氢气生物学作用的生物酶基础

氢气具有广泛的生物学功能,近年来逐渐引起广泛关注。但是氢气发挥生物学作用的机理一直都有争论,制约了氢生物学的进一步发展。现在被广泛接受的是氢气选择性与毒性自由基反应的理论,但是生理条件下氢气与自由基直接反应的证据并不充分,多数属于间接证据,无法区分氢气是与自由基直接反应还是影响了自由基的产生。氢气具有抗氧化作用,本团队研究表明,氢气不是在自由基产生之后去清除,而是减少自由基的产生,类似于在自由基产生之初就关上“开关”;氢气可以提高包括线粒体复合物Ⅰ、乙酰胆碱酯酶、HRP在内的生物酶的活性,可以影响线粒体膜电位和调节神经细胞膜电位,细胞膜的氧化还原酶类及离子通道等都受到氢气的调节,这表明氢气的作用可能是多靶点的主要基于酶学反应的过程,高等生物具有产生和利用氢气的氢化酶活性。主要探讨了氢气和自由基的关系以及氢气作用的生物酶学基础,以期为揭示氢气发挥生物学作用的机理提供参考。     

辣根过氧化物酶的热稳定剂

保持酶的天然状态和高催化特性具有重要的意义。本研究筛选了辣根过氧化物酶(HRP)的稳定剂并研究了其作用机制。结果发现硫酸镁和明胶能够显著提高HRP的热稳定性,并且两者具有协同作用。在硫酸镁和明胶组成的酶稳定剂存在的条件下,HRP在50oC保温80h后仍能保持89%的活性,常温下存放90d后可保持57%的活性,而未加稳定剂的对照样品中HRP的残留活性分别为6%和小于1%。通过对HRP的Soret带吸收光谱,色氨酸内源荧光,ANS荧光进行分析,揭示酶稳定剂可以明显降低在加热条件下HRP的变性程度,从而维持较为稳定的天然构象。     

色氨酸残基在内切葡聚糖酶分子中的作用

内切葡聚糖酶的化学修饰研究表明：色氨酸残基可能位于活性位点,与底物结合有关．荧光光谱测定指出该酶的荧光几乎都来自色氨酸残基,酶分子中色氨酸微环境对ｐＨ变化非常敏感,降低ｐＨ导致了酶分子构象发生了较大变化,配基结合使酶分子色氨酸微环境产生了改变,引发了与ｐＨ诱导不同的构象变化．     

氨基酸修饰及荧光光谱分析研究黄花石蒜凝集素生物学活性与构象的关系

本文通过对黄花石蒜凝集素(Lycoris aurea Agglutinin,LAA)进行特殊氨基酸的化学修饰,显示一个LAA分子一共有8个色氨酸分子,其中有3个位于分子表面或近表面,Trp、Tyr和Ser/Thr不是LAA凝集活性所必需的氨基酸,而Asp/Glu的羧基和凝血活性密切相关,对其修饰后导致凝血活性丧失50%.通过荧光淬灭的方法对LAA分子中色氨酸所处微环境进行了研究.结果显示中性淬灭剂丙烯酰胺对LAA分子中色氨酸的淬灭作用最强可以淬灭100%的色氨酸荧光,其次是离子型淬灭剂碘化钾,能淬灭62.9%的色氨酸荧光,而氯化铯对LAA色氨酸的淬灭最弱,几乎不能淬灭LAA的荧光.     

