添加扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法

通过构建人工扩增内标,建立可以有效指示沙门氏菌检测过程可能出现假阴性情况的PCR检测方法。本研究基于沙门氏菌invA基因设计特异性引物,复合法构建扩增内标,建立PCR检测体系。特异性引物LW,对33株沙门氏菌和6株非沙门氏菌标准株进行检测,结果显示,所有沙门氏菌均扩增出385 bp的目标片段,非沙门氏菌则只能扩增出484 bp的扩增内标片段,特异性良好。灵敏度实验表明,该检测体系的灵敏度可达6.35 fg/μL。人工污染实验表明,起始染菌量为3.2 CFU/25 mL时,仅需8h增菌培养便可检出。大量食品样品检测证明,该检测体系确实可以有效的避免PCR检测过程出现的假阴性,提高检测准确性。     

环介导等温扩增技术快速检测肉中沙门氏菌

应用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）建立了一种快速、高效、灵敏的肉中沙门氏菌的检测方法。针对沙门氏菌的属特异性基因invA设计2对引物,对人工污染肉样以及实际肉样分别进行检测。结果表明：所建立的LAMP反应能够特异性的检测沙门氏菌,对沙门氏菌纯菌的检测灵敏度为普通PCR的100倍,可达到9.8×100CFU/mL。LAMP检测人工污染沙门氏菌肉样的检测限为9.8×101CFU/mL。因此,本实验利用LAMP建立的沙门氏菌检测方法具有快速、灵敏、特异、操作简便的特点,具有广泛发展前景。     

环介导等温扩增技术快速检测肉中单增李斯特菌

通过建立的环介导恒温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP）方法以达到肉中单增李斯特菌快速、灵敏的检出。以特异性的hlyA毒力基因作为靶基因,与6株非单增李斯特菌进行特异性试验,同时对不同培养浓度的单增李斯特菌进行了LAMP和PCR方法的灵敏度比较,进而应用LAMP法检测人工污染肉中的单增李斯特菌。结果表明：纯培养物中单增李斯特菌LAMP检出限为8.8×100CFU/mL,其灵敏度比普通PCR高100倍;在人工污染肉中单增李斯特菌的检出限为8.8×101CFU/mL,在1h内即可完成扩增反应。LAMP方法具备快速、特异、简单、灵敏度高等优势,在食品基质中单增李斯特菌的检测方面具有较好的应用前景。     

食品中沙门氏菌分子检测靶点的筛选与评价

[目的]发掘新的沙门氏菌分子检测靶点,筛选检测性能优秀的引物.[方法]利用BLAST程序比较沙门氏菌属内基因组DNA序列的同源性以及沙门氏菌与非沙门氏菌基因组DNA序列之间的特异性,发掘出100多个检测沙门氏菌属的特异性片段,并从中随机挑选出15个片段作为候选靶点,一共设计了27对引物(FS1～FS27),对它们的特异性、灵敏度加以评价,从中筛选检测性能最好的引物.[结果]在27对引物中,检测性能最优的引物为FS23,采用该引物对供试菌株的相应检测靶点进行PCR扩增,44株沙门氏菌都能扩增到一条492 bp特异性片段,而22株非沙门氏菌则不能扩增出这一特异性片段.以FS23为引物建立PCR方法检测猪霍乱沙门氏菌基因组DNA的灵敏度为11.9 fg/μL,细菌纯培养物灵敏度为4.9×102cfu/mL;用猪霍乱沙门氏菌人工污染牛奶样品,如果接种起始菌量为100 cfu/25 mL时,只需要增菌5 h,采用上述方法即能检测出沙门氏菌.[结论]引物FS23对应的基因序列是一个性能优良的新分子检测靶点,具备很高的特异性和灵敏性,能够广泛应用于食品中沙门氏菌的快速检测.     

