miR-34a-5p通过靶向醛缩酶A抑制肝癌细胞的增殖和迁移

[目的]证明醛缩酶A(ALDOA)在肝癌细胞的增殖和迁移作用并探索miR-34a-5p靶向调控ALDOA的分子机制,为肝癌治疗提供潜在的分子靶标。[方法]分子生物学技术构建了ALDOA表达质粒,蛋白质印迹(Western Blotting)和实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测ALDOA的过表达和敲降效果,CCK-8验证细胞的增殖,划痕实验验证细胞的迁移。[结果]在肝癌细胞中过表达ALDOA能促进肝癌细胞的增殖与迁移(P 0.05),敲降ALDOA后肝癌细胞的增殖与迁移受到抑制(P 0.05),miR-34a-5p是通过靶向结合ALDOA的3'UTR抑制其表达从而抑制肝癌细胞的增殖与迁移(P 0.05)。[结论]miR-34a-5p通过靶向ALDOA抑制肝癌细胞的增殖和迁移。     

MiR-5047在乳腺癌细胞增殖迁移中的作用及表达调控*

探讨miR-5047在乳腺癌细胞中的表达及其在乳腺癌细胞增殖和迁移中的作用,并明确地西他滨在miR-5047表达调控中的作用。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测人乳腺癌细胞系和正常乳腺上皮细胞MCF10A中miR-5047的表达水平;将miR-5047模拟物(mimic),阴性对照(NC)分别转染至MDA-MB-231和MCF7细胞,经平板克隆实验、MTT实验、划痕愈合实验检测乳腺癌细胞的增殖和迁移能力,通过qRT-PCR和Western blot检测相关基因表达及蛋白水平。使用浓度5 μmol/L和10 μmol/L的地西他滨分别处理MDA-MB-231和MCF-7细胞,经qRT-PCR检测不同浓度和处理时间条件下地西他滨对miR-5047表达的影响。同时,通过形态观察和Western blot检测地西他滨对乳腺癌细胞上皮间质转化的影响。与正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比,miR-5047在乳腺癌细胞中表达均显著下调。miR-5047过表达可显著抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移,促进上皮细胞标志物E-cadherin的表达,抑制间质细胞标志物Vimentin的表达。不同浓度地西他滨处理MDA-MB-231和MCF7细胞后,miR-5047表达均增强,且10 μmol/L作用48 h效果最显著。地西他滨可诱导MDA-MB-231细胞向上皮样转变。miR-5047在乳腺癌细胞系中表达显著下调,过表达miR-5047可抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移,地西他滨可促进乳腺癌细胞中miR-5047的表达,并诱导细胞向上皮样转变。     

RP4 通过miR-183-5p.1上调FOXO1抑制乳腺癌细胞增殖

近年来,越来越多的证据表明,长非编码RNAs在肿瘤发生发展中发挥重要作用。位于12号染色体的长非编码RNA RP4-816N1.7（简称RP4）在乳腺癌细胞中的作用未见报道。我们通过实时荧光定量PCR证实,RP4在乳腺癌细胞中的表达量普遍低于其在正常乳腺上皮细胞MCF-10A中的表达量。RP4在MCF-7和MDA-MB-231中表达量分别比其在MCF-10A中的表达量下调21.57%和91.33%。过表达RP4可明显抑制乳腺癌细胞增殖。敲低RP4可显著增加乳腺癌细胞的增殖能力。生物信息学预测,RP4可能与miR-183-5p.1结合,且叉头蛋白O1(FOXO1)可能是miR-183-5p.1的潜在靶标。实时荧光定量PCR结果提示,RP4可下调miR-183-5p.1,而miR-183-5p.1也可下调RP4和FOXO1的表达。双荧光素酶报告基因结果证实,miR-183-5p.1可与RP4结合,下调其表达,也能与FOXO1 3′UTR结合,抑制其mRNA和蛋白质水平的表达量。最后,本文通过BrdU实验证实,RP4通过FOXO1抑制乳腺癌细胞的增殖。总之,RP4通过内源性结合miR-183-5p.1,上调FOXO1表达,进而抑制乳腺癌细胞增殖。     

