中枢神经系统L-型电压门控钙通道的功能调控与脑缺血

中枢神经系统L 型电压门控钙通道 (L typevoltage gatedcalciumchannels ,L VGCCs)由α1C(D)亚基和辅助亚基组成。α1C亚基的C 端包含多个功能结构域 ,可分别与钙调素、钙调蛋白酶、cAMP依赖性蛋白激酶、Src家族酪氨酸蛋白激酶 (Srcfamilyproteintyrosinekinases ,SrcPTKs)等相互作用 ,从而参与L VGCCs的功能调控。SrcPTKs介导的两种钙通道———L VGCCs和N 甲基 D 天冬氨酸 (N methyl D aspartate ,NMDA)受体的对话可能是缺血性脑损伤的重要机制     

辅助亚基KChIPs对Kv4钾通道的“钳制”调节作用

快速失活电压门控型钾通道对于神经元兴奋性发挥重要的调节作用,从而影响神经元的功能,如疼痛的信号传导等.拥有四个钙结合位点"EF-hand"的胞浆蛋白KChIPs(Kv channel-interacting proteins)属于神经钙感受器(NCS)家族,与Kv4(Shal)的α亚基共组装成为天然复合体,在神经元和心肌分别编码瞬间低阈值A型K+电流ISA(transient subthreshold A-type K+ current)和瞬间外向K+电流ITO(transient outward K+ current).辅助亚基KChIPs与Kv4 N端的特异性结合有助于电压门控钾通道四聚体的形成和稳定,从而增加通道向细胞膜表面的转运,并调节通道的失活动力学和恢复速率等.本文基于近期解析出的Kv4 N末端与KChIP1的复合晶体结构,着重阐述Kv4钾通道与其辅助亚基KChIPs的相互作用机制.在Kv4 N端/KChIP1复合结晶体中,每一个KChIP1分子分别与两个邻近的Kv4 N末端相结合,即单个KChIP1同时与周围的两个Kv4相互作用,而形成分子数比为4:4的"钳制"结构.Kv4和KChIPs相互作用的结构机制为基于结构的化合物设计以及治疗膜兴奋性相关疾病提供了基础.     

电压门控钙通道钙依赖性易化和失活的分子机制

电压门控钙通道受钙依赖性易化和失活两种相互对立的反馈机制调节.不同浓度的钙离子,通过作为钙感受器的钙调蛋白的介导,主要与钙通道α1亚基羧基端的多个不连续片段发生复杂的相互作用,分别引发钙依赖性易化和失活.钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ及其它钙结合蛋白等也参与此调节过程.新近研究表明,钙通道的钙依赖性调节机制失衡与心律失常等的发病机制密切相关.     

抗钠-钙交换体α-1重复序列(117-137)抗体对心肌钠-钙交换电流及钙电流的抑制作用(英文)

本研究旨在探讨抗钠-钙交换体(Na+-Ca2+ exchanger,NCX)α-1重复序列(117-137)抗体对大鼠心肌细胞钠-钙交换电流的影响。实验用合成的α-1重复序列(117-137)肽免疫大鼠制备抗α-1重复序列(117-137)抗体;应用全细胞膜片钳技术,在急性分离的心肌细胞上观察抗α-1重复序列(117-137)抗体对大鼠心肌细胞钠-钙交换电流的影响,同时还观察了其对大鼠心肌细胞L型钙通道、电压门控钠通道和豚鼠心肌延迟整流钾通道电流的影响;最后,采用EMBOSS Pairwise Alignment Algorithms软件对NCXα-1重复序列和L型钙通道(1076～1096)的氨基酸序列进行了比较。结果显示,抗α-1重复序列(117-137)抗体对大鼠心肌细胞Na+-Ca2+交换电流呈现剂量依赖性的抑制作用。在钳制电压为+50和-100mV时,其抑制外向和内向钠-钙交换电流的IC50分别为18.9和22.4nmol/L。此外,该抗体还对L型钙通道电流具有抑制效应(IC50=22.7nmol/L),对电压门控钠通道和延迟整流钾通道电流则无明显影响。通过氨基酸序列比对发现,NCX α-1重复序列(117-137)与L型钙通道IIIS5-S6序列(孔环)之间具有23.8%的相似性。以上结果表明,抗NCX α-1重复序列(117-137)抗体是心肌NCX的一种抑制性抗体,同时也可以抑制L型钙通道。     