八角茴香提取物对长角扁谷盗成虫的熏蒸作用及其酶活性的影响

为探索八角茴香的杀虫活性及其作用机理,采用密闭容器熏蒸法测定八角茴香干果的甲醇、乙酸乙酯、石油醚3种溶剂提取物对长角扁谷盗成虫的杀虫活性,及其对试虫体内乙酰胆碱酯酶(AChE)和谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)活性的影响。结果表明:3种提取物对试虫均有较强的熏杀活性,熏杀效果随着处理剂量的提高和处理时间的延长而增强,熏蒸72 h后,20.0 mg/L甲醇、乙酸乙酯、石油醚提取物对试虫的校正死亡率分别为89.93%、96.71%和91.56%,LD50分别为7.16、4.57、5.42 mg/L,以乙酸乙酯提取物的熏杀效果最好。3种提取物对试虫体内的AChE、GSTs活性均表现出明显的剂量效应和较强的时间效应,随着处理剂量的升高,对2种酶活力多数表现为抑制作用增强,而低剂量(1.25 mg/L)的甲醇提取物对AChE具有一定的诱导作用;乙酸乙酯、石油醚提取物在48 h而甲醇提取物在60 h对AChE、GSTs活性抑制作用最强;3种溶剂提取物对AChE、GSTs活性的抑制作用大小均表现为乙酸乙酯>石油醚>甲醇。提取物对酶活性的抑制作用与熏杀效果整体呈正相关,说明AChE、GSTs活性下降可能是造成试虫死亡的重要原因之一。因此,八角茴香具有潜在的杀虫应用研究价值。     

葡萄糖淀粉酶色氨酸残基及底物结合位点的研究

 本文用N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)对葡萄糖淀粉酶进行特异性修饰,当酶分子表面有3个色氨酸残基被修饰后,酶活力完全丧失。用邹氏图解法测得酶活性中心有一个色氨酸残基是必需的。如果在酶液中加入不同的底物再用NBS氧化,用荧光发射和荧光猝灭光谱检测表明,底物对酶分子有不同程度的保护作用。在被测试的三种底物中,这种保护能力依为糊精>淀粉>麦芽糖。     

崭露头角的氢气生物学

氢气（hydrogen gas,H₂）是新发现的生物气体信号分子。自2007年开始,有关H₂的生理调控活性及信号转导功能受到广泛的关注,并逐步形成了研究氢气生物学效应和分子机理的一门新学科--氢气生物学。按照实际运用范围的不同,氢气生物学也可以划分为氢医学和氢农学。在医学方面,通过多种动物模型研究和部分临床试验,发现H2具有抗氧化、抗炎和抗凋亡的作用,而且H₂对缺血/再灌注以及以炎症为基础的急性组织缺血性疾病和慢性退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病和动脉粥样硬化等氧化应激相关疾病）均具有较为理想的正面效果。在农学方面,相关报道还发现H₂可以提高苜蓿、水稻和拟南芥对非生物胁迫的耐性,调控黄瓜、番茄、猕猴桃、芽苗菜、黑大麦和食用菌的生长发育和营养品质,延长洋桔梗、玫瑰和百合切花的保鲜以及提高家畜对病原微生物的抗性。本文首先探究了氢气生物学的发展历史,提出氢医学研究思路的源头是电解水,结合H₂测定方法、内源H₂的产生途径以及氢气生物学效应的分子机理和信号转导的研究成果,从给氢方式、生物学效应以及安全性等方面,介绍了氢医学和氢农学的现状,提出选择性抗氧化机制不能完全解释现有的氢生物学效应,反映相关分子机制的复杂性和多样性。最后,针对氢气生物学的若干重要的科学和实践问题进行了展望,并提出氢医学的进一步发展还依赖于大量且可信度高的临床试验,氢农业还需要完成多年多点的大规模大田实践。     

基于中草药活性成分的GSK-3β抑制剂的分子模拟

使用分子对接和分子动力学方法,研究了一类中草药活性成分抑制糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的机理。结果表明:筛选出的芦丁、杨酶酮、二氢丹参酮I和人参皂苷Rb1能够与GSK-3β良好地结合,其中芦丁、杨酶酮和二氢丹参酮I主要结合于GSK-3β的ATP结合口袋区域,人参皂苷Rb1主要结合于GSK-3β的T-loop区域,配体和蛋白之间形成的氢键的数目和存活率是影响结合能力的主要因素,氢键的形成主要取决于配体中的含氧和含氮基团。基于这些有效成分进行结构设计可能获得GSK-3β的高效抑制剂。     

