家蝇变应原Tropomyosin基因的克隆、序列分析及诱导表达

对家蝇变应原原肌球蛋白(Tropomyosin)基因进行同源克隆,序列分析;构建原核表达载体并在大肠杆菌中表达。从家蝇幼虫cDNA文库中筛选获得Tropomyosin基因。以该基因的cDNA文库质粒为模板,进行PCR扩增,获得家蝇Tropomyosin完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽、二级结构、三级结构、抗原表位和亚细胞定位等方面进行预测和分析。构建pEASY-E1-Tropomyosin重组质粒,转化到大肠杆菌OrigamiB(DE3)中进行诱导表达。Tropomyosin基因ORF全长828 bp,编码275个氨基酸,理论分子量31.6 kD;等电点为4.65,具有Tropomyosin家族的蛋白保守结构域。成功构建重组原核表达pEASY-E1-Tropomyosin并诱导表达重组蛋白。     

牛病毒性腹泻病毒E2抗原表位表达及验证

[目的]获得高效表达的重组牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea virus,BVDV)E2免疫抗原蛋白。[方法]应用软件分析BVDV-E2蛋白抗原表位,将富含抗原表位基因片段连接表达载体p GEX-4T-1,并转化至大肠杆菌(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot检测诱导表达蛋白,经镍柱分离纯化;以纯化蛋白为包被抗原,用间接ELISA检测抗原对免疫血清的反应性。[结果]成功克隆BVDV-E2抗原表位基因,并在大肠杆菌中高效表达,Western Blot和ELISA证实表达重组蛋白对BVDV阳性血清具有反应原性。[结论]获得大小为49.5 k Da的BVDV-E2抗原表位蛋白,并且该抗原稀释度在1:40,抗体稀释度在1:20时结合效果最佳。可用于后续的纳米抗体筛选的研究。     

多胺调节因子-1原核表达与多克隆抗体制备

[目的]原核表达和纯化人多胺调节因子-1(PMF-1)并以此为抗原制备多克隆抗体。[方法]PCR扩增人PMF-1编码序列并构建原核表达质粒。将此质粒转化大肠杆菌后,IPTG诱导PMF-1蛋白表达并在变性条件下用NiNTA树脂纯化。将纯化的PMF-1用作抗原免疫大耳白兔以制备抗PMF-1多克隆抗体。ELISA法检测抗体效价,免疫印迹法和细胞免疫化学法分析抗体特异性。[结果]成功构建PMF-1原核表达质粒,在大肠杆菌中IPTG可诱导该质粒高效表达PMF-1蛋白。以纯化的PMF-1蛋白为抗原免疫大耳白兔后,获得高效价的抗PMF-1抗血清(抗体效价为1∶128 000)。该抗体能与PMF-1蛋白特异性结合,并可用于PMF-1的免疫印迹和细胞免疫化学分析。[结论]成功建立了人PMF-1原核表达和纯化技术,并制备出高特异性的抗PMF-1多克隆抗体,该抗体可用于PMF-1的免疫印迹分析和细胞免疫化学分析。     

人Aurora B基因的克隆、原核表达及生物信息学分析

目的:克隆出人AuroraB基因,并将其于大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中表达,获得重组蛋白.方法:利用TRIzol Reagent 法提取食管癌ECa 109细胞总RNA,RT-PCR后以其cDNA为模板PCR扩增Aurora B基因,构建pET 28a(+)-Aurora B重组质粒,将其转化Rosetta(DE3)菌株,IPTG体外诱导表达重组蛋白.利用生物信息学工具对Aurora B的核酸序列和蛋白功能结构进行分析.结果:成功构建了pET 28a(+)-AuroraB重组质粒,经序列比对,与GenBank上公布的人Aurora B基因序列同源性达到了99％;获得AuroraB蛋白,大小约39kDa,蛋白表达量约占菌体总蛋白的28％.结论:对人AuroraB基因进行克隆、原核表达及生物信息学分析,为深入研究Aurora B在细胞周期调控中的作用机制及后续Aurora B抑制剂的体外筛选奠定基础.     

金黄色葡萄球菌青霉素结合蛋白PBPX基因的克隆与表达

[目的]对金黄色葡萄球菌一种新的青霉素结合蛋白(PBPX)进行原核表达,为新型抗菌药物设计提供参考数据。[方法]将ATCC25923基因组数据通过Blast进行比对,从中发现了一个含有PBP保守结构域的基因序列,命名为PBPX。PCR扩增PBPX基因,将扩增产物酶切后与原核表达载体p ET-32a(+)连接,构建表达PBPX的重组质粒,将该重组质粒转化大肠杆菌TG1内,增菌培养后提取质粒,经PCR、双酶切鉴定后,再转化大肠杆菌BL21(DE3),对转化菌株诱导后进行10%SDS-PAGE分析。[结果]构建了表达载体p ET-32a(+)-PBPX,在37℃经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后获得表达,重组青霉素结合蛋白分子量为52. 2 k Da。[结论]PBPX基因成功克隆到表达载体内并获得了表达。     