DKK-1通过上调nm23表达抑制乳腺癌细胞迁移

Dickkopf-1(DKK-1)作为Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)经典信号传导通路的拮抗剂而受到关注.为了进一步阐明DKK-1在乳腺癌细胞迁移中的作用及其分子机制,应用我们建立的乳腺癌细胞MCF-7高转移倾向亚克隆LM-MCF-7细胞株,比较了DKK-1在不同转移能力的乳腺癌细胞株中表达水平及其与细胞迁移能力的关系.结果显示,DKK-1在LM-MCF-7细胞中表达明显下调;"伤口愈合"实验结果表明,在MCF-7细胞中,RNA干扰DKK-1可导致细胞迁移能力增强;相反,在LM-MCF-7细胞中过表达DKK-1则可抑制细胞的迁移.进一步研究结果显示,DKK-1为肿瘤转移抑制因子nm23的上游激活因子.因此,我们的研究结果表明,DKK-1表达水平下调导致nm23表达水平下调,解除了对乳腺癌细胞迁移的抑制作用,是LM-MCF-7乳腺癌细胞具有高迁移能力的原因之一;反之,与LM-MCF-7相比,DKK-1在MCF-7细胞中高表达,其通过上调nm23可抑制乳腺癌细胞迁移.这一发现对进一步揭示乳腺癌细胞转移的分子机制具有的重要意义.     

miR-125a-5p通过靶向调控GAB2抑制乳腺癌细胞的迁移能力

miR-125a-5p可负性调节GAB2表达,抑制胶质瘤细胞的侵袭和转移。本研究旨在证明miR-125a-5p抑癌作用的普遍性,即miR-125a-5p是否可通过靶向抑制GAB2抑制乳腺癌细胞的迁移。荧光素酶实验结果显示,miR-125a-5p可特异识别GAB2的3′-UTR,抑制报告酶的表达。荧光定量PCR结果揭示,与正常乳腺上皮细胞MCF-10A比较,miR-125a-5p在乳腺癌细胞MDA231和MCF-7中的表达明显降低;与迁移能力相对较低的MCF-7细胞比较,miR-125a-5p在迁移能力较高的MDA231细胞中的表达量更低。Western 印迹结果证明,与空载体（对照）和anti-miR125a 5p转染细胞比较,转染miR-125a-5p明显抑制GAB2蛋白在乳腺癌细胞中的表达。Transwell结果显示,与空载体转染的对照细胞比较,转染miR-125a-5p的乳腺癌细胞穿过基质胶的细胞数明显减少;相反,转染anti-miR125a-5p的细胞穿过基质胶的细胞数却明显增多。上述结果提示,miR-125a-5p在正常的乳腺细胞中高表达,而在乳腺癌细胞中低表达,其表达水平与癌细胞的迁移能力和GAB2表达呈反向关系。本研究结果还提示,miR-125a-5p通过靶向负调控GAB2抑制乳腺癌细胞的迁移能力。总之,本研究证明,miR-125a-5p在肿瘤中发挥抑癌作用。     

探究靶向FTO下调的miRNA及其对乳腺癌细胞生物学行为的调节

该文筛选了靶向抑制FTO的miRNA并探究其乳腺癌细胞生物学行为的影响。通过生物信息学的方法筛选出了影响乳腺癌患者生存的m6A去甲基化酶FTO后,再通过CCK-8实验验证了FTO的下调能够抑制乳腺癌细胞的增殖,随后预测出靶向FTO的miRNA—miR-504-5p,RT-qPCR和Western blot实验检测了乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231中miRNA-504-5p对FTO表达水平的影响,双荧光素酶报告基因实验验证了miRNA-504-5p与FTO的结合关系,采用CCK-8、Transwell小室实验、流式细胞术等探究了miRNA-504-5p mimic(类似物)通过调控FTO对乳腺癌细胞增殖、迁移、凋亡和细胞周期的影响。实验结果表明,低表达FTO的乳腺癌患者相较于高表达FTO的乳腺癌患者具有更高的生存概率,miRNA-504-5p作为潜在的靶向FTO的miRNA,能够在mRNA与蛋白水平抑制FTO的表达,并且miR-504-5p在FTO 3'-UTR的5 927–5 933位点处与FTO靶向结合,miR-504-5p能通过下调FTO抑制乳腺癌细胞的增殖与迁移并促进乳腺癌细胞的凋亡,使细胞阻滞在G_0/G_1期。综上所述,该研究发现了miR-504-5p能下调FTO的表达,抑制乳腺癌细胞的增殖与迁移,促进乳腺癌细胞的凋亡,使乳腺癌细胞的细胞周期阻滞。这可以为乳腺癌的分子机制探究与治疗提供潜在的参考价值。     

