小麦幼胚愈伤组织的基因枪转化参数。小麦Beclin1类似基因TaTBL和硫代硫酸硫转移酶基因TaTST是2个在白粉菌诱导条件下具有增强表达特性的抗病相关基因。本实验进一步利用基因枪将ubi强启动子控制下的2个基因导入到小麦品种扬麦158的幼胚愈伤组织细胞中, 使用除草剂经两轮选择培养基上的筛选和再生获得抗性植株, 进一步通过抗性植株的PCR分析获得转TaTBL基因植株5株, 转TaTST基因植株6株。转基因植株离体叶片的人工接种实验表明, 外源基因的导入不同程度上增强了植株的白粉病抗性, 表现为延缓了白粉菌的发育。利用玉米花青素苷合成调节基因C1-Lc作为报告基因,通过瞬间表达后愈伤组织表面红色斑点的统计分析,优化了小麦幼胚愈伤组织的基因枪转化参数。小麦Beclin1类似基因TaTBL和硫代硫酸硫转移酶基因TaTST是两个在白粉菌诱导条件下具有增强表达特性的抗病相关基因。本实验进一步利用基因枪将ubi强启动子控制下的两个基因导入到小麦品种扬麦158的幼胚愈伤组织细胞中,使用除草剂经两轮选择培养基上的筛选和再生获得抗性植株,进一步通过抗性植株的PCR分析获得转TaTBL基因植株5株,转TaTST基因植株6株。转基因植株离体叶片的人工接种实验表明,外源基因的导入不同程度上增强了植株的白粉病抗性,表现为延缓了白粉菌的发育。     

巴西橡胶树磷脂酰肌醇转移蛋白cDNA的克隆及其序列分析

本文从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)差减cDNA文库中筛选到一个与磷脂酰肌醇转移蛋白(phos-phatidylinositol transfer protein)同源性较高的基因片段,并根据该基因片段序列信息,设计特异性引物,采用cDNA末端快速扩增技术RACE(rapid amplification of cDNA ends)进行差异片段的5'和3'端的扩增,并获得长度为1081bp的全长cDNA克隆R291(GenBank登陆号:AY589690)。序列分析表明,该基因包含702bp的开放阅读框,编码234个氨基酸,推测其蛋白质的分子量为26.8kD,等电点为6.51,有一个的跨膜螺旋区(氨基酸位点为83～103)。R291基因含有一个脂质结合保守区(Sec14p-like lipid-binding domain),具有CRAL-TRIO脂质结合结构域,推测该基因是一个磷脂酰肌醇转移蛋白基因。该基因的克隆将为橡胶树磷脂酰肌醇代谢的研究奠定了基础,将有助于进一步了解磷脂酰肌醇代谢与胶乳再生之间的关系。     

差异显示法克隆与小麦低温诱导相关的磷脂酰乙醇胺结合蛋白基因

本研究利用差异显示技术检测经低温处理的小麦品种"石新828"及对照材料中的mRNA,获得2条差异片段序列。经Blast比对后,发现其中一条长为293bp的差异片段序列与小麦的一个冷调蛋白基因的mRNA(GenBank:AB097412.1)同源性为99%。该基因编码的蛋白属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族,命名为wpebp。经荧光定量PCR分析,wpebp基因的表达量随低温处理时间的增长总体呈上升趋势,表明该基因与小麦的抗寒能力相关。     

胚芽鞘保存麦类白粉菌种的研究

在大小麦感病品种的胚芽鞘大约长1—1.5cm 时接种白粉菌的分生孢子,置17—20℃的室温下20小时左右后,放入1—4℃的冰箱中保存。整个保存期间不加光照。30—40天后,胚芽鞘上长出白粉菌丝和分生孢子。经无病小麦苗接种试验,在3—4℃下小麦白粉菌保存110天、1—3℃下保存150天以上,胚芽鞘上的白粉菌分生孢子仍具有与盆栽麦苗上保存的分生孢子相似的侵染力。用胚芽鞘保存白粉菌种不需附加光照,方法简便,易于保持菌种纯度,保存期长。     

糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白与动脉粥样硬化

动脉粥样硬化是心血管系统疾病的重要病理改变.目前,已发现多种糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白与动脉粥样硬化的发生,发展密切相关.CD14参与了动脉粥样硬化的慢性炎症过程;T-钙黏着蛋白可作为LDL的受体与动脉粥样硬化联系密切;其他的糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋自如CD87等参与了动脉粥样硬化时细胞的移行、粘附、凋亡和增殖等.     

