辣椒疫霉PcCRN20-C蛋白的表达纯化及结晶 *

CRN(crinkling and necrosis-inducing protein)为疫霉菌在与寄主互作过程中分泌的一类特有胞质效应因子,干扰寄主细胞正常的生理代谢和功能。采用PCR法从辣椒疫霉LT1534菌株cDNA中克隆PcCRN20-C基因。该基因序列长783bp,编码261个氨基酸。构建重组表达载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。在优化条件下诱导表达重组蛋白,利用Ni-NTA金属螯合层析、离子交换层析、分子筛层析和胰蛋白酶酶解技术获得高纯目的蛋白,SDS-PAGE分析表明,蛋白质分子量约为25kDa。采用座滴气相扩散法进行晶体制备和筛选,成功获得了蛋白质晶体,并通过X-射线衍射仪收集了晶体衍射花样。结合蛋白质晶体学方法,获得了有衍射的辣椒疫霉PcCRN20-C蛋白晶体,为进一步研究CRN蛋白的结构与病原菌致病机制提供参考资料。     

辣椒疫霉质外体疏水小蛋白SCR82编码基因的转录特征、异源表达和功能

【目的】分析PcF/SCR质外体疏水小蛋白SCR82编码基因在辣椒疫霉生长发育和侵染寄主阶段的转录特征,克隆其cDNA和基因组全长序列,分析蛋白性状及其序列保守性,利用大肠杆菌表达并获得纯化蛋白,分析其生物学功能。【方法】提取辣椒疫霉菌丝、游动孢子囊、游动孢子、萌发休止孢和7个侵染时间点(1.5、3、6、12、24、36、72 h)的本氏烟根部总RNA,利用半定量RT-PCR分析scr82的转录表达水平;通过高保真PCR从萌发休止孢cDNA和基因组DNA中克隆出该基因全长序列;利用软件对SCR82进行生物信息学分析,挖掘其他物种中的同源序列,预测蛋白性状;将c DNA全长序列克隆到含6×His-SUMO序列的p ET28a(+)中,在不同温度(22、37°C)和IPTG浓度(0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L)组合条件下利用大肠杆菌Rossette 2菌株表达该蛋白,利用Ni~(2+)亲和层析柱纯化蛋白;将蛋白浸润本氏烟和拟南芥叶片,分析它是否引起植物细胞死亡,蛋白浸润12、24h后利用RT-qPCR分析本氏烟中3个抗性相关基因(NbMC1、NbSOD、NbPOX)的表达量变化。【结果】scr82基因在辣椒疫霉萌发休止孢和侵染寄主阶段上调表达;该基因为辣椒疫霉中单拷贝基因,不含内含子,开放阅读框为249 bp;预测其编码82个氨基酸,包含长度为21个氨基酸的信号肽序列和7个半胱氨酸但不含有任何已知功能域,蛋白疏水性强,二级结构主要为α-螺旋和不规则卷曲,在疫霉菌中保守;含重组质粒的菌株在22°C经0.2 mmol/L的IPTG诱导过夜(～16 h)产生大小约24 kDa的融合蛋白,纯化获得30 mg/mL的可溶性蛋白;融合蛋白不引起本氏烟和拟南芥叶片的细胞死亡,但导致本氏烟抗性相关基因均上调表达。【结论】本研究获得了辣椒疫霉胞外疏水小蛋白SCR82的原核表达蛋白,该蛋白不引起植物细胞死亡,但触发植物的防卫反应。     