MiR-30e调控心肌肥厚的作用机制研究

目的:预测并鉴定miR-30e的靶基因,阐明miR-30e调控心肌肥厚的分子机制.方法:分离新生大鼠心肌细胞,用苯肾上腺素(PE)处理心肌细胞构建心肌细胞肥大模型,48小时后通过定量PCR方法检测miR-30e的表达水平变化.利用生物信息学方法预测miR-30e的靶基因,并通过荧光素酶报告基因实验和蛋白免疫印迹方法验证miR-30e的靶基因.结果:与对照组相比,PE处理48hr后,心肌肥厚标志基因nppa表达明显升高,肥大心肌细胞中miR-30e明显下调.生物信息学预测细胞骨架调控蛋白Twinfilin-1(Twf1)3'UTR有两个miR-30e的结合位点.过表达miR-30e能抑制含有Twf1 3'UTR的荧光素酶报告基因的表达,降低Twf1的蛋白表达水平.结论:Twf1为miR-30e的靶基因,miR-30e通过抑制Twf1的表达调控心肌肥厚.     

miR-5688在三阴性乳腺癌细胞中下调固醇调节元件结合蛋白1的表达而抑制三阴性乳腺癌细胞增殖

目的:探讨miR-5688在患者来源三阴性乳腺癌(PD-TNBC)细胞中通过抑制固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)的表达从而发挥抗肿瘤活性。方法:查询miRDB数据库,预测潜在作用于SREBP-1的miRNA;qPCR实验检测三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞系、PD-TNBC细胞及患者组织中SREBP-1与miR-5688的表达;Western印迹验证miR-5688下调SREBP-1的表达;构建miRNA-5688的过表达慢病毒颗粒,在上述细胞中过表达miR-5688,以MTT实验、Transwell实验、裸鼠皮下成瘤实验检测miRNA-5688对细胞增殖、转移与侵袭作用、裸鼠成瘤的影响。结果:在三阴性乳腺癌临床标本中,miR-5688与SREBP-1的表达呈负相关趋势,通过在PD-TNBC细胞中验证,miR-5688能够下调SREBP-1的表达;转染miR-5688抑制剂能够阻断miR-5688抑制SREBP-1表达的作用。体外细胞实验结果显示miR-5688能够抑制MDA-MB-231细胞系和PD-TNBC细胞的增殖、转移与侵袭作用,同样转染miR-5688抑制剂能够阻断其抑制作用。体内小鼠成瘤实验结果显示,miR-5688能够抑制PD-TNBC细胞在裸鼠皮下的成瘤作用。结论:miR-5688能够在PD-TNBC细胞中下调SREBP-1的表达,并抑制三阴性乳腺癌细胞增殖作用。     

miR-145通过下调PLCε抑制膀胱癌EMT和迁移及其机制研究

目的:探讨miR-145调控PLCε对膀胱癌细胞T24上皮间质转化(EMT)和迁移的影响及可能的分子机制。方法:(1)腺病毒感染T24细胞,划痕实验和Transwell检测细胞的迁移能力;RTPCR、Western blot分别检测PLCε及EMT相关分子的表达;为探究其分子机制,Western blot检测GSK-3β磷酸化(Ser9位点)和Snail的表达情况。(2)利用生物信息学技术预测可能调控PLCε的miRNA,结合文献报道的膀胱癌microRNA表达谱结果筛选出miR-145;转染miR-145 mimics至T24,q PCR检测miR-145、PLCε的表达,Western blot检测PLCε的表达。(3)转染miR-145 mimics,Western blot检测EMT相关分子及p-GSK-3β、Snail;划痕实验、Transwell检测过表达miR-145后细胞的迁移能力。结果:(1)干扰PLCε表达能显著抑制细胞的迁移,同时,使T24细胞中E-cadherin表达上调,N-cadherin和Vimentin表达下调;干扰PLCε后,GSK-3β磷酸化(Ser9位点)水平下降,Snail表达降低。(2)转染miR-145 mimics可使T24细胞中miR-145表达增高,且明显抑制T24细胞中PLCε的表达。(3)在T24中过表达miR-145,细胞迁移能力显著下降,EMT标志分子的表达情况与沉默PLCε结果一致。同时,与阴性对照组相比,转染miR-145 mimics组p-GSK-3β和Snail表达显著减少。结论:PLCε通过GSK-3β/Snail信号通路促进膀胱癌细胞T24发生EMT及迁移,miR-145可以逆转PLCε诱导膀胱癌EMT的发生,从而阻止膀胱癌细胞的迁移。     