芋螺毒素与钙离子通道相互作用的计算机模拟

电压门控N－型钙离子通道是与神经元中释放的神经信号传递有关的跨细胞膜的特殊蛋白质分子,它由好几个蛋白质亚基组成,其中的α1亚基包含了电压敏感器和钙离子的选择性孔道,该亚基的一级结构已经发表,一般认为α1亚基包含4个重复单位（I－Ⅳ）,每个重复单位包括6段跨膜区（S1－S6）,其中跨膜区S4上有很多正电荷,被认为是通道的电压敏感器,S5和S6之间的连接区（P区）被认为是形成通道的门孔的部分,N－型钙离子通道能够被一些w-芋螺毒素特异性在阻断,这些ω－芋螺毒素的三维结构已经由二维核磁共振方法测定,尽管还没有被证实,但一般认为w-芋螺毒素占据了通道的孔道,有实验证明,钙离子第三个重复单位的P区（ⅢP区）是通道的芋螺毒素结合的主要部位,在本中,我们用分子模拟程序建模了ⅢP区的结构,为了通道的阻断机理有一个清楚的了解,我们利用分子对接程序模拟了IIIP区和三种芋螺毒素GVA,MVIIA和S03作用的理论模型,在我们的模型中,GVIA与钙通道的作用方式可能与MVIIA不同,而M VII A和SO3与钙通道的作用方式可能相同,我们还讨论了这些芋螺毒素中的关键残基的作用。     

P2X4受体的结构功能关系研究进展

嘌呤能受体P2X4是三磷酸腺苷(ATP)-门控的阳离子通道,对生物体内多种重要生命活动起一定的调节作用。二次跨膜的三聚体通道P2X4受体的三维空间组成是由胞外结构域、跨膜域及胞内N-、C-端组成。ATP的三磷酸基团能被位于亚基界面的ATP结合口袋的带正电氨基酸特异性识别,嘌呤环则被疏水氨基酸和部分氨基酸的主链氧所识别。P2X4受体激活后,胞外阳离子更多是通过侧窗路径进入细胞内。就P2X4受体的空间结构、配体的识别、离子通透途径及门控机制作一综述。     

电压门控钠通道的β亚基调控机制

电压门控钠通道是细胞电兴奋的重要分子基础,由一个α孔道亚基和单个或多个β辅助亚基构成。β亚基以直接与钠通道α亚基结合或以细胞粘附分子方式,组合或单独调节α亚基的表达定位及门控特性。因此,β亚基与α亚基不同亚型的细胞特异性表达组合,是神经元内在特性的内源性调控机制之一。本文基于钠通道β亚基不同亚型差异表达与功能的多样性调控,解析疼痛、癫痫等通道病发生发展的β亚基相关机制,以期为靶向电压门控钠通道的临床诊疗和新药发现提供新策略。     

人Calpain1与心脏结构蛋白的相互作用

为探讨人calpain1与心脏结构蛋白之间的相互作用 ,采用酵母双杂交体系筛选与人calpain1大亚基相互作用的蛋白质 ,通过DNA序列测定及BLAST分析同源性 ,获得了阳性克隆 12 (pACT2 12 ) ,16 (pACT2 16 ) ,2 2 (pACT2 2 2 )和 37(pACT2 37)等 .12和 2 2分别与人心脏α肌动蛋白 (humancardiacmusclealpha actin ,ACTC)有 99%和 10 0 %同源性 .16和 37分别与人心脏的肌球蛋白结合蛋白C(humancardiacmyosin bindingproteinC ,MYBPC3)和人α2 辅肌动蛋白 (humancardiacalpha 2actinin ,ACTN2 )有 10 0 %同源性 .这些阳性克隆均属于心脏中心肌细胞的结构蛋白 ,参与心肌细胞的收缩运动 .为鉴定calpain1大亚基的哪些结构域可能参与这些相互作用 ,阳性克隆再分别与含有人calpain1大亚基结构域Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的诱饵质粒共同转化AH10 9进行酵母双杂交 ,发现pACT2 12(ACTC)和pACT2 16 (MYBPC3)均能与全长人calpain1大亚基的结构域Ⅱ和Ⅲ相互作用 ;pACT2 16(MYBPC3)还能与大亚基的结构域Ⅳ作用 ;而pACT2 37(ACTN)虽能与全长人calpain1大亚基作用 ,却不与其单独的结构域Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ发生作用 .定量分析阳性克隆与人calpain1大亚基作用的强弱的结果显示 ,pACT2 12、16或 37分别与诱饵质粒pGBKT7 CANP共同转化AH10 9后     

