PRRSV NADC30-like SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法的建立与应用

为建立高效快速的PRRSV NADC30-Like毒株荧光定量PCR(SYBR Green real-time PCR)检测方法,根据NADC30毒株Nsp2基因保守序列设计特异性引物,通过优化确定最佳反应条件,并进行灵敏度、特异性、重复性实验以及临床样品的检测。结果显示,标准品在10~7 copies/μL到10~2 copies/μL浓度范围内具有良好的线性关系,最低检测浓度为2.25×10~1 copies/μL;该方法与HP-PRRSV、PCV、PEDV、TGEV、PRV、CSFV、PoRV无交叉反应,批内和批间的变异系数(CV)小于1.9%,在临床样品的检测中较普通PCR有更高的检出率。建立了PRRSV NADC30-Like毒株荧光定量PCR检测方法,具有敏感性高、特异性强、稳定性好、准确度高和检测快速等优点,可用于PRRSV NADC30-Like感染的早期诊断、样品的快速检测与定量分析。     

SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR检测犬瘟热方法的建立和应用

根据GenBank发表的犬瘟热病毒(CDV)的F基因序列,经过分析在F片段的保守区域内设计引物,建立了SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR检测CDV的方法,并通过对厦门市宠物医院收集的临床发病和疑似发病的犬病料(包括眼分泌物、鼻拭子、唾液、血液、尿液等)的检测,结果表明,本研究建立的快速检测CDV的SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点,值得推广应用.     

SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测埃博拉病毒方法的建立

为了建立一种快速准确的检测埃博拉病毒(EBOV)亚型的方法。本研究根据GenBank中公布的EBOV NP基因序列,通过设计引物和优化反应条件,建立了一种SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法检测EBOV。以体外转录的EBOV RNA为模板进行试验,该方法检测的灵敏度可以达到1.0×102个拷贝/μL,检测范围达到9个数量级为102～1010,可检测5种亚型EBOV。建立的方法对马尔堡病毒(MARV)、登革病毒(DENV)、新疆出血热病毒(XHFV)、乙型脑炎病毒(JEV)、流感病毒(H1N1和H3N2)和猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)E基因组RNA无非特异性扩增。本文将荧光定量RT-PCR技术用于埃博拉病毒的定量检测中,并且建立了EBOV SYBRGreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法。     

水貂肠炎病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

根据Gen Bank登录的水貂肠炎病毒(MEV)VP2蛋白基因的保守序列设计了1对特异性引物,经PCR扩增出146bp的目的片段,并克隆到pMD 18-T载体上,提取重组质粒经PCR及测序鉴定正确后,以10倍梯度稀释质粒作为阳性标准品,绘制荧光定量标准曲线,以此建立一种基于SYBR Green荧光染料的定量PCR特异性检测水貂肠炎病毒的方法。结果表明:该方法对MEV有很好的特异性,检测灵敏度为34拷贝/μL,且重复性试验变异系数均小于2%。临床检测中,在80份样品中检测到30份阳性样品,高于普通PCR和电镜观察方法的检出率。该方法的建立实现了对MEV临床早期快速诊断和定量分析,为毛皮动物MEV的防控提供了可靠的检测方法。     

杀鲑气单胞菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中杀鲑气单胞菌铁载受体(ferric siderophore receptor,fst A)基因序列设计并合成一对特异性引物,经过反应体系优化后建立了检测杀鲑气单胞菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。将fst A基因克隆到p MD18T载体上构建重组质粒pMD18T-fst A并制备标准曲线,结果显示该标准曲线的线性关系良好,扩增所得标准曲线为y=-4.255 2x+39.644,相关系数R2为0.988;熔解曲线分析显示产物为单一的特异峰。特异性检测结果表明,该方法对杀鲑气单胞菌及其亚种具有良好的特异性,与其他细菌不发生交叉反应;最低检测限为35拷贝/μL,较常规PCR的灵敏度高出约100倍。应用建立的方法对人工感染的虹鳟病样进行了检测,待检样品均呈阳性反应,表明该方法具有很好的适用性。研究表明,所建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点,可用于杀鲑气单胞菌的快速诊断及定量检测。     

