玉米过氧化物还原蛋白BAS1的原核表达及其功能研究

植物过氧化物还原蛋白BAS1是巯基依赖的过氧化物酶,通过催化的Cys残基还原过氧化氢,依赖NADPH的叶绿体硫氧还蛋白还原酶保持BAS1的还原态。玉米含有两种BAS1:2-Cys PrxA和2-Cys PrxB。利用RT-PCR方法从玉米幼叶中克隆了编码成熟2-Cys PrxA的基因,并将蛋白Cys34残基突变成Ser34。SDS-PAGE显示纯化的野生型和突变体蛋白为一条主带,分子量约为23kDa;体外蛋白结合实验表明纯化的叶绿体硫氧还蛋白还原酶通过分子间二硫键结合纯化的2Cys PrxA的C34S突变体,非还原SDS-PAGE显示纯化的野生型2Cys PrxA含有分子间二硫键组成的二体,而纯化的C34S突变体呈现单体,巯基专一性标记化合物AMS修饰及活性分析表明纯化的BAS1还原态是催化还原过氧化氢所所必须的,它由硫氧还蛋白还原酶及其辅酶NADPH所催化。     

凝乳酶原Cys45-Cys50二硫键功能的研究

凝乳酶原突变体Cys45Asp/Cys50Ser包含体溶解所需的温度、时间、pH条件均与野生型一样,而且其氧化再折叠行为与野生型类似,在同样的复性条件下最终都能获得正确折叠可活化的分子.这与缺失Cys250-Cys283二硫键的突变体大不相同,说明Cys45-Cys50二硫键对凝乳酶原正确折叠的贡献小于Cys250-Cys283二硫键,但这对二硫键的缺失使假凝乳酶的热稳定性显著下降,说明此二硫键在稳定酶的空间构象中起重要作用、另外,突变体Cys45Asp/Cys50Ser假凝乳酶的水解蛋白酶活性(P)与凝乳活性(C)均较野生型低,但是其C/P值比野生型高1倍.     

凝乳酶原(凝乳酶)二硫键Cys206-Cys210的定位突变

在对凝乳酶原二硫键Cys206\|Cys210进行定位突变过程中发现,在相应的模板序列中有自身形成自由能为-16.1kcal/mol的茎环结构倾向,妨碍与引物结合,从而难以合成突变的DNA,采用快退火可解决此矛盾。5个突变基因均能在大肠杆菌中高效表达,除C206A外,约占细胞总蛋白的50%左右。突变体的复性结果表明,Cys206\|Cys210对凝乳酶原正确折叠不是绝对必需的,但相应位置的氨基酸取代对复性效率有显著影响,在5个突变体中,C206A/C210A的复性率分别为C206S/C210S\,C210A\,C210S的4.5倍、20倍和30倍,而C206A完全不能复性。C206A/C210A与C206S/C210S的远紫外CD光谱与野生型基本相同,其荧光发射光谱与野生型相比最大发射峰不变,而荧光强度有显著增加。由于上述3个蛋白具有相同比活,说明突变分子能形成具有生物活性的空间构象,而只是某些色氨酸残基微环境受到微扰。     

中国南海新α芋螺毒素Mr1.8的合成及二硫键测定

目的:采用固相方法合成新型α4/7芋螺毒素Mr1.8(PECCTHPACHVSNPELC-NH2),并测定其折叠后的二硫键配对方式。方法:采用Fmoc-固相法合成线性肽Mr1.8,通过空气氧化折叠获得含二硫键的折叠产物,利用两步折叠法测定其二硫键连接方式。结果:Mr1.8线性肽经折叠生成2种产物Ⅰ和Ⅱ,质谱和二硫键分析结果显示Mr1.8-Ⅱ为正确折叠产物,其二硫键框架为(Cys1-Cys3,Cys2-Cys4)。结论:Mr1.8是一种新的α4/7型芋螺毒素,其一种主要折叠产物的二硫键框架为(Cys1-Cys3,Cys2-Cys4)。     