磷脂酰丝氨酸合成酶基因pss的克隆与表达

磷脂酰丝氨酸合成酶能催化转酯反应,是定向合成特定磷脂类物质特别是磷脂酰丝氨酸的工具酶,但出发菌株产量低,很大程度上限制了酶法合成磷脂酰丝氨酸的工业化应用。利用表达载体pET-22b,实现了大肠杆菌磷脂酰丝氨酸合成酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的同源高效表达。利用镍亲和柱对表达产物进行纯化,并用HPLC法对纯化后的重组酶的活力进行检测。结果表明,目的蛋白可在短时间内进行大量表达,蛋白含量是出发菌株的100倍,同时经6h的转酯反应转化率达到33%,重组磷脂酰丝氨酸合成酶活力达到69U/mg蛋白。     

Glypican-3与肿瘤关系的研究进展

磷脂酰肌醇蛋白聚糖是硫酸乙酰肝素糖蛋白中的一个家族,参与调控个体发育、细胞增殖和分化等过程。其中,磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3)与肿瘤的发生发展关系密切,特别是在肝细胞癌中特异性高表达,有望成为一个新的肿瘤标志物。     

小麦锌指蛋白基因的克隆、序列与表达分析

根据R基因及其调控基因保守序列设计简并性引物,对白粉菌接种和未接种处理的一对抗病和感病的小麦—黑麦等位突变易位系TAM104R和TAM104S总RNA进行RT-PCR扩增,得到一个诱导表达的cDNA片段。序列分析表明,该片段全长2474bp,其中含有一个822bp的完整开放阅读框,推测其编码一个有273个氨基酸残基、分子量约31kD的蛋白质分子。蛋白质的氨基酸序列比对显示,该蛋白质分子具有C2HC锌结合motif CX2CX4HX4C结构和锌指domain,可见克隆的cDNA是一个锌指蛋白基因,命名为TaZF。Southern杂交表明,TaZF在抗病易位系TAM104R的基因组中是多拷贝的。半定量RT-PCR分析显示,TaZF基因属组成型表达、但受白粉菌诱导表达上调的基因,推测其与白粉病菌的侵染过程相关。基因组DNA专化扩增、克隆和测序揭示TaZF基因无内含子。     

磷脂酰肌醇 -3 激酶不直接调控PC12 细胞的分泌

磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)是磷脂酰肌醇代谢过程中一种重要的酶,通过其代谢产物参与了对多种细胞生理活动的调节,如囊泡运输、细胞骨架重组、细胞存活、吞噬作用、细胞凋亡等.为研究其对细胞分泌功能的作用,使用磷脂酰肌醇-3激酶家族的特异性抑制剂渥曼青霉素(wortmannin)阻断磷脂酰肌醇-3激酶的活性,以EGFP-2xFYVE融合蛋白与磷脂酰肌醇-3-磷酸(PtdIns-3-P)的结合为指征,使用荧光显微成像技术检测渥曼青霉素对磷脂酰肌醇-3激酶的抑制作用,采用膜片钳膜电容测量方法及光解钙离子释放技术检测渥曼青霉素对PC12细胞分泌功能的影响.实验结果表明,wortmannin阻断了磷脂酰肌醇-3激酶的活性,抑制了磷脂酰肌醇-3-磷酸(PtdIns-3-P)的产生,并使FYVE与PtdIns-3-P解离,但渥曼青霉素处理之前和处理30 min后的PC12细胞分泌反应的幅度、动力学特性和分泌的钙依赖性均无显著差异,表明磷脂酰肌醇-3激酶对PC12细胞的分泌无显著的直接影响.     