可视化和实时荧光环介导恒温扩增技术快速检测原料乳中的沙门氏菌

【背景】原料乳质量控制是乳制品生产流程中的关键环节,沙门氏菌是污染原料乳的主要致病菌之一。随着生物检测技术的不断发展,建立用于快速检测原料乳中沙门氏菌的实用型方法具有重要意义。【目的】评价可视化环介导恒温扩增技术(visual loop-mediated isothermal amplification,V-LAMP)和实时荧光环介导恒温扩增技术(real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification,RF-LAMP)方法快速检测原料乳中沙门氏菌的实效性。【方法】建立沙门氏菌LAMP反应体系和反应条件,对比V-LAMP和RF-LAMP两种方法的特异性、灵敏度、稳定性及其应用于实际样品检测的效用。【结果】采用V-LAMP和RF-LAMP方法检测沙门氏菌标准菌株,其结果均为阳性,检测非沙门氏菌标准菌株其结果均为阴性;该两种方法的检出限为13 CFU/mL,检测重复率均为100%;经检测10份人工污染样品,该两种方法的检测结果与实际结果高度一致;经检测73份实际样品,相对于标准方法,该两种方法其相对特异性分别为94.12%和92.65%,相对敏感度分别为100%和100%,相对准确率分别为94.52%和93.15%,一致性χ2值分别为2.25和3.20,与标准方法无明显差异(P>0.05)。【结论】V-LAMP和RF-LAMP方法检测特异性好、灵敏度高、稳定性好,适用于原料乳中沙门氏菌的快速检测。     

变性高效液相色谱检测沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌

应用多重PCR 反应(multiplex PCR,mPCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测方法.以编码沙门氏菌的fimY基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基因和编码肠出血性大肠杆菌O157:H7的rfbE基因为靶基因,选择3对引物,建立并优化了快速鉴别沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的多重PCR体系,扩增产物分别为284、159和499 bp,并验证了该多重PCR具有特异性.沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7标准菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测.试验结果表明该方法有很好的特异性,且灵敏度高,检测限可达到:沙门氏菌1.5 CFU/ml、空肠弯曲菌15 CFU/ml、肠出血性大肠杆菌O157:H7 15 CFU/ml.在随机采集的226份冷冻鸡肉类样品中,检出了7份样品为沙门氏菌阳性、10份为空肠弯曲菌阳性、1份为肠出血性大肠杆菌O157:H7阳性.研究建立的多重PCR-DHPLC方法可特异、灵敏地实现对沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测.     

肉类中大肠杆菌O157:H7多重PCR检测方法的建立

以编码大肠杆菌O157抗原的rfbE基因、 编码H7抗原的fliC基因以及编码毒力因子的eaeA基因为靶基因, 选择3对引物, 建立并优化了检测大肠杆菌O157:H7的多重PCR体系, 扩增产物分别为291 bp、625 bp、368 bp, 采用30株细菌验证了该多重PCR具有特异性。PCR检测的灵敏度在DNA水平上达到91.35 pg; 在存在干扰菌鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella?typhimurium)的情况下, 当起始污染量为1.4 CFU/mL时, 37 ℃培养6 h 即可检出。在30份肉类样品中, 有3份检出了大肠杆菌O157:H7。本研究建立的多重PCR方法可特异、灵敏地实现对大肠杆菌O157:H7的检测。     

用荧光标记O-I噬菌体快速检测食品源沙门氏菌

[目的]利用O-I噬菌体几乎可裂解沙门氏菌属细菌的特性建立快速检测食品中沙门氏菌的方法.[方法]用核酸荧光染料SYBR gold染料标记O-I噬菌体侵染100株试验菌及120份食品样品菌,荧光显微镜鉴定沙门氏菌;并测灵敏度.[结果]100株试验菌中40株沙门氏菌可见杆状荧光,而10株变形杆菌、20株志贺氏菌、20株大肠杆菌和10株葡萄球菌均无荧光;沙门氏菌检测灵敏度达10 CFU/100 μL;120份食品样品中沙门氏菌的O-I噬菌体检测与生化鉴定结果的阳性率分别为9.17%和10%,符合率为91.7%.[结论]试验表明用荧光标记的O-I噬菌体可以快速、直观、准确、大量地检测食品中沙门氏菌.     