NDPK-A C4/109/145 S突变体降低磷酸转移酶活性但增加DNase活性

核苷二磷酸激酶A( nucleoside diphosphate kinase A, NDPK-A）有广泛的生物学活性,在肿瘤转移和调控中起重要作用.单独抑制NDPK-A中任何1个Cys所形成的二硫键,不会降低NDPK-A的磷酸转移酶活性和DNase活性.本实验通过构建C4/109/145S突变体并研究其生物学效应,为NDPK A结构与功能的研究提供参考.用定点突变法将NDPK-A 的4位、109位和145位Cys突变为Ser,构建pBV220-NDPK-A C4/109/145S和pEGFP-NDPK-A C4/109/145S两种重组质粒.在大肠杆菌中高效表达NDPK-A C4/109/145S突变体,纯化后可获得均一的重组NDPK-A C4/109/145S突变体蛋白.HPLC法和DNA消化法测定发现,C4/109/145S突变体磷酸转移酶活性低于野生型NDPK-A,而DNase活性高于野生型NDPK-A.以A549细胞作为模式细胞的流式细胞仪周期检测表明,C4/109/145S突变体与野生型NDPK-A一致,均可将细胞周期延滞在S期和G2/M期.这些结果证实,NDPK A结构异构与其磷酸转移酶活性密切相关,其酶活性至少需要1个Cys残基存在,NDPK-A结构中的二硫键也可能是其DNase活性的负调控机制之一,胞内NDPK-A的氧化还原异构可能对细胞周期无显著影响.     

人白细胞介素18半胱氨酸的定点突变及其对活性的影响

为研究IL 18结构与功能的关系 ,用重叠延伸PCR定点突变技术构建人白细胞介素 18(hIL 18) 4个半胱氨酸的突变体hIL 18C74 S、C10 4 S、C112 S和C163 S。将突变体的cDNA与原核细胞表达载体pJW2重组并转化大肠杆菌JM10 1。经热诱导后 ,4个突变体在大肠杆菌中均得到了高效表达。表达的蛋白质主要以包涵体的形式存在。包涵体经超声破碎 ,2mol/L尿素洗涤 ,8mol/L尿素溶解 ,SephadexG 10 0柱纯化后 ,纯度可达 90 %以上。以诱导人外周血单个核细胞 (PBMC)产生IFN γ的能力为指标检测复性突变体的活性。结果显示除C10 4 S外 ,其他 3个突变体的生物活性均低于野生型hIL 18,C74 S、C112 S和C163 S的活性分别是野生型hIL 18活性的 5 %、5 8%和11%。证明Cys74 、Cys163 为hIL 18诱导产生IFN γ的功能所必需     

核苷二磷酸激酶A的定点突变及C4S突变体的制备和活性研究

目的:对核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)二硫键异构的关键残基C4进行定点突变,构建、表达并纯化C4S突变体,测定其磷酸转移酶活性和DNase活性,研究二硫键异构对NDPK-A活性的影响。方法:以pBV220-nm23-H1质粒作为模板,通过设计合适的引物对NDPK-A进行定点突变,将第4位半胱氨酸突变为丝氨酸,构建NDPK-AC4S突变体;在大肠杆菌BL21中表达,DEAE-sepharose Fas tFlow与Cibacron Blue 3GA Sepharose CL-4B纯化目的蛋白,获得均一重组蛋白,纯度达到98%;DNA序列测定及重组蛋白的肽质量指纹图谱(PMF)分析均证明构建正确突变体;高效液相色谱法(HPLC)与DNA消化法分别测定野生型NDPK-A与C4S突变体的磷酸转移酶活性与DNase活性差异。结果:NDPK-AC4S突变体的磷酸基转移酶与DNase酶活性均高于野生型NDPK-A。结论:NDPK-A缺失二硫键后,活性增高。NDPK-A形成链内二硫键可能是其活性负调控模式之一。     