孕烷X受体配体结合结构域蛋白晶体的X线衍射结构解析

目的:利用X线衍射技术解析孕烷X受体(PXR)配体结合结构域(LBD)蛋白晶体的3维结构。方法:对PXR蛋白LBD(130~434氨基酸残基)序列进行密码子优化并化学合成后克隆至pRSFDuet-1表达载体,再将载体导入大肠杆菌BL21(DE3),对PXR-LBD蛋白进行原核表达与分离纯化;采用晶体筛选试剂盒筛选蛋白结晶条件,采用悬滴法获得目标蛋白的晶体;对获得的蛋白晶体进行X线晶体衍射检测,并收集相关数据建立PXR-LBD的三维结构。结果:获得了PXR-LBD的高质量晶体并利用X线衍射解析了该蛋白质晶体的结构数据,使用Phenix.refine软件和COOT软件等对结构进行修正,最终获得了高分辨率的3维结构数据。结论:完成了孕烷X受体配体结合结构域蛋白晶体的X线衍射结构解析,为研究和开发PXR相关药物奠定了基础。     

灵芝免疫调节蛋白LZ-8的制备和晶体分析

LZ-8蛋白是从灵芝菌丝中分离到的真菌免疫调节蛋白,具有多种免疫调节功能,然而这一蛋白的作用机制尚不清楚。通过蛋白质晶体结构的解析,能够得到蛋白质空间结构特点,从而阐述蛋白质功能的机制。旨在得到LZ-8蛋白的晶体,并获得空间结构数据。以pET21a为表达载体,获得诱导表达的rLZ-8,通过亲和层析、分子筛凝胶层析和阴离子交换层析纯化,蛋白纯度在98%以上,采用悬滴气相扩散法得到蛋白晶体,并获得3.2?数据,为进一步对真菌免疫调节蛋白功能和结构的研究奠定了基础。     

土壤中辣椒疫霉分离方法的研究与量化测定

从杭州、西安、广州及武汉等辣椒病田分别采集土样 ,室内晾干研碎后 ,用选择性培养基 ,采用土壤稀释平板法和组织诱饵法分离辣椒疫霉 (PhytophthoracapsiciLeonian) ,并对土壤中辣椒疫霉的密度进行量化处理。结果表明 ,利用选择性燕麦培养基 ,采用土壤稀释平板法可分离获得大量的辣椒疫霉菌株 ,而且辣椒连作田的辣椒疫霉菌密度高于轮作田。组织诱饵法试验结果表明 ,辣椒叶片诱集效果最好 ,其次是辣椒果实。     

苎麻疫霉诱抗激发蛋白的纯化及其特性

苎麻疫霉(Phytophthora boehmeriae Saw．)在Plich’s培养液中产生的蛋白质用硫酸铵沉淀后,经DEAE—sepharose F.F.阴离子交换柱层析和HPLC层析,分离纯化出可诱发甜椒和三生烟产生过敏性坏死反应的激发蛋白(boehmedaein),经HPLC鉴定达到液相色谱纯,其分子量约为10.6kD,pI为4．32,氨基酸组成和N-末端20个氨基酸序列与已报道的elicitin蛋白具有广泛的同源性。诱导抗病性测定表明,bochmedacin可诱导非寄主三生烟和茄门甜椒产生过敏性坏死反应,并可诱导辣椒对疫病的抗性,其效果为30～40％。     

肺炎链球菌SP0306蛋白的表达纯化及结晶研究

SP0306蛋白是肺炎链球菌TIGR4菌株中的一种假想的转录因子,但其蛋白三维结构及生物学功能尚未明了,生物信息学分析提示其可能调控碳水化合物代谢相关基因的表达。成功构建了SP0306蛋白的全长表达载体PET28a-sp0306,利用大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行原核表达,获得了以可溶形式表达的目的蛋白。经Ni-NTA柱亲和层析及DEAE阴性离子交换层析纯化后,获得了高纯度的目的蛋白。采用悬滴气相扩散法获得了质量较好的SP0306蛋白晶体,并初步进行了晶体X射线衍射,为其最终的三维结构解析及生物学功能研究奠定了基础。     