多重PCR-DHPLC快速检测食品中产志贺毒素大肠杆菌

应用多重PCR(motiplex PCR)结合变性高效液相色谱技术(denaturing high-performanceliquid chromatography,DHPLC)建立了快速检测食品中产志贺毒素大肠杆菌O111和O157的方法.以基因wzxO111、rfbEO157为靶基因,建立多重PCR-DHPLC方法,进行特异性和灵敏度测试,同时进行RT-PCR检测比较灵敏度.该方法具有良好特异性,可以一次PCR扩增同时检测O111、O157;灵敏度达到25 CFU/mL.129份牛肉样品中检出1例O111,3例O157阳性;74份鸡肉样品中检测出O111、O157阳性各1例,67份蔬菜样品中未检测到O111、O157.本文建立O111、O157多重PCR-DHPLC检测方法,操作简便,特异性强,适用于产志贺毒素大肠杆菌筛选检测.     

DNA环介导恒温扩增技术快速检测霍乱弧菌

霍乱弧菌是一种重要的食源性致病菌,主要引起急性肠道传染病,其快速检测具有重要意义。根据霍乱弧菌的mdh管家基因序列,设计2对特异性检测引物,利用DNA环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),经反应体系优化,成功建立了霍乱弧菌的LAMP快速检测方法。该方法最佳反应温度为65℃,60min完成检测,对培养菌的检测限为25CFU/mL,污染食品中霍乱弧菌的检测限为32CFU/g。对33株同种或近源细菌进行LAMP检测,仅霍乱弧菌得到阳性扩增。LAMP方法实践应用结果表明,对1057份虾、蟹、牡蛎、肉类、人腹泻物等样本进行检测,共检出85份阳性,与国际标准(ISO TS21872-1-2007)检测结果的符合率为100%。结果表明,本研究建立的霍乱弧菌LAMP检测方法特异性强、灵敏度高、操作简便,有利于霍乱弧菌疫情的监测。     

添加有扩增内标的沙门氏菌荧光定量PCR 检测体系的建立与评价

【目的】建立添加有扩增内标(IAC,Internal amplification control)的沙门氏菌EvaGreen荧光定量PCR检测体系,提高PCR检测可靠性。【方法】通过比较已有沙门氏菌属细菌的基因组序列,筛选沙门氏菌属特异检测靶点,设计特异引物;再用复合引物法构建扩增内标,优化参数,建立沙门氏菌内标PCR检测体系,利用特异性和灵敏度实验评价体系的检测性能。【结果】筛选得到的新特异靶点基因编码III型分泌系统蛋白(ssaQ)。针对该基因设计特异引物(SsaQ6),建立了添加有扩增内标的常规PCR和EvaGreen荧光定量PCR检测体系;二者对151株沙门氏菌和34株非沙门氏菌的检测符合率均达100%,对基因组DNA的检测下限达14.9拷贝/PCR和2.76拷贝/PCR;人工污染牛奶样品(初始染菌量:4-6 cfu/10 mL),増菌10 h和8 h后分别可检出沙门氏菌。【结论】本研究发掘的新靶点基因ssaQ特异性强,基于这一新靶点建立的添加有扩增内标的EvaGreen荧光定量PCR比常规内标PCR的检测限更低,重复性更好,快速方便,在12 h内即可得出检测结果,并且定量准确,有利于推进沙门氏菌PCR检测方法的标准化应用。     