基于中草药活性成分的GSK-3β抑制剂的分子模拟北大核心CSCD

使用分子对接和分子动力学方法,研究了一类中草药活性成分抑制糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的机理。结果表明:筛选出的芦丁、杨酶酮、二氢丹参酮I和人参皂苷Rb1能够与GSK-3β良好地结合,其中芦丁、杨酶酮和二氢丹参酮I主要结合于GSK-3β的ATP结合口袋区域,人参皂苷Rb1主要结合于GSK-3β的T-loop区域,配体和蛋白之间形成的氢键的数目和存活率是影响结合能力的主要因素,氢键的形成主要取决于配体中的含氧和含氮基团。基于这些有效成分进行结构设计可能获得GSK-3β的高效抑制剂。     

洛美沙星对Bloom综合征解旋酶生物学特性影响的机理研究

Bloom综合征解旋酶(BLM)是RecQ家族DNA解旋酶中的一个重要成员,参与了DNA复制、修复、转录、重组以及端粒的维持等细胞代谢过程,在维持染色体的稳定性中具有重要作用.BLM解旋酶的突变可导致Bloom综合征.Bloom综合征是一种罕见隐性常染色体遗传疾病,患者遗传不稳定,并易患多种类型癌症.洛美沙星(LMX)可以抑制细胞内多种酶,并通过结合DNA干扰DNA代谢,从而治疗多种疾病,但是其具体的作用机理还未完全清楚.运用荧光偏振技术和自由磷检测技术,研究了LMX对BLM642～1290解旋酶DNA结合活性、解链活性和ATP酶活性的影响.运用荧光及紫外吸收光谱法研究了LMX与解旋酶结合的结合常数、结合位点数、作用力类型、结合距离等参数.结果表明,LMX与解旋酶之间能自发进行反应,两种分子有一个结合位点,通过静电引力和疏水作用力形成稳定的BLM-LMX复合物,且解旋酶的内源荧光被LMX静态猝灭,主要原因是非辐射能量转移.在这一过程中,LMX能抑制解旋酶的解链活性和ATP酶活性,而促进解旋酶的DNA结合活性.LMX对BLM解旋酶生物学活性影响的机理可能是LMX使解旋酶通过别构机制影响其ATP酶活性,并使酶的构象维持在较低解链活性的状态,通过抑制ATP催化水解与解链过程的偶联和阻止解旋酶的易位,从而抑制其解链.LMX能够促进解旋酶的DNA结合活性,可能是因为其C-6和C-7上的取代功能基团可以增加酶活力,以及增强药物、酶和DNA的结合,从而形成药物-酶-DNA复合物.这些结果为研究以DNA解旋酶为药物靶标的分子机理和理解喹诺酮类药物的作用机理奠定相关理论基础.     

荧光光谱法定量测定纤维素酶活性架构中单个氨基酸突变对底物结合力的影响

纤维素酶活性架构是酶分子中多个氨基酸残基构成的可结合并催化底物的功能区,其中色氨酸等芳香族残基在该区域中起着重要作用.本研究利用荧光光谱法,定量分析了纤维素酶Ch Cel5A活性架构中色氨酸与底物的结合动力学过程,通过色氨酸荧光猝灭的定量分析,确定了色氨酸特异性结合时的底物浓度范围,并且测定了Ch Cel5A活性架构中单个氨基酸突变导致的底物结合常数的变化,与催化动力学参数比较发现,荧光光谱法可准确表征纤维素酶与底物的结合力及其单个残基突变引起动力学参数的变化.此外,由于p NP中含有强的吸电子基团,因而以p NPC等为配体时会高估与色氨酸的结合常数约20~100倍.荧光光谱法可以测定纤维素酶结合糖分子底物的动力学参数,该方法具有灵敏和快速的特点,这为蛋白质与底物之间相互作用的定量分析提供了新的视角.     