猪细胞因子SYBR Green实时PCR检测方法的建立

目的:建立一种用SYBR Green荧光染料检测猪细胞因子的实时PCR方法。方法:从猪外周血淋巴细胞中提取细胞因子mRNA,反转录成cDNA,利用SYBR Green荧光染料法实时检测IL8、IL10、IFNα、IFN(?)和TNFα的mRNA表达水平。分别通过融解曲线和琼脂糖凝胶电泳分析各细胞因子检测的特异性;并对各细胞因子PCR产物进行梯度稀释后作为模板进行敏感性试验;利用建立的方法分别对正常猪和感染PRRSV的猪的外周血淋巴细胞中上述细胞因子进行检测,并以管家基因cyclophilin为内参照对各细胞因子进行定量分析。结果:建立的各细胞因子SYBR Green实时检测方法具有良好的特异性和敏感性,TNFα检测敏感性可达10个拷贝,其它细胞因子检测敏感性均可达100个拷贝。猪在感染PRRSV后,外周血淋巴细胞中IL8和IL10明显增加,而IFNα和TNFα略有下降。结论:建立了五种猪细胞因子SYBR Green实时PCR检测方法,并能成功地应用于临床检测。     

SYBR Green I荧光RT-PCR检测犬瘟热方法的建立和应用

根据GenBank发表的犬瘟热病毒（CDV）的F基因序列,经过分析在F片段的保守区域内设计引物,建立了SYBR Green I荧光RT-PCR检测CDV的方法,并通过对厦门市宠物医院收集的临床发病和疑似发病的犬病料（包括眼分泌物、鼻拭子、唾液、血液、尿液等）的检测,结果表明,本研究建立的快速检测CDV的SYBR Green I荧光RT-PCR方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点,值得推广应用。     

人4型腺病毒拷贝数SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法的建立

目的:建立检测人4型腺病毒拷贝数的荧光定量PCR方法。方法:提取本实验室构建的4型腺病毒全基因组质粒,以梯度稀释质粒为标准模板,选取人4型腺病毒六邻体区域基因设计一对特异性引物,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线。结果:标准曲线为y=-4.284x+53.468,由全基因组质粒所构建的标准曲线线性关系良好,扩增反应Ct值与拷贝数的对数呈线性关系(R2=0.999 609),检出敏感度可达1×102拷贝/μL,且与其他几种腺病毒无交叉反应。用该方法检测4型腺病毒感染细胞2、12和24 h后的病毒拷贝数,其病毒拷贝数随时间增加,与细胞病变(CPE)变化保持一致,且荧光定量PCR的测量结果稳定(变异系数6%)。结论:建立了检测人4型腺病毒基因拷贝数的荧光定量RT-PCR方法,该方法灵敏度高、特异性强。     

洪湖碘泡虫SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

洪湖碘泡虫(Myxobolus honghuensis)引起的鲫“喉孢子虫病”严重危害我国异育银鲫养殖。病原丰度是决定病害发生的最重要因素之一, 因此建立洪湖碘泡虫的定量检测方法, 不仅可用于异育银鲫“喉孢子虫病”的早期诊断, 也可应用于养殖系统中洪湖碘泡虫的定量监测, 为该病的暴发风险预警及防控措施的效果评价提供技术手段。研究根据洪湖碘泡虫的ITS基因序列, 设计合成一对特异性引物HHF/R, 建立了洪湖碘泡虫的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法, 并对该方法的特异性、灵敏性、重复性及应用性进行了验证。结果显示, 该方法能特异性检测出洪湖碘泡虫, 而与多涅茨尾孢虫、倪李碘泡虫、普洛宁碘泡虫、吴李碘泡虫之间无交叉反应; 最低检测限为3.02×101copies/μL, 灵敏性较常规PCR高出1000倍; 组内和组间重复性试验的变异系数均小于2%。应用该方法可定量检出洪湖碘泡虫全生活史阶段, 包括鱼体内移行发育的前孢子阶段及养殖系统环境, 如池塘水样及底泥样品中分布的洪湖碘泡虫。因此, 所建立的洪湖碘泡虫SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性稳定, 可应用于异育银鲫全养殖阶段洪湖碘泡虫的定性、定量监测。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR测定猴免疫缺陷病毒RNA拷贝数方法的建立

目的 建立SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数.方法 巢式RT-PCR扩增SIV病毒RNA gag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEM T载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒.该质粒经限制性内切酶Not I酶切后,进行体外转录,转录出的RNA产物(RS)纯化后10倍系列稀释,作出标准曲线,作为SIV病毒RNA荧光定量检测的外标准品.结果 应用Qiagen公司QuantiTect SYBR GREEN RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100 copies/μL.结论 制备的RS外标准品纯度高,SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数.     

SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR法检测贝类中的诺如病毒

针对诺如病毒II型的保守区域设计引物,建立了SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测诺如病毒II型的反应体系。此方法的病毒检测下限达到102拷贝,标准曲线的线形范围为102~106拷贝,相关系数为0.9952,斜率为?2.982,截距为35.84。对诺如病毒II型检测特异,与轮状病毒、腺病毒、甲肝病毒、星状病毒无交叉反应。针对质粒标准品检测的批内试验变异系数(CV)为0.95%~1.69%(n=5),批间试验CV为0.87%~1.24%(n=3)。运用此方法随机检测30份贝类水产品,检测出2份阳性样品。结果表明,SYBR Green I荧光RT-PCR检测诺如病毒II型的方法灵敏、特异、重复性好,可应用于贝类水产品的快速检测。     

NADC30-like猪繁殖与呼吸综合征病毒样颗粒的制备与鉴定

【背景】猪繁殖和呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)可以造成怀孕母猪的繁殖障碍及仔猪的呼吸系统疾病,近年来,NADC30-like谱系PRRSV已成为国内的优势流行毒株。【目的】研制针对NADC30-like谱系PRRSV的病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗。【方法】将PRRSV NADC30-like毒株编码GP5蛋白开放阅读框5(open reading frame 5,ORF5)、ORF6(编码M蛋白)分别连接至pFastBac^TMDual载体P₁₀和P_H启动子下游多克隆位点,获得穿梭质粒pFB-30-ORF5及pFB-30-ORF6,酶切鉴定后,将ORF6基因插入到穿梭质粒pFB-30-ORF5 P_H启动子下游,构建穿梭质粒pFB-30-ORF5-OPF6。将上述3种穿梭质粒分别转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选及PCR鉴定重组杆粒。再将获得的重组杆粒转染至SF9昆虫细胞,发现细胞病变后收获病毒液,继续盲传3代,在透射电镜下观察是否有病毒样颗粒。用第3代病毒液感染SF9细胞后,分别用GP5蛋白、His-tag、Flag-tag单克隆抗体作为一抗,通过免疫电镜、间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)、Western blotting鉴定重组蛋白。【结果】成功构建了3种穿梭质粒pFB-30-ORF5、pFB-30-ORF6和pFB-30-ORF5-OPF6,酶切鉴定正确。通过蓝白斑筛选及PCR验证后获得重组杆粒,分别命名为Bacmind-30-ORF5、Bacmind-30-ORF6和Bacmind-30-ORF5-ORF6。重组杆粒感染SF9细胞120h时出现明显的细胞病变,收获病毒液后,在透射电子显微镜可观察到大小为50nm左右呈现球形结构的VLPs。免疫电镜可以观察到胶体金颗粒结合在VLPs周围;IFA结果显示实验组均出现了明显绿色的特异性荧光灶;Western blotting结果表明,3种VLPs均出现特异性条带,并与预期大小一致。【结论】制备了3种NADC30-like谱系PRRSV的病毒样颗粒,为针对PRRSV新谱系流行株疫苗的研发奠定了基础。     

腐皮镰刀菌SYBR Green实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的建立一种能够快速、灵敏、特异的鉴定腐皮镰刀菌的SYBR Green实时荧光定量PCR。方法运用SYBR Green实时荧光定量PCR反应体系检测腐皮镰刀菌,并对此方法的特异性、灵敏度和稳定性进行评价。结果通过对45例样品的检测,结果显示SYBR Green实时荧光定量PCR特异性好,其检出率高于普通PCR;灵敏度高,对重组质粒标准品的检测灵敏度为1.0×10~2copies/μL;稳定性好,对质粒为1.0×10~7copies/μL、1.0×10~5copies/μL、1.0×10~3copies/μL的标准品重复检测10次,结果显示扩增反应Ct值的变异系数为0.96%~1.68%。结论SYBR Green实时荧光定量PCR检测腐皮镰刀菌,不仅特异性好,灵敏度高,稳定性好,而且简便、快速、易操作。     