Carboxin抗性基因(Cbx~R)原核表达及多克隆抗体的制备

[目的]克隆CbxR基因,进行原核表达,纯化CbxR基因蛋白并制备其多克隆抗体。[方法]CbxR基因克隆至原核表达载体p ET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达并纯化,Western blot鉴定分析。制备CbxR蛋白的兔源多克隆抗体,运用间接ELISA方法检测多抗效价,利用Western blot印记检测抗体特异性。[结果]成功获得CbxR基因,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导可大量表达,成功制备CbxR蛋白兔源多克隆抗体,效价为1∶64 000,经Western blot检测表明多克隆抗体特异性良好。[结论]多克隆抗体为CbxR检测及进一步研究CbxR基因功能奠定了基础。     

炭疽芽孢杆菌保护性抗原在大肠杆菌中的表达及纯化

按照炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）基因成熟肽编码序列设计引物,从炭疽杆菌pOX1质粒中扩增出PA基因片段,将该片段定向插入到原核表达载体pET-28a中,获得了pET-PA原核表达重组质粒,限制性酶切分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为PA基因的成熟呔编码序列。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,重组蛋白在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达;Western印迹分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。     

人VDAC2融合蛋白质粒构建及原核表达研究

目的：构建人VDAC2融合蛋白原核表达质粒并进行原核表达研究。方法：运用RT—PCR技术在培养的人HepG2．2．15细胞中钓取到目的基因VDAC2,连接至T载体上进行克隆,获得大量目的基因与原核表达载体pTrc—CKS、pMBP—P连接,构建重组融合蛋白表达质粒,转入大肠杆菌中DH5a,BL21（DE3）LySs中,IPTG诱导蛋白原核表达,表达产物经SDS—PAGE检测,分析蛋白表达情况。结果：成功构建了重组载体pTrc—CKS—VDAC2和pMBP—P-VDAC2,并在原核大肠杆菌中实现了重组融合蛋白的超量表达。结论：构建的两个人VDAC2的融合蛋白表达质粒在大肠杆菌中均得到超量表达。为进一步研究VDAC2蛋白奠定了基础。     

家蝇抗真菌肽-溶菌酶基因的克隆、表达及序列分析

旨在对家蝇抗真菌肽MAF-1-溶菌酶(LZM)基因进行生物信息学分析,并进行融合基因MAF-1-LMZ的克隆和表达分析。从Gen Bank获得家蝇抗真菌肽MAF-1和溶菌酶LZM的编码序列,分析和预测这两种蛋白质的结构和功能。PCR扩增融合蛋白质抗真菌肽-溶菌酶的基因MAF-1-LMZ,将其克隆到原核表达载体p ET-28a中,重组质粒p ET-28a-MAF-1-LMZ在大肠杆菌Origmi B/DE3中经用IPTG诱导表达,表达产物MAF-1-LMZ通过SDS-PAGE电泳进行鉴定,采用小试管法倍比稀释法进行活性验证。结果显示,融合蛋白质MAF-1-LMZ序列的ORF为969 bp,编码322个氨基酸残基,理论分子量为35 468.6 Da,等电点为8.31,在大肠杆菌Origmi B/DE3中得到成功表达。其纯化后的目的蛋白具有抗真菌活性。     

人TRAF3IP3基因剪接异构体2的克隆表达和生物信息学分析

[目的]克隆、原核表达并纯化人类TRAF3IP3基因剪接异构体2(TRAF3IP3iso2),对TRAF3IP3iso2蛋白进行生物信息学分析。[方法]从人骨髓单个核细胞c DNA中扩增TRAF3IP3iso2开放阅读框区,双酶切连入原核表达载体p ET-28a(+),重组质粒转化E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达效果,Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白;根据测序结果对TRAF3IP3iso2蛋白进行生物信息学分析。[结果]成功克隆了人类TRAF3IP3iso2编码区并构建了原核表达载体p ET-28a(+)-TRAF3IP3iso2,在大肠杆菌中诱导表达、纯化获得了相对分子量约22.7k Da的融合蛋白;生物信息学分析显示TRAF3IP3iso2蛋白二级结构以α螺旋为主,无TRAF3IP3iso1蛋白的跨膜区结构。[结论]证明了人类TRAF3IP3iso2的存在,为TRAF3IP3功能的研究提供了实验依据。     