MiR-206与ANXA2的3′UTR靶向结合抑制乳腺癌侵袭

膜联蛋白A2（annexin A2,ANXA2）可促进人结直肠癌的侵袭和迁移。然而,ANXA2在乳腺癌中的作用以及调节机制尚缺乏系统的研究。本研究旨在探讨微小RNA-206（microRNA-206,miR-206）如何调节ANXA2基因的表达,进而影响乳腺癌的侵袭。通过基因预测软件TargetScan (TargetScan V5.2)找到与ANXA2的3′UTR区互补结合的miR-206。运用实时定量 PCR（qRT-PCR）检测不同乳腺癌细胞系中miR-206的表达水平,发现低侵袭性乳腺癌MCF-7细胞株miR-206 表达量明显高于高侵袭性乳腺癌细胞株MDA-231、MDA-435和T47D。运用转染技术将 miR-206 质粒及miR-206 抑制剂转入乳腺癌细胞系MDA-231后,qRT-PCR检测转染后各组细胞中miR-206的表达情况,结果显示转染成功。用Western印迹法检测各组细胞中ANXA2的表达情况,结果显示,miR-206负向调控ANXA2蛋白的表达。 qRT-PCR显示,过表达乳腺癌细胞内miR-206 后,ANXA2 mRNA基本没有变化。结果显示,miR-206是在翻译水平上影响ANXA2蛋白的表达。荧光素酶实验显示：miR-206能特异性地与ANXA2 mRNA的3′UTR结合,抑制其荧光素酶活性。Transwell侵袭实验检测各组细胞的侵袭能力。结果显示,过表达miR-206后,乳腺癌细胞体外侵袭能力明显减弱。综上所述,miR-206 通过靶向结合癌基因ANXA2 mRNA的3′UTR区,抑制ANXA2蛋白翻译,从而抑制了乳腺癌细胞的侵袭。因此,miR-206有望成为抑制乳腺癌侵袭与治疗乳腺癌的新靶点和生物学标记物。     

miR-9 在卵巢癌细胞上皮间质转化中的初步研究

目的:研究miR-9在卵巢癌细胞上皮间质转化(EMT)中的作用。方法:上调或者下调miR-9后,在RNA水平上通过RT-qPCR检测卵巢癌细胞系SKOV3和A2780中上皮指标E-cadherin表达变化;在蛋白水平,通过western blotting方法检测2株细胞系中上皮指标E-cadherin和间质指标vimentin蛋白表达变化。生物信息学预测可能靶向E-cadherin 3'UTR的miR NA,双荧光素酶报告系统进一步验证miR-9靶向结合E-cadherin的3'UTR区。结果:上调miR-9后,卵巢癌细胞系中E-cadherin表达受到明显抑制,vimentin表达明显增加;反之,下调miR-9后,E-cadherin表达明显增高,vimentin表达明显降低。通过生物信息学预测发现miR-9可以直接靶向E-cadherin的3'UTR区,荧光素酶报告系统验证预测结果正确。结论:miR-9促进卵巢癌细胞上皮间质转化。     