大鼠冠状病毒和仙台病毒的双重PCR检测方法的建立与应用

目的建立快速检测实验大鼠冠状病毒和仙台病毒的双重PCR方法。方法根据大鼠冠状病毒N基因、仙台病毒L基因设计特异性引物;经过双重PCR优化,特异性和敏感性的检测,建立双重PCR体系。应用该PCR体系检测人工感染仙台病毒组织DNA样本和实验动物组织样本,并与ELISA方法比对。结果双重PCR扩增出大鼠冠状病毒(168 bp)和仙台病毒(262 bp)目的条带,PCR扩增产物测序结果利用核酸BLAST功能进行同源序列对比,仙台病毒和大鼠冠状病毒同源性分别为100%和99%。仙台病毒和大鼠冠状病毒的检测下限为1.56×10~2 copies/μL。特异性检测对小鼠肝炎病毒扩增,产生片段大小近似大鼠冠状病毒产物。应用建立的双重PCR体系检测人工感染仙台病毒组织DNA样本,30份DNA标本均被检出;检测94份实验动物肺组织样本,结果均阴性。结论建立的双重PCR方法操作简单、快速、特异性强、灵敏度高,能够实现对实验动物仙台病毒和大鼠冠状病毒病原体的快速检测。     

水产品中创伤弧菌DNA环介导恒温扩增快速检测方法的建立及初步应用

创伤弧菌是一种重要的食源性致病菌,主要存在于河口和海洋环境中,严重危害水产养殖业的发展和人类健康。建立快速、准确、易操作的检测方法对防控创伤弧菌的传染,保障水产养殖业发展和增强食品安全意义重大。基于创伤弧菌vvHA基因,利用一种新型的核酸扩增技术-环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立了创伤弧菌LAMP快速检测方法。对11种共46株细菌进行扩增,仅创伤弧菌为LAMP阳性结果,说明LAMP方法具有高度特异性。灵敏度试验结果表明,对创伤弧菌纯培养菌的检测灵敏度为15CFU/ml,对污染食品中创伤弧菌的检测灵敏度为24CFU/g。此法40~60min内即可完成检测,检验检疫实践证明:LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高且成本低廉,具有良好的应用前景。     

环介导等温扩增技术在食品中痢疾志贺氏菌快速检测

【目的】探讨、优化基于环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测常规食品中感染性痢疾志贺氏菌的方法。【方法】在NCBI数据库中搜索获取志贺氏菌的特异性基因高度保守区,设计3对LAMP反应引物,建立、优化该LAMP可视化检测方法,并评价其特异性、灵敏度,同时与PCR检测方法和传统检测方法对比,进行结果统计分析。【结果】5株志贺氏菌标准菌株样品均检测为阳性,11株非志贺氏菌标准菌株样品均检测为阴性,无交叉反应。最低检验限为1.6×101 CFU/反应(或1.6×101 CFU/m L),且经比较,LAMP检测灵敏度比PCR检测高出1个数量级。通过对161份实际样品和人工污染样品进行检测,LAMP检测与传统方法检测结果具有较高的一致性。【结论】LAMP具有检测过程快速简便、检测结果稳定、可靠的特点,适用于对常规食品中感染性痢疾志贺氏菌的高效、快速检测需求。     

扩增内标在沙门氏菌PCR检测方法中的应用

在PCR反应体系中添加了一条人工构建的扩增内标片段,以指示沙门氏菌PCR快速检测中出现的假阴性。对9株沙门氏菌和15株非沙门氏菌进行PCR检测,结果显示所有沙门氏菌都能扩增到一条invA基因中的374bp特异性片段,而模板来源于非沙门氏菌时则只能扩增到一条513bp扩增内标片段。灵敏度试验显示,该PCR检测体系对猪霍乱沙门氏菌纯DNA模板的检测灵敏度为12．8fg／μL,如果将增菌时间确定为8h,则该检测体系对人工染菌牛乳中沙门氏菌的检测灵敏度可以达到起始浓度为8cfu／25mL。采用上述方法检测了80份污染严重的样品,证实此方法可以有效地排除假阴性,提高检测准确率。     