新型抗菌肽Perinerin在大肠杆菌中的融合表达

为了获得新型抗菌肽 perinerin在大肠杆菌中的高效和可溶表达,实验首先采用SOE 法(重叠 PCR 法)获得的 perinerin 基因序列,对目的基因密码子优化,然后将其连接到 pET32a 载体中获得重组表达载体 pET32a-PEN,通过改变诱导时间和温度、诱导剂 IPTG 浓度以及诱变工程菌株等条件和方法,观察重组蛋白的表达效果,并运用金属螯合层析对融合蛋白进行纯化.SDS-PAGE 显示重组菌诱导后表达的融合蛋白分子量约为 26kD,采用变异重组菌株 MUT 3诱导表达,在 2×YT 培养基培养条件下,30 ℃诱导4 h 可获得高效表达的 perinerin 融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的 50 % 左右,重组蛋白主要以可溶性表达形式存在,可溶性产物最高可达重组蛋白总表达量的 60 %.融合蛋白运用金属螯合层析一步纯化,纯度可达 90 % 以上.     

棉铃虫细胞色素P450 337B3(CYP337B3)的表达、纯化及结晶

【目的】以抗性棉铃虫Helicoverpa armigera体内发现的一种基因重组导致的嵌合型P450酶CYP337B3作为研究对象,通过基因克隆、体外重组表达、蛋白质结晶等技术手段,获得CYP337B3(△23)的晶体结构,为深入了解棉铃虫P450酶CYP337B3的结构与功能奠定基础。【方法】对CYP337B3编码基因进行了密码子优化,通过基因重组,将其转化至BL21(DE3)感受态细胞中进行原核表达尝试,通过亲和层析及RESOURCETM Q离子交换层析对CYP337B3(△23)进行体外纯化,利用气相悬滴结晶方法对CYP337B3(△23)进行结晶条件的筛选及X射线晶体衍射。【结果】通过密码子优化,实现了CYP337B3(△23)在大肠杆菌原核表达系统内的大量表达,经过体外纯化及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,CYP337B3(△23)蛋白纯度可达到95%左右,我们对CYP337B3(△23)进行了蛋白结晶条件的筛选,最终获得了CYP337B3(△23)的结晶条件和蛋白晶体。【结论】本文利用气相悬滴结晶方法获得了CYP337B3(△23)的蛋白晶体,为今后CYP337B3的三维结构解析、功能研究以及最终阐述该种新型的棉铃虫抗药机制奠定了良好的基础。     

恒河猴MHC-I类分子Mamu-A*02与猴免疫缺陷病毒抗原表位复合物的纯化和晶体学分析

恒河猴是研究人免疫缺陷型病毒(HIV)感染与获得性免疫缺失综合征(AIDS)疫苗研制的最为重要的动物模型,其组织相容性复合体(MHC)结构的解析将有助于了解HIV免疫逃逸机制。本研究克隆了1个恒河猴MHC-I类分子Mamu-A*02轻链(β2m)基因并插入到pET21a(+)原核表达载体中,成功构建了重组表达质粒pET21a(+)-Mamu-β2m。pET21a(+)-Mamu-β2m和之前构建好的恒河猴Mamu-A*02重链(α)重组质粒pET21a(+)-α分别转入BL21(DE3)大肠杆菌表达体系中,IPTG诱导表达。Mamu-A*02重链和猴β2m目的蛋白在BL21(DE3)中以包涵体形式表达。重链、轻链的包涵体蛋白和Mamu-A*02限制的猴免疫缺陷病毒(SIV)Nef表位多肽(YY9)通过稀释法共复性。高纯度的复合物蛋白经分子筛层析和阴离子交换层析纯化后获得。复合物晶体利用悬滴法筛选并优化,并在0.1mol/LBIS-TRIS(pH5.5)、2.0mol/L(NH4)2SO4条件下收集一套2.8?分辨率的X-射线衍射数据。晶体属于正交空间群P212121,其晶胞参数为a=128.99?,b=129...     