MiR-150-5p通过靶向调控Rab1A抑制乳腺癌细胞MDA-231的上皮-间质转化

先前的研究表明,miR-150-5p发挥抑癌基因的作用,调控肿瘤细胞的侵袭与转移。然而,关于其在乳腺癌细胞侵袭与转移中的机制尚不明确。本实验旨在研究miR-150-5p负向调控Rab1A在乳腺癌细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）中的作用。双荧光素酶的结果显示,miR-150-5p可负向调控Rab1A。荧光定量PCR (qRT-PCR) 结果显示,miR-150-5p在乳腺癌细胞MCF-7及MDA-MB-231（MDA-231）中的表达水平明显低于正常乳腺上皮细胞MCF-10A; 在MDA-231中过表达miR-150-5p后,qRT-PCR结果显示,Rab1A mRNA的表达水平明显降低。Western印迹结果显示,过表达miR-150-5p后,miR-150-5p组细胞中的Rab1A、波形蛋白(vimentin)及N-钙黏着蛋白(N-cadherin)的表达水平相对于对照组（NC）细胞明显降低,而E-钙黏着蛋白(E-cadherin)的表达水平明显增加。Transwell侵袭和划痕实验显示,与miR-150-5p+Con组细胞相比,miR-150-5p+Rab1A组细胞的侵袭和迁移能力明显增加。qRT-PCR结果显示,miR-150-5p+Rab1A组细胞的Rab1A mRNA表达水平明显增加。Western印迹结果显示,miR-150-5p+Rab1A组细胞中的波形蛋白、N-钙黏着蛋白表达水平明显增加, 而E-钙黏着蛋白表达明显降低,过表达Rab1A后显著逆转了miR-150-5p对EMT的影响。综上所述,miR-150-5p可以通过负向调控Rab1A抑制EMT,进而抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移。     

中心体蛋白70促进乳腺癌细胞的侵袭和转移

中心体蛋白70（centrosomal protein 70, CEP70）可通过介导内皮细胞的迁移影响血管新生,肿瘤的转移能力与肿瘤细胞的迁移密切相关,CEP70是否影响肿瘤细胞的侵袭转移尚不明确。结合前期淋巴结转移和未发生淋巴结转移原位乳腺癌组织的基因表达芯片的比较结果,本研究通过免疫组化染色,检测CEP70在淋巴结转移和未发生淋巴结转移的原位乳腺癌组织中的表达情况,以及real-time PCR和Western 印迹检测不同乳腺癌细胞系中CEP70的表达,结果提示,淋巴结转移患者的乳腺癌组织中CEP70强阳性的比例明显高于未发生淋巴结转移的乳腺癌组织,同时CEP70在侵袭能力强的乳腺癌细胞中表达较高。利用慢病毒转染构建CEP70稳定下调的MDA-MB-231细胞系,划痕实验以及侵袭转移的结果显示,下调CEP70的表达,可明显抑制MDA-MB-231细胞系的细胞迁移和侵袭能力。上述结果证明,CEP70的表达与乳腺癌的侵袭转移呈正相关,下调CEP70可抑制乳腺癌的侵袭转移,因此CEP70有望成为乳腺癌临床诊断及治疗的新靶点。     

中心体蛋白70促进乳腺癌细胞的侵袭和转移北大核心CSCD

中心体蛋白70(centrosomal protein 70,CEP70)可通过介导内皮细胞的迁移影响血管新生,肿瘤的转移能力与肿瘤细胞的迁移密切相关,CEP70是否影响肿瘤细胞的侵袭转移尚不明确。结合前期淋巴结转移和未发生淋巴结转移原位乳腺癌组织的基因表达芯片的比较结果,本研究通过免疫组化染色,检测CEP70在淋巴结转移和未发生淋巴结转移的原位乳腺癌组织中的表达情况,以及real-time PCR和Western印迹检测不同乳腺癌细胞系中CEP70的表达,结果提示,淋巴结转移患者的乳腺癌组织中CEP70强阳性的比例明显高于未发生淋巴结转移的乳腺癌组织,同时CEP70在侵袭能力强的乳腺癌细胞中表达较高。利用慢病毒转染构建CEP70稳定下调的MDA-MB-231细胞系,划痕实验以及侵袭转移的结果显示,下调CEP70的表达,可明显抑制MDA-MB-231细胞系的细胞迁移和侵袭能力。上述结果证明,CEP70的表达与乳腺癌的侵袭转移呈正相关,下调CEP70可抑制乳腺癌的侵袭转移,因此CEP70有望成为乳腺癌临床诊断及治疗的新靶点。     