霍乱毒素对三氟氯氰菊酯抗性及敏感棉铃虫神经细胞L型钙通道的调节作用

霍乱毒素（CTX）可激活兴奋性异三聚体G蛋白（Gα_s）的α-亚基和刺激电压门控L-型钙通道,而昆虫的L-型钙通道可能是拟除虫菊酯类杀虫剂的作用靶点。为进一步探讨农业害虫对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗药性的作用机理,我们检测了CTX对三氟氯氰菊酯抗性及敏感棉铃虫Helicoverpa armigera中枢神经细胞电压门控L-型钙通道的调节作用。分别急性分离三氟氯氰菊酯抗性及敏感的3～4龄棉铃虫幼虫胸腹神经节细胞,并在改良的L15培养基（加入或未加入700 ng/mL的CTX）中培养12～16 h。钡离子为载流子,应用全细胞膜片钳技术记录电压门控L_型钙通道电流。结果显示,CTX可使敏感组棉铃虫神经细胞L-型钙通道的峰值电流密度增大36％、峰值电压左移5 mV,但对抗性组棉铃虫神经细胞L-型钙通道无上述作用。并且,CTX对敏感组及抗性组棉铃虫神经细胞L_型钙通道的激活电位、翻转电位、激活曲线和失活曲线等其他一些参数的影响也不明显。在无CTX作用时,所检测到的抗性组与敏感组棉铃虫神经细胞L_型钙通道的上述参数值间差异不显著。结果提示,棉铃虫神经细胞内存在Gs腺苷酸环化酶(AC)-cAMP-蛋白激酶A (PKA)-L-型钙通道信号调节系统;与敏感棉铃虫神经细胞L-型钙通道相比,三氟氯氰菊酯抗性棉铃虫神经细胞L-型钙通道的活性相对不易受到CTX调节,这可能与昆虫对拟除虫菊酯产生抗药性的机理有关。     

高等植物中LINC复合体的研究进展（英文）

在高等植物中发现了含SUN (Sad1/UNC84)结构域的蛋白质At SUN1和At SUN2后,人们发现了核骨架和细胞骨架复合物的连接体LINC (linker of nucleoskeleton and cytoskeleton)。虽然一些关键成分和相互作用还不清楚,但SUN结构域蛋白质在所有植物中高度保守。植物SUN结构域蛋白和新发现的KASH (Klarsicht/Anc/Syne-1)同源蛋白是构成植物LINC复合体的关键成分。WIPs (WPP域相互作用蛋白质)锚定在外核被膜(outer nuclear envelope,ONE)上。植物KASH蛋白的C末端锚定在植物核周质上。与opisthokonts中的PPPX相比,WIPs在C端具有高度保守的X-VPT序列。本文综述了近十年来连接植物内核膜和外核膜的相关植物核膜蛋白的研究进展。     

昆虫钠离子通道的研究进展

昆虫只有一个或两个电压门控钠离子通道α亚基基因,但两种转录后修饰(选择性剪切和RNA编辑)实现了昆虫钠离子通道的功能多样性.昆虫β辅助亚基TipE和TEH1-4在钠离子通道表达和调控中也起着重要作用.电压门控钠离子通道在动作电位的产生和传递中至关重要,是多种天然和人工合成神经毒素及杀虫剂的作用靶标,包括广泛使用的拟除虫...     

核糖体蛋白L11及其功能

核糖体蛋白L11(ribosome protein L11)是一种高度保守的蛋白质,是蛋白质合成过程中所必需的.L11由N-末端和C-末端两个结构域组成.L11的N-末端在蛋白质合成中作为分子开关,在多肽链的延伸阶段与延伸因子EF-G相互作用,对EF-G依赖的迁移过程是必需的;在肽链终止阶段与肽链释放因子RF1相互作用,对RF1识别终止密码子UAG的功能是必需的.L11上有一个与噻唑类(thiazole)抗生素结合的靶位点,这种结合会抑制依赖延伸因子的核糖体的活性.     