藻蓝蛋白裂合酶CpeS色氨酸定点诱变及体内重组功能研究

为了研究藻蓝蛋白β亚基Cys-84裂合酶CpeS结构与功能的关系以及色氨酸残基对于该酶功能的影响,构建了藻蓝蛋白β亚基Cys-84裂合酶CpeS的两个色氨酸突变体,分别为CpeS（W14I）和CpeS（W75S）。通过体内重组检测酶活性的变化,研究色氨酸残基的突变对裂合酶催化活性的影响。重组结果显示：突变体CpeS（W14I）的催化活性几乎完全丧失,为野生型的8％;突变体CpeS（W75S）的催化活性为野生型的76％。由此推测,第14位色氨酸可能是CpeS酶活性的必需氨基酸,其所处的位置可能是裂合酶CpeS的活性位点。     

血红素蛋白疏水性的毫微秒荧光的研究

应用毫微秒荧光技术结合荧光探针方法研究牛血红蛋白、豆血红蛋白和辣根过氧化物酶同功酶等血红素蛋白辅基结合区域的疏水特性和构象变化,过氧化物酶活性中心的疏水性,构象变化和活性的关系.     

酶切菌紫质C端引起的紫膜蛋白的发光性质变化

用木瓜蛋白酶切去bRC端尾巴约20—25个氨基酸之后发现:在KCl盐浓度作用下,其蛋白荧光光谱中的色氨酸荧光成份有明显的增强;用Cs~ 对bR蛋白荧光的猝灭实验表明此色氨酸荧光成份的增加是由于在KCl作用下bR中某些色氨酸残基暴露的结果;磷光光谱实验表明在KCl作用下色氨酸磷光的增加也是由于色氨酸残基暴露的结果。本文讨论了这种构象变化可能影响正常bR分子中菌蛋白光循环的进行,从而使质子泵效率降低;并且此构象变化可能与其C端尾巴的构象有关。     

基于网络药理学和分子对接探索桑白皮治疗糖尿病周围神经病变的潜在机制

本研究运用网络药理学和分子对接方法对中药桑白皮治疗糖尿病周围神经病变(DPN)的活性成分、潜在作用靶点和信号通路进行研究,探索桑白皮治疗DPN的可能作用机制。首先从中药系统药理学数据库(TCMSP)筛选出桑白皮的活性成分及靶点基因。通过GeneCards数据库及OMIM数据库筛选出DPN的疾病靶点基因,并用Cytoscape软件构建"药物-有效成分-靶基因-疾病"中药调控网络图。将有效成分靶标与疾病靶标上传到STRING数据库,构建蛋白互作网络图(PPI),并使用R语言对得到的PPI进行核心基因的筛选。运用R语言对关键靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。其次从活性成分及靶点基因中根据degree值筛选出前3个关键成分,并将该网络中的基因靶点以degree值高低进行排序,选择前3个核心靶点,然后从RCSB数据库下载相关蛋白的结构,使用Pymol软件去除溶剂分子与配体,使用AutoDock软件进行分子对接。最后通过酶联免疫吸附实验和荧光光谱实验验证网络药理学富集分析的结果。最终预测到31个桑白皮活性成分,312个活性成分相关靶点,120个桑白皮-糖尿病周围神经病变共同有效靶点。活性...     

节肢动物毒素研究进展

节肢动物（arthropod）是动物界中种类数量最多、分布范围最广的类群,现存110万~120万种。节肢动物毒素具有较强的生物学活性及独特的作用机制,其毒素分子能够作用于离子通道、细胞膜、受体和酶等靶点,影响神经、循环、免疫、肌肉等系统,从而进行快速、高效的捕食和防御。本文总结了有毒节肢动物毒素的来源、成分及作用靶点等信息,重点综述了毒素作用机制的分子基础,以及毒素参与的捕食、防御和趋避等生物学作用。     

芹菜素抑制α-葡萄糖苷酶的分子机制研究

[目的]分析芹菜素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型,并探讨其抑制的分子作用机制。[方法]采用Lineweaver-Burk双倒数方程,分析芹菜素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型;荧光光谱和分子对接阐述芹菜素抑制α-葡萄糖苷酶的分子作用机制。[结果]芹菜素对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为竞争型抑制,抑制常数Ki=12.08μg/m L。芹菜素和α-葡萄糖苷酶的结合导致酶分子的内在荧光静态猝灭,不同温度(298 K、304 K、310 K)条件下荧光猝灭常数KA分别为0.859 4×104、0.617 7×104、0.486 5×104L/mol。酶分子中Tyr158、Ser240、Pro312、Phe314和Asn415等氨基酸残基为芹菜素与其结合的重要活性位点,芹菜素的A环5-OH和7-OH、B环4'-OH结构对其抑制活性起到关键作用。[结论]芹菜素是α-葡萄糖苷酶的竞争性抑制剂,疏水作用力和氢键是其与酶分子间的主要作用力。     