纤溶酶原K5抗血管增生活性依赖其完整Kringle结构域

根据K5蛋白(Pro451—Ala541)的结构特征和二硫键分布特点,设计K5的两个缺失突变体K5 mut1(Cys461—Cys540,保留K5 kringle环3个完整二硫键但去除N端和C端多余氨基酸)和K5 mut2 (Cys482—Cys535,打开kringle环,只保留2个二硫键).以野生型人纤溶酶原K5 cDNA为模板,用PCR方法得到编码缺失突变体的DNA片段,定向克隆入pET22b(+)质粒载体,重组体转化进大肠杆菌BL21（DE3）,诱导表达,产物经亲和层析和高浓度甘油透析纯化后进行鉴定和生物活性测定.K5 mut1蛋白特异性抑制人视网膜微血管内皮细胞增殖,且活性强度是完整的K5蛋白2倍;K5 mut2对人视网膜微血管内皮细胞无显著抑制作用.结果提示,完整的Kringle结构（包含3个二硫键）是维持人纤溶酶原K5抗血管增生活性的必需结构域,而K5分子中Kringle结构域外的N端和C端氨基酸臂则并非其活性所必需.     

黑曲霉硫氧还蛋白的克隆表达纯化及其酶活位点特征分析

首次从黑曲霉Aspergillus niger全基因组中克隆出黑曲霉硫氧还原蛋白基因AnTrx,并对其编码蛋白的第33-37位保守区的活性位点实施定点突变C34S、C37S及C34S-C37S,获得相应的3个定点突变基因。将野生型AnTrx及其突变子分别在大肠杆菌Escherichia coli中诱导表达,比浊法测定纯化的各表达产物还原牛胰岛素α与β链之间二硫键的活性。结果表明,AnTrx的3个突变体都不表现明显催化活性。当突变型与野生型AnTrx等量混合后,发现突变型AnTrx-C34S可显著提高野生型AnTrx的催化效率,而突变型AnTrx-C37S却无此功能。由此证明,AnTrx活性结构域的第37位Cys残基上的巯基能参与攻击硫氧还蛋白和底物蛋白所形成的二硫键而释放被还原的底物蛋白,而第34位Cys残基同其他微生物的同一活性域一样参与硫氧化还蛋白与底物的结合。这一结果有助于认识真菌硫氧还蛋白第37位活性位点的作用。     

Characterization of two alkyl hydroperoxide reductase C homologs alkyl hydroperoxide reductase C_H1 and alkyl hydroperoxide reductase C_H2 in Bacillus subtilis

AIM: To identify alkyl hydroperoxide reductase subunit C(AhpC) homologs in Bacillus subtilis(B. subtilis) and to characterize their structural and biochemical properties. AhpC is responsible for the detoxification of reactive oxygen species in bacteria.METHODS: Two AhpC homologs(AhpC_H1 and AhpC_H2) were identified by searching the B. subtilis database; these were then cloned and expressed in Escherichia coli. AhpC mutants carrying substitutions of catalytically important Cys residues(C37S, C47 S, C166 S, C37/47 S, C37/166 S, C47/166 S, and C37/47/166 S for AhpC_H1; C52 S, C169 S, and C52/169 S for AhpC_H2) were obtained by site-directed mutagenesis and purified, and their structure-function relationship was analyzed. The B. subtilis ahp C genes were disrupted by the short flanking homology method, and the phenotypes of the resulting AhpC-deficient bacteria were examined.RESULTS: Comparative characterization of AhpC homologs indicates that AhpC_H1 contains an extra C37, which forms a disulfide bond with the peroxidatic C47, and behaves like an atypical 2-Cys AhpC, while AhpC_H2 functions like a typical 2-Cys AhpC. Tryptic digestion analysis demonstrated the presence of intramolecular Cys37-Cys47 linkage, which could be reduced by thioredoxin, resulting in the association of the dimer into higher-molecular-mass complexes. Peroxidase activity analysis of Cys→Ser mutants indicated that three Cys residues were involved in the catalysis. AhpC_H1 was resistant to inactivation by peroxide substrates, but had lower activity at physiological H2O2 concentrations compared to AhpC_H2, suggesting that in B. subtilis, the enzymes may be physiologically functional at different substrate concentrations. The exposure to organic peroxides induced AhpC_H1 expression, while AhpC_H1-deficient mutants exhibited growth retardation in the stationary phase, suggesting the role of AhpC_H1 as an antioxidant scavenger of lipid hydroperoxides and a stress-response factor in B. subtilis. CONCLUSION: AhpC_H1, a novel atypical 2-Cys AhpC, is functionally distinct from AhpC_H2, a typical 2-Cys AhpC.     