miR-598 对结直肠癌细胞转移潜能的影响

目的:探讨miR-598在结直肠癌转移中的作用和分子机制,为寻找新的结直肠癌治疗靶标提供理论依据。方法:收集30对人结直肠癌及癌旁正常组织标本,采用qRT-PCR检测miR-598的表达,采用Transwell和划痕实验确定miR-598对结直肠癌细胞侵袭和迁移能力的影响,利用在线靶基因预测软件,筛选出miR-598可能的下游靶基因Jagged 1(JAG1),利用Western blot及双荧光素酶报告基因实验检测miR-598对JAG1及上皮间质转化标志物(Vimentin及E-cadherin)表达的影响。结果:与正常肠黏膜组织对比,miR-598在结直肠癌组织中的表达水平明显降低;miR-598显著抑制结直肠癌细胞的侵袭及迁移能力;分子机制分析证实miR-598能够作用于JAG1的3'-UTR并抑制其表达;过表达miR-598显著下调Vimentin的表达水平,而提高E-cadherin的表达水平。结论:miR-598在人结直肠癌中表达明显下调;miR-598通过靶向调控靶基因JAG1的表达,抑制结直肠癌细胞EMT,从而有效的抑制了结直肠癌细胞的侵袭和迁移。     

8-氯腺苷通过ADAR1调控miR-335-5p抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭

该文探讨了8-氯腺苷(8-chloro-adenosine, 8-Cl-Ado)调控RNA编辑酶1(adenosine deaminases acting on RNA1, ADAR1)对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,确定了ADAR1与miR-335-5p表达的相关性。10μmol/L的8-Cl-Ado作用于乳腺癌细胞后(不同时间点),采用CCK-8检测细胞的增殖情况; Transwell检测细胞的迁移和侵袭情况; Western blot检测ADAR1蛋白的表达水平;CCK-8检测ADAR1过表达对8-Cl-Ado抑制乳腺癌细胞增殖的影响; Transwell检测ADAR1过表达对8-Cl-Ado抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响; miRNA芯片筛选8-Cl-Ado处理后乳腺癌细胞中上调的miRNA, qRT-PCR验证其与ADAR1的相关性。结果显示, 8-Cl-Ado能抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭; ADAR1蛋白的表达量随8-Cl-Ado处理时间的增加而逐渐降低; ADAR1的过表达能减弱8-Cl-Ado对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用; miR-335-5p经8-Cl-Ado处理后表达水平上调,与ADAR1呈负向调控关系。以上结果表明, 8-Cl-Ado下调ADAR1抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭,其作用机制可能与ADAR1下调mi R-335-5p有关。     

ERα-36和STAT3协同促进乳腺癌细胞的迁移

[目的]探讨ERα-36和STAT3通过MMP2和MMP9对乳腺癌细胞迁移的影响。[方法]使用Transwell实验检测ERα-36和STAT3对乳腺癌细胞迁移能力的影响,荧光定量PCR和Western Blot检测在乳腺癌细胞中过表达ERα-36和STAT3对MMP2和MMP9表达的影响,Luciferase实验检测ERα-36和STAT3对MMP2和MMP9启动子转录活性的影响。[结果]与对照组相比,过表达STAT3组的乳腺癌细胞迁移能力明显升高(P 0. 05),两种与迁移相关蛋白MMP2和MMP9表达量均升高(P 0. 05);过表达STAT3增强了乳腺癌细胞中MMP2和MMP9的转录活性,而ERα-36过表达对MMP2和MMP9的转录活性具有较弱的影响。但是共表达ERα-36和STAT3显著增强了MMP2和MMP9的转录活性与表达。[结论]ERα-36和STAT3协同结合到MMP2和MMP9的启动子上,促进它们的转录与表达进而促进乳腺癌细胞迁移。     

miR-195通过下调IGF-1R的表达抑制胶质母细胞瘤的增殖和迁移

目的:探讨miR-195对胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)增殖和迁移的影响,并阐明其分子调控机制。方法:采用qRT-PCR检测不同级别胶质瘤中miR-195的表达。将miR-195转染至胶质瘤U251细胞后,应用qRT-PCR验证转染效率,MTT及划痕实验检测U251细胞的增殖及迁移能力的改变,qRT-PCR及Western blot检测胰岛素样生长因子1受体(Insulin-like growth factor 1receptor, IGF-1R)的mRNA和蛋白表达;利用质粒转染过表达miR-195后,同时过表达IGF-1R,再应用MTT及划痕实验检测U251细胞的增殖及迁移能力的变化。结果:随着胶质瘤级别的增加,miR-195的表达逐渐降低,各级别胶质瘤中miR-195的表达差异有统计学意义(P0.05)。体外转染miR-195至U251细胞24、48、72 h后,转染组细胞活力和迁移能力均较对照组显著降低(P0.05),细胞中IGF-1R的mRNA和蛋白的表达也明显减少(P0.05);通过转染IGF-1R过表达质粒可显著逆转miR-195过表达对U251细胞增殖及迁移的抑制作用。结论:miR-195可能通过下调IGF-1R的表达,进而抑制胶质母细胞瘤的增殖和迁移。     