植物免疫激酶AtCERK1的重组表达与结晶研究

植物免疫激酶中的CERK1(chitin elicitor receptor kinase 1)家族是能够感知细菌及真菌侵染的模式识别受体。此类受体蛋白可以通过识别多糖类的病原微生物相关分子,引起病原微生物相关分子模式触发的免疫反应,是植物产生先天性免疫应答以应对微生物感染的重要元件,同时也是诱导植物-微生物共生的关键蛋白质。为推进CERK1激酶区真实蛋白质三维空间构象的解析,本研究针对拟南芥源的CERK1蛋白构建了野生型及突变型AtCERK1的E. coli-pRSF原核表达系统,经原核表达得到带有6个His标签的融合蛋白,经镍柱亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析等一系列纯化过程得到高纯度蛋白质样品后对其进行结晶条件筛选。最终, AtCERK1^F460V突变型成功在0.2 mol/L氟化铵和20%PEG3350溶液环境中析出蛋白质晶体。经上海光源BL17U1线站采集,蛋白质晶体X射线衍射数据的分辨率为3.2?。综上所述,本研究成功获得了高纯度的AtCERK1蛋白样品,且突变型蛋白质成功析出晶体;同时,利用X射线收取了一套中等分辨率的衍射数据,为AtCERK1介...     

人源Fank1蛋白质FN3结构域多肽的原核表达，纯化及晶体筛选

目的纯化人源Fank1（fibronectin type Ⅲ and ankyrin repeat domain1）蛋白质N端FN3（fibronectin typeⅢ,Ⅲ型纤黏连蛋白）结构域蛋白,用于晶体生长的三维结构分析。方法将FN3结构域基因片段克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,将菌落PCR和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21（DE3）后获得表达菌株。该菌株经IPTG诱导高效表达出带有GST标签的可溶性的融合蛋白,经过Glutathione Sepha-rose^TM 4B亲和层析、Hiload16／60 superdex200分子筛层析纯化后,蛋白纯度达到95％以上。结果纯化蛋白采用悬滴气相扩散法得到棒状晶体。结论成功制备了高纯度FN3蛋白,获得FN3蛋白质晶体,为进一步的三维结构解析及Fank1功能研究奠定了基础。     

疫霉侵染下辣椒幼苗消减文库的构建与初步分析

为了分离和鉴定辣椒中疫霉诱导基因,以高抗疫霉病辣椒品种L11为材料,以接种辣椒疫霉菌的幼嫩叶片为处理（tester）,以未接种自然生长的幼嫩叶片为对照(driver),利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建了疫霉侵染下辣椒幼苗的消减文库。从消减文库中随机挑取30个阳性克隆,提取质粒进行PCR鉴定,显示插入片段大小大部分集中在200～1 000 bp之间,文库质量良好。随机挑取40个克隆进行测序,共获得35个有效EST序列。经Blastx分析表明：有30个EST与GenBank中其他序列有同源性,5个EST为未知功能序列。已知功能的EST序列分别编码NAC转录因子、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、P450单加氧酶、叶绿素a/b结合蛋白、谷胱甘肽转移酶、几丁质酶等,这些蛋白涉及抗病信号传递、抗氧化作用、转录调控及光合作用等多种生理过程。本研究为抗病基因克隆和系统研究疫霉侵染下辣椒基因的表达奠定了重要的理论基础。     

静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白在Bac-to-Bac系统中的表达、纯化与结晶

表达、纯化静水椎螺(Lymnaea stagnalis)乙酰胆碱结合蛋白(Ls-AChBP)并得到晶体。将静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白cDNA序列克隆到表达载体pFastBac1上,构建了重组表达质粒pFastBac1-Ls-AChBP-His,经重组子筛选,得到重组杆状病毒质粒Bacmid,采用CellfectinⅡ脂质体,把带有外源基因的杆状病毒质粒Bacmid转染到昆虫细胞中,经镍柱和凝胶色谱柱对重组蛋白进行纯化得到五聚体,并用机器人进行结晶筛选获得其蛋白晶体。重组蛋白Ls-AChBP在Bac-to-Bac表达系统中得到高效表达并被纯化,结晶筛选得到晶体。     