Cys146-Cys146分子间二硫键在人瘦素二聚化过程中起主导作用

在前期研究中,已发现人瘦素（leptin）在体外再折叠过程中会形成稳定的二聚体,但其二聚化机制尚不清楚. 本研究旨在分析瘦素二聚体的结构特性,并重点研究体外再折叠过程中瘦素二聚化的机制. 相较与瘦素单体,瘦素二聚体保留了约75％免疫活性及15％受体结合活性,同时显示出明显慢的天然电泳迁移率. 圆二色性分析显示,二聚体基本保留了单体α螺旋索结构特征. 还原性及非还原性凝胶电泳分析和自由巯基测定结果表明,瘦素二聚体是由一对分子间二硫键连接2个单体而成的.为了确定瘦素二聚化过程中起主导作用的分子间二硫键,利用PCR定点突变技术构建了C96S和C146S两个突变体瘦素. 通过分析C96S及C146S突变体瘦素的体外再折叠特性及过程,并与野生型瘦素相比较,揭示C96S瘦素的二聚体显示出与野生型瘦素二聚体相似的特性,而C146S瘦素不能形成结构稳定的二聚体. 以上研究结果表明,Cys146-Cys146分子间二硫键在人瘦素二聚化过程中起主导作用.     

A7—B7二硫键缺失对胰岛素原重折叠及结构的影响

为研究A7 B7二硫键在胰岛素原结构和折叠中的作用 ,构建了A7 B7二硫键缺失的胰岛素原突变体 ,研究了其与野生型胰岛素原在体外重折叠产率、自由巯基氧化速度、CD谱、受体及抗体结合活性 ,以及对胰蛋白酶酶切敏感性的差别。结果表明 ,A7 B7二硫键缺失可导致胰岛素原α 螺旋明显减少以及对胰蛋白酶的酶切敏感性显著增加 ,其对胰岛素原结构的影响主要导致了受体结合活性的大幅度降低。突变体在体外重折叠 1h后巯基氧化速率较野生型明显减慢 ,但其最终折叠产率与野生型相当。由此提出一个胰岛素原折叠的可能途径 ,即A链链内二硫键最先形成 ,然后是两对链间二硫键。且A2 0 B19二硫键比A7 B7二硫键很可能先形成 ,在折叠中更重要。     

rBTI及其突变体对C. elegans寿命的影响

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂（recombinant buckwheat trypsin inhibitor,rBTI）是一种来源于荞麦Potato Ⅰ抑制剂家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂,具有很好的生物活性及功能。先前的研究表明,rBTI在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中具有很好的延长寿命的性质,但其具体的作用机制还不太清楚。本文的研究证明,rBTI能够调节转录因子DAF-16的转录活性,进而影响线虫的寿命,且该性质与其胰蛋白酶抑制活性密切相关。通过定点突变技术,分别对rBTI的45位、53位和44位氨基酸活性位点进行突变,获得了4种不同胰蛋白酶抑制活性的rBTI突变体,分别命名为rBTI-R45A,rBTI-R45F,rBTI-W53R和rBTI-P44T。经典模式生物秀丽隐杆线虫寿命检测实验显示,野生型rBTI可以明显延长C.elegans的寿命,且在0～10 μmol/L 范围内具有浓度依赖性。和未处理对照组相比,10 μmol/L 野生型rBTI延长寿命幅度可达到14.5%,但是突变体rBTI-R45A,rBTI-R45F和rBTI W53R均不同程度失去了延长寿命的功能。利用荧光显微观察及qRT-PCR等方法进一步研究发现,野生型rBTI 可增强寿命调控转录因子DAF-16的转录活性。与寿命检测实验结果一致,4种 rBTI突变体均不能使DAF-16转录活性增强。上述结果表明,在C.elegans中,rBTI可增强长寿因子DAF 16的转录活性,进而延长虫体寿命,且该功能的发挥依赖于其适当的胰蛋白酶抑制活性。本文的结果为进一步研究开发rBTI的功能提供了实验支持和理论基础。     