黄颡鱼小RNA病毒qPCR检测方法的建立与应用

黄颡鱼小RNA病毒（Yellow catfish Picornavirus,YCPrV）是黄颡鱼重要的致死性病原,本研究旨在建立一种快速、精准的YCPrV检测方法。基于YCPrV 22426-8毒株RdRp基因编码区序列设计特异性引物和探针,通过质粒标准品和标准曲线的制作,反应体系和反应条件的优化,灵敏度和特异性的测试,建立一种检测YCPrV的TaqMan荧光定量PCR(qPCR)方法。结果显示,在绘制的qPCR标准曲线中,拷贝数与Ct值具有良好的线性关系,相关系数（R2）为0.9974,扩增效率为88.98%,最高检测灵敏度为5.09×100拷贝。该方法对来自黄颡鱼、鲫鱼、鲤鱼和虾的其它8种病毒无扩增信号,仅YCPrV具有扩增曲线,对临床样品阳性检出率比普通PCR高12.28%。自然感染黄颡鱼组织中YCPrV检测结果发现,病毒载量从高到低依次为肠、肾、心、肝、脾、鳃和脑。以上结果表明,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏度和可重复性,临床检测YCPrV时,建议优选肾和心作为检测靶标组织。YCPrV qPCR方法的建立,可为YCPrV的精准定量检测和疾病...     

土壤中棉花黄萎病菌SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR定量检测技术研究

为实现田间土壤棉花黄萎病菌的早期检测,建立了土壤中棉花黄萎病菌的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法.以含342bp PCR扩增产物的阳性质粒为参考,构建了标准曲线,并对该曲线的特异性、敏感性、可重复性进行了评价.结果表明,该方法具有快速、特异性强、敏感度高等特点.检测范围在3.8×103-3.8×108cop...     

土壤中棉花黄萎病菌SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR定量检测技术研究

为实现田间土壤棉花黄萎病菌的早期检测,建立了土壤中棉花黄萎病菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。以含342bp PCR扩增产物的阳性质粒为参考,构建了标准曲线,并对该曲线的特异性、敏感性、可重复性进行了评价。结果表明,该方法具有快速、特异性强、敏感度高等特点。检测范围在3.8×103-3.8×108copies/μL之间有良好的线性关系,相关系数R2为0.996,扩增效率为101.5%,灵敏度比常规PCR方法高102倍。     

山羊IL-2基因SYBR GREEN Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立山羊IL-2基因SYBR GREENⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法,根据Gen Bank中山羊IL-2基因(登录号:KT934548),设计1对特异性引物,用于扩增目的基因,并将目的基因克隆于p MD-19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α,经质粒PCR及序列测定鉴定后获得阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GREENⅠRTFQ-PCR标准曲线和溶解曲线,进行特异性、重复性和敏感性试验。并应用所建立的方法,检测Con A刺激健康山羊PBMC后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h和48 h不同时间点IL-2基因转录的动态变化。结果表明,当质粒标准品稀释度在7.2×10~9~7.2×10~5 copies/μL扩增曲线的Ct值与浓度间具有良好的线性关系,相关系数为-0.996;熔解曲线为特异性单峰,组内变异系数为0.306%~1.458%,组间变异系数为0.514%~1.191%,最低检测限为7.2×10~2 copies/μL。山羊IL-2基因的mRNA转录量在0~2 h呈现上升趋势,在2 h达到峰值,2~6 h呈现下降趋势。6~12 h未能检测到IL-2基因的mRNA转录;12~48 h检测到IL-2基因的mRNA转录量呈逐渐上升趋势。研究结果将为山羊IL-2基因的定量分析提供技术平台。     

miRNA qPCR检测方法研究进展及其应用

miRNA是目前国际研究的热点领域之一,而miRNA表达检测是miRNA研究的基础内容。针对miRNA序列短小的特点,开发出了多种检测方法,其中miRNA qPCR定量检测是应用最广泛的方法。就miRNA抽提,miRNA qPCR定量检测原理及miRNA qPCR定量检测流程包括引物设计、反应体系设置、内参基因筛选等方面进行了深入探讨,并对miRNA定量检测研究方法的发展趋势进行了展望,以期为研究者进行miRNA qPCR定量检测提供参考。     

PRRSV血液抗体间接ELISA检测方法的建立

中国动物卫生与流行病学中心陈义军与扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室彭长凌等科研专家用亲和层析纯化的猪繁殖与吸人综合征病毒PRRSV重组核衣壳蛋白GST-N作为诊断抗原,建立检测PRRS血清抗体的间接ELISA方法。抗原最佳包被量为每孔400ng,待检血清最佳稀释度为1：100,