GST/ AEP 融合蛋白原核表达载体的构建、表达及鉴定

目的：为进一步研究抗癫痫肽（And—epilepsy peptide,AEP）的抗痫机制及筛选其相关作用蛋白,进行GST／AEP融合蛋白原核表达载体的构建及融合蛋白的表达。方法：通过PCR基因扩增对AEP基因进行扩增,并将其克隆于谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1中,经酶切、序列鉴定分析后,用该重组质粒转化大肠杆菌B121（DE3）,经IPTG诱导获得表达,并采用Western Blot进行检测。结果：成功构建了AEP原核表达载体,并在大肠杆菌B121中获得表达。结论：成功构建了GST／AEP原核表达载体,并表达了GST／AEP融合蛋白。     

美洲大蠊抗菌肽AMPPA13的表达及纯化

[目的]预测美洲大蠊新的抗菌肽基因,构建原核表达体系并纯化表达产物。[方法]通过生物信息学方法,预测分析出潜在的美洲大蠊抗菌肽。构建pET32a重组质粒,优化诱导表达条件,通过亲和层析,分子筛等手段获得纯化的抗菌肽,并进行Western Blot鉴定。[结果]预测出美洲大蠊新的抗菌肽基因AMPPA13,成功构建重组质粒pET32aAMPPA13。优化诱导表达条件得最佳IPTG浓度为0.1 mmol/L,最佳诱导时间为4 h,最佳诱导温度为37℃。纯化后AMPPA13浓度为268μg/m L。[结论]克隆出美洲大蠊抗菌肽基因,并成功构建原核表达体系,得到1 m L纯化的AMPPA13,经Western Blot鉴定,表达产物正确。     

小鼠c-Myc基因的克隆表达及其纯化

目的:克隆小鼠c-Myc基因,构建原核表达载体并对其进行蛋白表达及纯化。方法:以TetO-FUW-OSKM质粒为模板经PCR扩增c-Myc基因,再通过基因重组技术与pET-3C载体相连转化大肠杆菌DH5α。经抗性筛选,PCR鉴定阳性重组子,测序正确后,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE对重组蛋白进行鉴定分析。结果:DNA电泳结果证实PCR扩增产物与预期大小一致,DNA测序结果显示与GenBank公布的c-Myc基因序列一致,IPTG诱导SDS-PAGE电泳后,在分子量64kDa左右出现诱导后蛋白新增条带,与预测的c-Myc分子量大小一致。结论:成功地构建了pET3C-Myc原核表达载体,表达并纯化出了c-Myc蛋白,为今后研究c-Myc蛋白及相关蛋白诱导体细胞成多能干细胞打下基础。     

质粒介导的AmpC β-内酰胺酶共有抗原表位的预测及原核表达

目的 应用生物信息学方法预测质粒介导的AmpC β-内酰胺酶(pAmpCs)共有抗原表位,并实现pAmpCs共有抗原表位-Trx融合蛋白的原核表达、纯化和鉴定。 方法 运用多序列比较工具找出各型质粒介导的AmpC β-内酰胺酶的共有相对保守区域,并利用分子生物学软件Biosun预测各亚型pAmpCs的可及性、抗原性、抗原表位、柔性、亲水性等参数,通过综合分析后找出其共有的抗原表位区域pAmpCs1。根据大肠杆菌的密码子偏好性,把氨基酸序列pAmpCs1转变为核苷酸序列pampcs1,采用重叠延伸PCR合成pampcs1片断,并构建原核表达载体pET32a(+)/pampcs1。通过测序验证,对含有该重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析后,用Ni-NTA亲和层析法纯化pAmpCs1-Trx融合蛋白,利用western blotting方法鉴定融合蛋白的抗原性。 结果 根据预测结果找到了一段各型pAmpCs共有的抗原表位区域pAmpCs1,成功构建了原核表达载体pET32a(+)/pampcs1,经IPTG诱导后得到了分子量约为23KD的融合蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,通过western blotting鉴定该蛋白能被抗AmpC β-lactamases多抗识别。 结论 成功构建了pAmpCs1-Trx融合蛋白原核表达载体,并获得了高纯度的pAmpCs1-Trx融合蛋白,初步证明它的抗原性,为制备特异性抗体及建立快速检测方法打下了良好的基础。     

人分泌磷蛋白2基因的克隆、原核表达与活性检测

提取人肝癌组织RNA,通过RT-PCR扩增人SPP2成熟蛋白编码区基因并克隆至原核表达载体pET-22b（＋）,将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL2l（DE3）,IPTG诱导重组蛋白表达,用Ni-NTA柱进行纯化,SDS-PAGE电泳及Western blot检测并证实目的蛋白的表达,通过重组蛋白对木瓜蛋白酶的抑制作用验证其生物学活性。重组质粒测序和酶切结果显示SPP2成熟蛋白基因已成功克隆到pET-22b（＋）。IPTG诱导重组菌后有25kDa大小的目的蛋白表达。优化诱导表达条件,获得可溶性表达的目的蛋白,纯化后纯度达90%,western blot表明其具有His标签抗原活性。重组SPP2成熟蛋白可抑制木瓜蛋白酶的水解作用（酪蛋白为底物）,重量抑制比为1∶3.1,抑制比活性为2511U/mg。     