辣椒疫霉RXLR型效应子PcAvh2的序列多态性、基因转录特征及功能

【目的】分析辣椒疫霉中RXLR型效应子PcAvh2的序列多态性,研究该效应子在辣椒疫霉生长发育和侵染阶段的转录特征及其生物学功能。【方法】本研究通过高保真扩增,分析2个烟草疫霉、1个恶疫霉和31个辣椒疫霉菌株的PcAvh2序列;提取辣椒疫霉菌丝、游动孢子囊、游动孢子、萌发休止孢和7个侵染时间点(1.5、3、6、12、24、36、72 h)的本氏烟根部总RNA,利用RT-qPCR分析PcAvh2的转录表达水平;利用PVX瞬时表达系统,分析PcAvh2是否抑制6种效应子(BAX、INF1、PsojNIP、PsCRN63、PsAvh241、R3a/Avr3a)激发的植物免疫反应;利用CaCl_2-PEG介导的原生质体稳定转化技术,沉默PcAvh2基因,分析辣椒疫霉致病力的变化。【结果】PcAvh2为典型的RXLR效应子,在辣椒疫霉群体中该效应子具有10个等位基因,而且烟草疫霉和恶疫霉中也存在该效应子。该基因在辣椒疫霉的侵染阶段上调表达,它能够抑制6种效应子激发的植物免疫反应,进一步研究发现基因沉默导致辣椒疫霉的致病力显著下降。【结论】RXLR型效应子PcAvh2是辣椒疫霉中一个重要的侵染致病因子。     

大肠杆菌UvrB基因的克隆、表达与功能研究

[目的]在大肠杆菌表达系统表达UvrB蛋白,优化其表达和纯化的条件,并初步研究其对抗紫外线伤害的功能。[方法]克隆大肠杆菌MG1655菌株UvrB编码序列,采用酶切连接的方法构建表达载体p Waldo-GFP-UvrB,并转入BL21(DE3)表达菌株诱导蛋白质表达,采用Ni-NTA亲和层析以及分子筛层析的方法纯化蛋白质,采用紫外光刺激的方法研究其细胞内功能。[结果]成功构建UvrB表达载体,获得UvrB在BL21(DE3)中重组菌株,其表达条件为22℃,0. 2 mmol/L IPTG诱导20 h,UvrB以可溶蛋白的形式存在。SDS-PAGE结果显示UvrB蛋白质分子量约76 k Da与预期相符;经纯化后UvrB蛋白质得率约为0. 6 mg/L培养基,纯度 85%,为其进一步研究奠定了基础。[结论]研究克隆并构建了大肠杆菌UvrB蛋白的原核表达体系,优化了其纯化方案,得到纯度 85%的可溶UvrB蛋白质,为进一步研究UvrB蛋白质功能奠定了基础。     

辣椒疫霉效应分子RxLR121504功能特性的研究

辣椒疫霉菌Phytophthora capsici引起的辣椒疫病是世界性蔬菜病害,该病害严重发生常给辣椒生产造成严重损失。植物病原卵菌侵染寄主植物过程中常分泌大量的效应分子来促进自身的侵染与定殖,其中Rx LR效应分子在病原卵菌侵染寄主及与寄主植物互作过程发挥着重要的作用。辣椒疫霉菌是一种重要的植物病原卵菌,本研究以辣椒疫霉菌标准菌株LT1534为材料,克隆鉴定了辣椒疫霉的一个效应分子,编号为Rx LR121504,然后将其构建至PBIN‐GFP2植物表达载体,利用农杆菌介导的瞬时表达技术、Western blot和亚细胞定位观察技术,较深入地开展了Rx LR121504功能特性的研究。结果表明,Rx LR121504能有效引起本氏烟寄主的过敏性坏死反应(HR),并对激发子INF1诱导的细胞坏死反应具明显的抑制效果,因此Rx LR121504可能参与了辣椒疫霉菌抑制寄主的免疫抗菌过程。但Rx LR121504对寄主植物的分子靶标尚未鉴定明确,该效应分子对寄主植物的分子机制有待进一步深入的研究。     