氢酶与固氮酶在细菌光合固氮中的联系

研究了混养型光合细菌Rhodopseudomonas capsulata N-3 氢酶与固氮酶之间的联系,观察到:1.以苹果酸(30毫克分子)为碳源,谷氨酸(5毫克分子)为氮源,营光合异养生长的菌体由固氮酶催化释放出大量的分子氢,光合放氢的过程完全依赖于光和外加电子供体,NH_4~ 对这一过程有明显抑制作用。2.营光合异养生长的光合细菌具活跃的氢酶,是膜结合态,能以多种生理活性物质,如NADP,反丁烯二酸,硝酸盐,氧及一些氧化还原染料为受体,吸取分子氢,这一过程显著地被NH_4~ 所促进。3.氢酶催化分子氢,支持光合固氮活性,这一固氮活性对氧的酶感性显著下降。4.当有机底物浓度不足时,分子氢所支持的固氮活性更为有效,有机底物浓度处于过量时,分子氢不再支持固氮。5.乙炔对氢酶活性具不可逆的抑止作用,氢酶被抑止后,固氮酶所催化的光合放氢显著剧增。 基于上述结果,对氢酶和固氮酶在细菌光合固氮中相互联系及其对光合细菌光能异养和光能自养两种生长方式间的转换的可能作用进行了讨论。     

Epstein-Barr病毒潜伏蛋白1通过核转录因子κB诱导鼻咽上皮细胞表达端粒酶活性

利用已建立的原代人胚鼻咽上皮细胞和Tet-on-LMP1系统等良好的实验模型,采用荧光酶报道基因分析法和端粒酶TRAP-ELISA技术,分别检测EB病毒潜伏蛋白1(LMP1)诱导的核转录因子κB(NFκB)活性和端粒酶活性,从LMP1介导NFκB信号传导途径角度,探讨LMP1诱导端粒酶表达的分子机制.结果表明,LMP1可诱导鼻咽上皮细胞表达端粒酶活性,将LMP1羧基端胞浆区突变后,可同时下调NFκB活性和端粒酶活性.在Doxycycline诱导LMP1表达状态下,NFκB反式激活活性增强,同时端粒酶活性升高;进一步应用硫代磷酸化修饰的反义NFκB p65寡脱氧核苷酸和IκBα的显性负性突变体分别阻断NFκB活性,可降低由LMP1诱导的端粒酶活性.因此,NFκB作为LMP1信号传导途径上的枢纽,可能介导了LMP1对端粒酶的表达调控.     

荚膜红假单孢菌(Rhodopseudomonas capsulata)氢酶性质的初步研究

荚膜红假单孢菌(Rhodopseudomonas capsulata F.)含有可溶性和膜结合态两种状态的氢酶,以膜结合态为主要存在形式,其活性占整个氢酶活性的65％左右,表面活性剂Triton X-100能把它从膜上溶解下来、两种状态的氢酶均具有催化吸氢和放氢活性,并在吸氢反应的最适pH值、电子受体,热稳定性等方面都是很相似,但吸氢活性远高于放氢活性。两种状态的氢酶对氧都较敏感,曝露于氧往往使活性钝化,钝化了的氢酶又可被氢再活化,不过可溶性氢酶曝氧时间较长(3天后),氢就不再使其活性恢复。温度和气相对两种状态氢酶活性的贮存也表现各异,氢气相下,可溶性氢酶在4℃最稳定,而膜结合态氢酶则为20℃。NaCl对膜结合态氢酶的吸氢活性具有抑制作用,NaCl=0.5M时,抑制其活性达60％左右。