用酵母双杂交系统检测菠菜叶绿体ATP合酶CF1各亚基间的相互作用

将菠菜叶绿体ATP合酶CF1的5种亚基基因分别插入到质粒pGBT9和pGAD424,双转化入酵母菌株,用酵母双杂交系统检测菠菜叶绿体CF1各亚基间的相互作用.结果显示CF1的5种亚基中,γ与ε亚基有较强的相互作用;α与β,α与ε,β与ε,β与δ亚基间也有稳定的相互作用;γ与δ,δ与ε亚基间有微弱的或短暂的相互作用;而α与γ,α与δ,β与γ等亚基间在酵母双杂交系统中没有相互作用.这些结果有助于研究ATP合酶在催化过程中的结构变化和亚基间的相互关系.     

蛋白质棕榈酰化对离子型谷氨酸受体运输的调节作用

棕榈酰化是一种可逆的翻译后修饰,其对蛋白质的定位和功能具有重要的调节意义.离子型谷氨酸受体有N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体、α-氨基羟甲基恶唑丙酸(AMPA)受体和人海藻酸受体.近期研究发现,它们的棕榈酰化修饰对其膜表面分布和内化均具有重要的意义.其中NMDA受体在其C末端有2个不同的棕榈酰化位点.1个位于C末端近膜区(CysclusterⅠ),它的棕榈酰化可以增高酪氨酸的磷酸化水平,增加受体膜表面分布,影响神经元中NMDA受体的组构性内化;另1个位于C末端中部(CysclusterⅡ),它受到蛋白质酰基转移酶GODZ的调节,使得受体在高尔基体大量积聚,从而影响受体的膜表面分布.与NMDA受体相似,AMPA受体也存在2个棕榈酰化位点.1个位于在第2跨膜域,受蛋白质酰基转移酶GODZ的调节,能导致AMPA受体在高尔基体的积聚.另1个位点在受体C末端近膜区,它的棕榈酰化能降低AMPA受体和4.1N蛋白的相互作用,并调节受体的内化.这两种离子型谷氨酸受体在棕榈酰化机制上虽然存在差异,但均对受体的运输、膜表面分布和内化具有十分重要的作用.     

电压门控钠离子通道β4亚基的研究进展

电压门控钠离子通道由一个功能性的α亚基孔道蛋白和几个起辅助作用的β亚基组成。已知的4种β亚基共同调节钠离子通道的功能,并且在控制神经兴奋性、细胞黏附、迁移等方面发挥重要作用。其中β4亚基是钠离子通道的阻遏蛋白,可以诱导产生复苏电流。当β4亚基在基因或蛋白质水平表达异常时,会导致多种疾病的发生,如神经退行性疾病、长QT综合征等。我们简要综述了β亚基的结构与功能、各β亚基之间的关系、β亚基异常表达与相关疾病,以及β亚基与钠通道抑制剂的相互作用,并对β4亚基的研究发展方向予以评述。     

电压门控钠离子通道β亚基的研究

电压门控钠离子通道对Na+的选择性通透是神经元等兴奋性细胞产生动作电位的基础。该通道为跨膜蛋白,主要是由形成孔道的α亚基和一个或几个辅助性的β亚基组成,近年来发现,β亚基对α亚基的调节主要是在调节钠通道的膜上表达和亚细胞定位方面。由于β亚基的突变不仅能够引起动作电位的传导异常,导致神经元功能障碍,引发多种心脏系统疾病,包括恶性心律失常、Brugada综合征、QT间期延长综合征及其他传导性疾病,还能引起亨廷顿病(Huntigton’s diaease,HD)等神经系统疾病。本文就近几年钠离子通道β亚基生理功能的研究及其突变体与疾病的关系等方面作一阐述。     

离子通道受其辅助亚基及外源性毒素调控的作用机制

离子通道是一类位于细胞膜上的跨膜蛋白,可以在电压、配体结合或机械力的作用下开放或关闭,并允许特定离子通过其跨膜孔道进出细胞.辅助亚基是一类单次跨膜或两次跨膜蛋白,可以与离子通道α亚基相互作用,改变其膜上表达量、电导特性等,同时会影响通道对药物的敏感性.动物毒素是一类含二硫键的多肽,可以选择性结合到离子通道特定位点上,产生抑制激活、延缓失活或异常开放等不同通道特性的改变.本文就近年来本实验室在离子通道受其辅助亚基及外源性毒素调控的作用机制研究方面的进展进行简要综述.     