Mmu-miR-107与Cacna2d1基因3'UTR结合位点的预测及验证

[目的]预测并验证mmu-miR-107与Cacna2d1基因3'UTR的结合位点。[方法]生物信息学预测miR-107与小鼠Cacna2d1基因3'UTR的结合位点,将包含3个靶位点的3'UTR片段克隆至荧光素酶载体p GL3中,构建野生型p GL3-Cacna2d1-WT3'UTR载体;并用重叠延伸PCR技术构建分别含有单个突变位点的载体Mut1200-207、Mut2361-367、Mut3902-908和同时含有3个突变结合位点的载体Mut4plus。将各重组质粒与miRNA mimics共转染C2C12细胞,检测荧光素酶活性。[结果]与共转染p GL3-Cacna2d1-WT 3'UTR和miR-NC组相比,共转染p GL3-Cacna2d1-WT 3'UTR和mimics-miR-107组荧光素酶活性显著下降(P0.01);与共转染对应的突变体和miR-NC组相比,转染突变体Mut2361-367/Mut3902-908和mimics-miR-107组的荧光素酶活性均下降(P0.05);转染突变体Mut1200-2077/Mut4plus和mimics-miR-107组的荧光素酶活性下降不明显(P0.05)。[结论]Cacna2d1基因3'UTR段双荧光素酶基因报告载体及突变体构建成功,初步证实miR-107与Cacna2d1 3'UTR的200-207位点结合。     

miR-142通过靶向HMGB1对宫颈癌细胞生物学行为影响的实验研究

摘要 目的：通过实验探究miR-142靶向高迁移率族蛋白1（high-mobility group box 1 protein,HMGB1）对宫颈癌（cervical cancer,CC）细胞生物学行为的影响及其潜在的作用机制。方法：采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）和蛋白质免疫印迹法（Western Blot）检测CC组织和正常组织中miR-142和HMGB1 mRNA及蛋白表达水平,采用荧光素酶报告实验分析miR-142与HMGB1的靶向关系,CCK-8法检测CC细胞生存能力,克隆形成实验检测CC细胞增殖能力,划痕修复实验检测CC细胞迁移能力,基质胶侵袭实验检测CC细胞侵袭能力。结果：CC组miR-142 mRNA和蛋白表达水平显著低于正常组（P<0.05）,HMGB1 mRNA和蛋白表达水平显著高于正常组（P<0.05）,且CC癌组织中miR-142和HMGB1 mRNA和蛋白表达水平均呈显著负相关（r=-0.399,P=0.002;r=-0.429,P=0.001）;miR-142与HMGB1存在靶向关系;CCK-8法实验、克隆形成实验、划痕修复实验和基质胶侵袭实验结果显示,miR-142 mimic组细胞生存、增殖、迁移和侵袭能力显著低于miR-NC组（P<0.05）,miR-142 inhibitor组细胞生存、增殖、迁移和侵袭能力显著高于miR-NC组;Western Blot实验结果显示,HMGB1过表达时miR-142 mimic+plasmid组HMGB1蛋白表达水平显著高于miR-142 mimic+control plasmid组（P<0.05）,显著低于miR-NC+plasmid组（P<0.05）;CCK-8法实验、克隆形成实验、划痕修复实验和基质胶侵袭实验结果显示,HMGB1过表达时miR-142 mimic+plasmid组细胞生存、增殖、迁移和侵袭能力显著高于miR-142 mimic+control plasmid组（P<0.05）,显著低于miR-NC+plasmid组（P<0.05）。结论：miR-142可通过靶向负调控HMGB1表达,进而抑制CC细胞生存、增殖、迁移和侵袭。