幽门螺旋杆菌肿瘤坏死因子α诱导蛋白活性分子的构建、结晶及初步晶体学研究

幽门螺旋杆菌中的肿瘤坏死因子α诱导蛋白(Tipα)被鉴定为幽门螺旋杆菌致病感染中的新型致癌因子.Tipα通过NF-κB的激活诱导肿瘤坏死因子α(TNF-α)的大量表达,从而促使宿主的炎症反应以及肿瘤发生、发展的进程.Tipα的同源二聚体为其发挥生物学功能的活性形式,此二聚体以两个单体间N端半胱氨酸形成的二硫键(Cys25-Cys25与Cys27-Cys27)共价连接.Tipα(25-192)的基因克隆至载体pET22b中,并且在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中以可溶形式高水平表达.重组蛋白经过Ni2+金属亲和层析、阳离子交换层析和凝胶阻滞层析进行分离纯化.Tipα蛋白样品分别通过悬滴和microbatch的方法进行结晶搜索和优化.母体和硒代晶体分别衍射到2.2和2.6,均属于C2空间群,并且具有相似的晶胞参数.母体晶体的晶胞参数为a=127.01,b=47.57,c=96.5,α=γ=90°,β=127.5°.     

定点突变引入二硫键提高华根霉脂肪酶热稳定性的研究

拟对来源于华根霉(Rhizopus chinensis)的脂肪酶r27RCL进行二硫键的构建,从而提高该酶的热稳定性。利用二硫键构建软件Disulfide by Design 2. 0预测突变位点(T201),对野生型脂肪酶r27RCL进行定点突变。借助于毕赤酵母表达系统,对脂肪酶野生型r27RCL及突变体r27RCLT201C进行异源表达,并对其酶学性质进行研究和比较。热稳定性实验显示突变体r27RCL-T201C在60℃处理25 min后剩余酶活较野生型提高了17. 6%。此外,突变体的pH稳定性也较野生型有所提高。对脂肪酶r27RCL进行二硫键的构建有助于提高该酶热稳定性,使其能更有效地应用于工业生产。     

风疹病毒包膜糖蛋白E1中二硫键对其细胞融合活性的影响

为了探讨风疹病毒包膜糖蛋白E1中二硫键对风疹病毒细胞融合活性的影响,在构建重组载体pBSK-SPE2E1的基础上,利用PCR定点突变与体内同源重组相结合的方法,构建了11个突变体,分别将E1外功能区的11个半胱氨酸残基突变为其它氨基酸残基,从而去除一个二硫键,利用Giemsa染色法定性检测由此引起的细胞融合情况,流式细胞术检测导入的外源DNA在细胞表面的表达效率,血吸附检测重组表达的突变体蛋白的受体识别活性。结果表明E1外功能区的10个二硫键对RV的细胞融合活性都有重要影响,任何一个二硫键的去除均导致E1的细胞融合活性丧失;其中第5和第8个半胱氨酸残基所形成的二硫键与E2和E1的相互作用有关,第3、第4和第13个半胱氨酸残基所形成的二硫键可能直接影响E1的细胞融合功能。     