莱茵衣藻缺铁应答基因Femu2p的克隆及原核表达

[目的]克隆莱茵衣藻缺铁应答基因Femu2p,构建重组表达载体p GEX-6p-1-Femu2p,优化条件使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。[方法]提取莱茵衣藻CC425的总RNA后,利用RT-PCR和两次重叠延伸PCR相结合的方法获得Femu2p的全长编码区,构建原核表达载体p GEX-6p-1-Femu2p,并将其转入大肠杆菌DL21(DE3)中,利用IPTG诱导融合蛋白的表达并优化表达条件。[结果]Femu2p的全长编码区为2 904 bp,编码967个氨基酸,理论分子量为100.4 k Da,理论等电点为8.86。序列分析结果显示该蛋白属于包含多个C2H2类型锌指结构域的Ran BP2家族。IPTG诱导融合蛋白表达的最佳条件为:IPTG浓度0.25 mmol/L,诱导温度16℃,诱导时间8 h。[结论]成功克隆了Femu2p基因的全长编码区,并使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。     

大肠杆菌yfiF基因原核表达系统构建、表达条件优化及蛋白纯化

[目的]构建大肠杆菌功能未知基因yfi F的原核表达系统,对诱导表达条件进行优化,并纯化表达的可溶性Yfi F融合蛋白。[方法]使用p ET16b表达质粒构建p ET16b-yfi F原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达Yfi F融合蛋白,对IPTG加入时机、终浓度及诱导时间进行优化,并使用镍柱纯化裂菌上清液中的可溶性Yfi F融合蛋白。[结果]构建了p ET16b-yfi F重组质粒,IPTG诱导表达Yfi F融合蛋白,最佳诱导条件为细菌生长至OD600值为1时加入IPTG,终浓度为0.1 mmol/L,诱导9 h。裂菌上清液中的可溶性Yfi F融合蛋白纯化后浓度为209μg/ml。[结论]成功构建了yfi F的原核表达系统,优化了诱导表达条件,可溶性Yfi F融合蛋白得到纯化。     

大西洋鲑鱼Ⅳ型抗冻蛋白的表达与纯化

[目的]构建Ⅳ型抗冻蛋白(AFPⅣ)大肠杆菌表达系统,纯化诱导表达的可溶性AFPⅣ,并进行质谱鉴定。[方法]构建pET22b-His6-AFPⅣ重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),并优化IPTG诱导条件,通过亲和层析进行分离纯化,收集样品并冻干保存,对Ⅳ型抗冻蛋白样品进行质谱(MALDI-TOF-TOF)鉴定。[结果]构建了pET22b-His6-AFPⅣ重组质粒,IPTG诱导表达产生可溶性AFPⅣ,且最佳诱导浓度为0.2 mmol/L,诱导时间4h,纯化后AFPⅣ浓度为136μg/ml。[结论]成功构建了AFPⅣ原核表达系统,优化了IPTG诱导条件,重组AFPⅣ得到纯化,并获得冻干样品5 mg,经质谱鉴定确认为AFPⅣ。     

重组斑马鱼CD36蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼CD36蛋白胞外区38～432氨基酸残基段并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼CD36蛋白的基因编码区,连接到带有6~His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET28a-CD36,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达,优化表达条件后用Ni^2＋柱进行纯化。结果：构建了pET28a-CD36重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的46．8×10^3。结论：获得了斑马鱼CD36融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

人抗酶抑制因子-1的克隆与原核表达

目的:克隆人抗酶抑制因子-1(ornithine decarboxylase antizyme inhibitor-1,OAZI-1)cDNA,建立在大肠杆菌中原核表达并纯化人OAZI-1蛋白的实验技术。方法:巢式RT-PCR法从人A549总RNA中扩增人OAZI-1 cDNA并构建pET-28a/OAZI-1原核表达质粒。该质粒转化大肠杆菌原核表达菌BL21(DE3)后IPTG诱导表达。诱导表达出的重组蛋白用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。SDS-PAGE和Western法检测重组OAZI-1蛋白的表达和纯化。结果:成功克隆出编码全长人OAZI-1的cDNA序列,并构建出原核表达质粒pET-28a/OAZI-1。DNA测序分析,重组质粒中的OAZI-1 cDNA无突变,与6×His标签框架对接正确。重组质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中后,可用IPTG诱导表达出重组OAZI-1蛋白,该重组蛋白可用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。结论:成功建立了人抗酶抑制因子的原核表达和纯化的实验方法,为后续OAZI-1的功能研究奠定了基础。