致病疫霉RXLR效应蛋白相关研究进展

由致病疫霉(Phytophthora infestans(Mont.)de Bary)引起的晚疫病是马铃薯生产中最具毁灭性的病害。为了成功入侵和在寄主植物中繁衍,致病疫霉会向寄主细胞分泌一类RXLR效应蛋白以干扰植物免疫系统。自2005年克隆第一个晚疫病菌RXLR类无毒基因AVR3a以来,国内外学者从RXLR效应蛋白的结构、功能,以及与寄主靶标作用机理等多个方面展开了大量研究。随着高通量测序技术与效应子组学技术的发展,RXLR效应蛋白抑制植物免疫分子机制也取得了显著进展。RXLR效应蛋白的研究有助于揭示致病疫霉与马铃薯互作分子机制,并进一步为马铃薯抗病育种工作提供新思路。主要概述了致病疫霉RXLR效应蛋白的相关研究进展,重点介绍了致病疫霉AVR基因的克隆、定位、变异及功能等方面的最新进展,同时对未来值得关注的研究方向进行了探讨。     

中华按蚊α-羧酸酯酶AsAe7的异源表达、纯化与结晶

【目的】羧酸酯酶(carboxylesterase,COE)是昆虫体内一类重要的解毒酶,与昆虫的抗药性相关。本研究旨在对中华按蚊Anopheles sinensis羧酸酯酶Ae7(Asae7)进行初步晶体学研究,为解析As Ae7的空间结构及探讨其分子功能奠定基础。【方法】首先对Asae7进行生物信息学分析,然后进行分子克隆,并利用原核表达系统在体外对Asae7进行重组表达;结合Ni-NTA金属螯合层析和葡聚糖凝胶层析方法纯化融合表达蛋白;通过葡聚糖凝胶层析和化学交联结果分析As Ae7的聚合状态;采用坐滴气相扩散法对As Ae7进行结晶筛选。【结果】生物信息学分析表明,As Ae7是亲水性蛋白,分子量为61.053 k D,无跨膜区和信号肽;3D结构预测结果分析显示,As Ae7采取的是α/β-水解酶超家族折叠模式。多序列比对结果表明,在不同昆虫中Ae7蛋白具有高度保守性。分子克隆得到中华按蚊As Ae7的编码基因Asae7序列,大小为1 626 bp。成功构建重组质粒p ET28aAsae7;在大肠杆菌Escherichia coli中表达的融合蛋白As Ae7主要分布在上清中。通过镍柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化出了高纯度且稳定的目的蛋白;通过凝胶过滤层析和化学交联获得纯化的As Ae7主要呈单体状态;同时通过晶体筛选获得了As Ae7的晶体。【结论】运用结晶学的方法初步获得了As Ae7的晶体,为后续解析As Ae7的晶体结构以及在原子分辨率水平上直观阐释As Ae7参与代谢抗性的分子机制奠定了基础。     

六种疫霉菌体可溶性蛋白质和酯酶的聚丙烯酰胺凝胶平板电泳研究

本文对槐生疫霉(Phytophthora robinicola)、掘氏疫霉(P.drechsleri)、樟疫霉(P.cinnamomi)、烟草疫霉(P.nicotianae)、棕榈疫霉(P.palmivora)及辣椒疫霉(P.capsici)等6种疫霉81株菌菌体可溶性蛋白质和酯酶进行了聚丙烯酰胺凝胶平板电泳研究。结果指出,种间蛋白质图谱差异明显,种内菌株间基本一致。就酯酶图谱来说,种内菌株间存在一定差异,但种间差异更为显著。因此,本试验进一步支持槐生疫霉新种的建立。同时表明,菌体可溶性蛋白质电泳图谱在疫霉种的鉴定和分类上具有重要意义,而酯酶电泳图谱在一定程度上也有助于疫霉种的研究。