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂延长C.elegans寿命的作用机制

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(recombinant buckwheat trypsin inhibitor,r BTI)是一种来源于荞麦PotatoⅠ抑制剂家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂,具有很好的生物活性及功能。先前的研究表明,r BTI在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中具有很好的延长寿命的性质,但其具体的作用机制还不太清楚。本文的研究证明,r BTI能够调节转录因子DAF-16的转录活性,进而影响线虫的寿命,且该性质与其胰蛋白酶抑制活性密切相关。通过定点突变技术,分别对r BTI的45位、53位和44位氨基酸活性位点进行突变,获得了4种不同胰蛋白酶抑制活性的r BTI突变体,分别命名为r BTI-R45A,r BTI-R45F,r BTI-W53R和r BTI-P44T。经典模式生物秀丽隐杆线虫寿命检测实验显示,野生型r BTI可以明显延长C.elegans的寿命,且在0~10μmol/L范围内具有浓度依赖性。和未处理对照组相比,10μmol/L野生型r BTI延长寿命幅度可达到14.5%,但是突变体r BTI-R45 A,r BTI-R45 F和r BTI-W53 R均不同程度失去了延长寿命的功能。利用荧光显微观察及qRT-PCR等方法进一步研究发现,野生型r BTI可增强寿命调控转录因子DAF-16的转录活性。与寿命检测实验结果一致,4种r BTI突变体均不能使DAF-16转录活性增强。上述结果表明,在C.elegans中,r BTI可增强长寿因子DAF-16的转录活性,进而延长虫体寿命,且该功能的发挥依赖于其适当的胰蛋白酶抑制活性。本文的结果为进一步研究开发r BTI的功能提供了实验支持和理论基础。     

凝乳酶原（凝乳酶）二硫键Ｃys206—Cys210的定位突变

在对凝乳酶原二硫键Ｃys206-Cys210进行定位突变过程中发现,在相应的模板序列中有自身形成自由能为－１６．１kcal/mol的茎环结构倾向,妨碍与引物结合,从而难以合成突变的ＤＮＡ,采用快退火可解决此矛盾。５个突变基因均能在大肠杆菌中高效表达,除Ｃ２０６Ａ外,约占细胞总蛋白的５０％左右,突变的复性结果表明,Ｃys206-Cys210对凝乳酶原正确折叠不是绝对必需的,但相应位置的氨基酸取代对复性效率有显著影响,在５个突变体中,Ｃ２０６Ａ／Ｃ２１０Ａ的复性率分别为Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２１０Ｓ、Ｃ２１０Ａ、Ｃ２１０Ｓ的４．５倍、２０倍和３０倍,而C206A不能复性。Ｃ２０６Ａ／Ｃ２１０Ａ与Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２１０Ｓ的远紫外ＣＤ光谱与野生型基本相同,其荧光发射光谱与野生型相比最大发射峰不变,而荧光强度有显著增加由于上述３个蛋白具有相同比活,说明突变分子能形成具有生物活性的空间构象,而只是某些色氨酸残基微环境受到微扰。     

融合表达新冠病毒S1与N蛋白的非复制型重组腺病毒的构建与鉴定

体外构建融合表达新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S1抗原与N抗原的复制缺陷型重组腺病毒疫苗,为深入开展该疫苗免疫原性的研究提供基础。利用Overlap PCR和同源重组方法构建插入SARS-CoV-2的S1-N基因的重组腺病毒质粒pKAd5-S1-N,通过琼脂糖凝胶电泳、多酶切、测序等方法鉴定重组质粒正确性;重组质粒转染HEK293A细胞获得病毒毒种AdV5-S1-N并扩增,氯化铯密度梯度离心法纯化病毒,有限稀释分析法测病毒滴度,Western blot方法验证AdV5-S1-N重组腺病毒S1-N融合蛋白表达情况;将AdV5-S1-N疫苗通过肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,第14d采集颌下静脉血,ELISA法检测血清针对S1和N蛋白抗原的特异性抗体滴度。成功获得滴度为9.45×10¹¹IU/mL的重组腺病毒AdV5-S1-N。Western blot结果发现：AdV5-S1-N感染细胞后,融合蛋白可正常表达,与抗S1蛋白及抗N蛋白抗体均有特异结合。ELISA结果显示免疫重组腺病毒的小鼠可产生针对S1和N蛋白的特异性IgG抗体。应用复制缺陷型腺病毒载体成功获得...