细胞内物质转运调节分子ARFGAP3的克隆表达及生化活性

ADP核糖基化因子-GTP酶活化蛋白(ARF GAP)是重要的细胞内物质转运调节分子.在22周孕龄人胎肝cDNA文库中发现一种新基因,其编码的氨基酸序列与大鼠ARF1 GAP有32%同源性.将这种新基因命名为“ARFGAP3”,对其进行功能研究,利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),从人胎盘总RNA中扩增ARFGAP3全长cDNA序列,并将其亚克隆到pGEM-T载体;采用RNA印迹法和斑点杂交法,检测其组织表达谱,发现在多种腺体和睾丸中有很高水平ARFGAP3基因转录,并且只有一种约2.7 kb的转录本.利用基因重组技术,构建表达质粒pBAD/Thio-ARFGAP3,在大肠杆菌中表达,采用亲和层析法纯化表达产物,利用肠激酶切除重组融合蛋白N端引导序列.检测重组ARFGAP3的生化活性,证实ARFGAP3对ARF1具有GAP活性,促进ARF1结合的GTP水解为GDP,磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)增强其GAP活性,而磷脂酰胆碱(PC)抑制其GAP活性.     

小麦病程相关蛋白1基因的克隆及特性分析

利用RT－PCR技术,从被白粉菌诱导的小麦－簇毛麦6VS／6AL易位系中获得病程相关蛋白1（TaPr-1)cDNA克隆,该基因具有编码164氨基酸的开放阅读框,其中包含24个氨基酸构成的信号肽和140个氨基酸组成的成熟肽（MW为15.1kD),经蛋白结构比较分析,发现其与植物中已分离的多种PR1类蛋白具一定的同源性,Northern杂交显示,易位系易被诱导12小时左右,该基因转录物累积最多,其在抗病易位系和感病亲本扬5中表达水平有明显差异,Southern杂交表达在小麦基因组中该基因的拷贝数多于1个,且该基因在扬5和易位系中表现多态性,表明6VS上有可能携带基因。     

橡胶树白粉菌分支酸变位酶基因克隆及蛋白表达纯化

由橡胶树白粉菌引起的橡胶树白粉病是橡胶树的重要的叶部病害之一,严重影响橡胶的产量。然而目前对橡胶树白粉菌的致病机理研究匮乏。分支酸变位酶是莽草酸途径的关键酶,能够将分支酸转化为预苯酸,为植物提供氨基酸及大量代谢产物,在植物抗病中起到非常重要的作用。而植物病原物在致病过程当中能够分泌分支酸变位酶影响植物莽草酸途径,从而抑制植物的防卫反应。因此研究橡胶树白粉菌分支酸变位酶在其致病过程中的功能具有一定的意义。试验利用同源比对分析在橡胶树白粉菌基因组中获得一个分支酸变位酶同源蛋白,并用PCR克隆获得橡胶树白粉菌分支酸变位酶基因,命名为OHCmu。后续构建GST-OHCmu融合原核表达载体,筛选最优诱导条件,并利用GST亲和层析柱对蛋白进行纯化。结果表明橡胶树白粉菌OHCmu基因大小843 bp,具有1个内含子,编码263个氨基酸;具有d5csma_结构域,属于Chorismate mutaseⅡ蛋白家族;GST-OHCmu融合蛋白外源诱导表达在供试条件下(IPTG:0.8 mmol/L, 16℃)可以有较好的表达,获得融合蛋白大小约为56 kD。经过GST亲和层析柱纯化、切割GST标签后,顺利获得浓度较高、较纯的橡胶树白粉菌OHCmu蛋白。研究结果为后续OHCmu蛋白的特性及致病机理研究提供参考。     

小麦硫代硫酸硫转移酶类似基因的克隆与定位

小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系92R137含有抗白粉病基因Pm21。为了研究该易位系的抗病机理,应用mRNA差异显示和快速扩增cDNA未端（Rapid Amplification of cDNAEnd,RACE)技术对在白粉菌诱导后表达增强的基因进行了克隆,分离到1个命名为TaTST的全长cDNA序列。Northern杂交分析表明,TaTST基因在白粉菌诱导后表达明显增强,24h达到峰值,氨基酸序列同源性分析表明,TaTST与Datisca glomerata的硫代硫酸硫转移酶基因（rho-danese,EC,2.8.1.1)序列有64%相同,80%相似,用中国春缺体/四体系和端体系Southern杂交和基因特异性引物扩增（gene specific primer-PCR)将TaTST基因定位在小麦6B染色体短臂上,Southern杂交表明,该基因为单拷贝基因,由于在杨麦5号和6VS/6AL易位系间存在明显多态,可以推测在6VS上有TaTST的同源基因,TaTST是从小麦中分离的新基因。白粉菌诱导后的表达变化提示;TaTST与小麦抗白粉病反应有关。