环介导恒温扩增法检测肺炎链球菌的研究

目的 建立环介导恒温扩增(LAMP)检测肺炎链球菌的方法.方法 用LAMP技术扩增肺炎链球菌菌株,并应用50例临床标本采用传统培养法、PCR法、LAMP法进行检测,比较3种方法的检出率,同时检测方法特异性和灵敏度.结果 所测肺炎链球菌均获扩增产物,对其他非肺炎链球菌无交叉反应.LAMP检测灵敏度可达102 CFU/mL.50例临床标本使用LAMP法检出9例肺炎链球菌阳性(18.0％),使用传统培养法检出阳性4例(8.0％).结论 LAMP法较传统培养检测方法特异性强、灵敏度高、操作方便、快速,适合临床标本的肺炎链球菌检测.     

基因芯片技术检测3种肠道病原微生物方法的建立

目的:建立一种运用多重PCR和基因芯片技术检测和鉴定伤寒沙门氏菌、痢疾杆菌和单核细胞增生利斯特菌的方法。方法:分别选取伤寒沙门氏菌染色体ViaB区域中编码调控Vi抗原表达的基因(vipR)、痢疾杆菌编码侵袭质粒抗原H基因(ipaH)和单核细胞增生利斯特菌溶血素基因(hlyA)设计引物和探针,探针3'端进行氨基修饰,下游引物标记荧光素Cy3。在优化的PCR和杂交反应条件下,进行三重PCR扩增,产物与包括3种致病菌特异性探针的基因芯片杂交。在评价基因芯片的特异性和灵敏度之后,对临床样本进行检测。结果:只有3种目的致病菌的PCR产物在相应探针位置出现特异性信号,其他阴性细菌均无信号出现;3种致病菌的检测灵敏度均可达到103CFU/mL;检测30例临床样本的结果与常规细菌学培养结果一致。结论:所建立的可同时检测伤寒沙门氏菌、痢疾杆菌和单核细胞增生利斯特菌的基因芯片方法快速、准确,特异性高,重复性好,为3种肠道致病菌的快速检测和鉴定提供了新方法和新思路。     

变性高效液相色谱检测食品中致泻性大肠杆菌

[目的]应用多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中致泻性大肠杆菌的快速检测方法.[方法]分别根据4种致泻性大肠杆菌的特异性毒力因子基因序列设计引物,PCR扩增产物经变性高效液相色谱进行快速检测.以肠产毒性大肠杆菌等32株试验菌株做特异性检测;4种致泻性大肠杆菌标准菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测.[结果]试验结果表明该方法有很好的特异性,且灵敏度高,检测限可达到:肠产毒性大肠杆菌27 CFU/mL、肠致病性大肠杆菌33 CFU/mL、肠出血性大肠杆菌25 CFU/mL、肠侵袭性大肠杆菌42 CFU/mL.[结论]该方法可以快速、准确地检测食品中的致泻性大肠杆菌,是食品中病原菌检测的新技术和新方法.     

基因芯片技术检测3种食源性致病微生物方法的建立

建立一种运用多重PCR和基因芯片技术检测和鉴定志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157的方法, 为3种食源性致病菌的快速检测和鉴定提供了准确、快速、灵敏的方法。分别选取编码志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)、沙门氏菌肠毒素(stn)基因和致泻性大肠杆菌O157志贺样毒素(slt)基因设计引物和探针, 进行三重PCR扩增, 产物与含特异性探针的芯片杂交。对7种细菌共26株菌进行芯片检测, 仅3种菌得到阳性扩增结果, 证明此方法具有很高的特异性。3种致病菌基因组DNA和细菌纯培养物的检测灵敏度约为8 pg。对模拟食品样品进行直接检测, 结果与常规细菌学培养结果一致, 检测限为50 CFU/mL。结果表明：所建立的基因芯片检测方法特异性好, 灵敏度高, 为食源性致病菌的检测提供了理想手段, 有良好的应用前景。