胰岛素受体结构与功能研究概况

胰岛素受体(IR)是由两个α-亚基和两个β-亚基构成的跨膜糖蛋白。α-亚基位于细胞表面,是胰岛素结合区域。β-亚基的1/3也位于细胞表面,其余2/3则跨膜并插入胞浆中,后者是IR的活力区域,具有受胰岛素调节的酪氨酸蛋白激酶活性,此活性受多位点磷酸化的调节并表现出变构酶行为。不同组织的IR在分子结构,化学性质和生理功能上均有差异,其中脑IR代表了IR的一个结构和功能亚型。IR的生物合成类似于胰岛素的生物合成。     

百日咳毒素对棉铃虫神经细胞电压门控钠、钙通道的调节作用

用膜片钳技术研究了百日咳毒素对离体培养的棉铃虫幼虫中枢神经细胞电压门控钠、钙通道的影响。结果表明,对照组细胞钠通道在-50～-40mV激活,在-20mV左右电流达到最大值,在记录的20min内、电流．电压关系曲线(I-V)和电流幅值未有明显变化;细胞与百日咳毒素预孵后,钠通道在-40mV左右激活,电流在0mV左右达到最大值,在记录过程中,激活电压和峰值电压继续向正方向移动约10mV、电流持续下降。对照组钙通道在-40～-30mV激活,在0mV左右电流达峰值;经百日咳毒素处理后,I-V曲线向负电位方向移动约10mV,在记录过程中,I-V曲线继续向负电位方向移动,电流的衰减(rundown)现象比对照组严重．此外,百日咳毒素处理引起钙电流达到峰值的时问显著延长。结果提示,百日咳毒素敏感的G蛋白(Gi)可能通过直接途径或间接途径调节棉铃虫神经细胞钠、钙通道的电压敏感性和开放几率以及钙通道由备用态向激活态转化的速度。同时,经百日咳毒素处理后钠通道的,I-V曲线与抗性棉铃虫I-V曲线非常相似,可能暗示Gi蛋白在棉铃虫抗药性形成中发挥作用。     

抗α2δ1抗体/NanoLuc融合蛋白的制备及其特性初步验证

肿瘤干细胞的存在被认为是肿瘤耐药和复发转移的根本原因,因此研发肿瘤干细胞的活体标记示踪技术动态监测该类细胞的存在具有重要的科学价值。实验室前期发现电压门控钙离子通道α2δ1亚基是肝细胞癌干细胞的特异表面标志物,文中研究探讨利用针对α2δ1的单克隆抗体1B50-1的单链可变域与新型荧光素酶NanoLuc形成融合蛋白1B50-1scFv-NanoLuc,在体外验证其对α2δ1阳性肝癌细胞结合的特性和荧光素酶活性。1B50-1scFv和NanoLuc序列通过重叠PCR技术扩增获得1B50-1scFv-NanoLuc的融合片段,并在C端添加Flag标签肽 (命名为1B50-1scFv-NanoLucFlag),然后采用常规DNA克隆技术将融合片段克隆到真核表达载体。利用聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI) 将1B50-1scFv-NanoLucFlag真核表达载体转染至悬浮型人胚肾293细胞 (FreeStyle 293F)。蛋白免疫印记实验证明融合蛋白在FreeStyle 293F细胞培养上清中表达,其分子量约为50 kDa。融合蛋白经ANTI-FLAG? M2亲和层析柱纯化后,经流式细胞仪法测定融合蛋白1B50-1scFv-NanoLucFlag对高表达α2δ1的Hep-12肝癌细胞具有高亲和活性。进一步,1B50-1scFv-NanoLucFlag与高表达α2δ1的肝癌细胞结合后显示出强的荧光素酶活性。这些结果表明融合蛋白1B50-1scFv-NanoLucFlag可用于α2δ1阳性肝癌干细胞的标记并可通过荧光素酶化学发光法进行示踪。