弹性蛋白样生物材料的制备及性质鉴定 *

组织工程器官重建因不同的用途而对材料的弹性、刚度、生物活性等有一系列的需求,但当前所应用的材料多难以同时满足,例如弹性材料聚乙二醇双丙烯酸酯等高分子材料并不具备较高的生物活性,而生物材料胶原等生物活性好而弹性较差。弹性蛋白(elastin)作为广泛存在于动物体内的一种弹性极佳的功能蛋白,因其可承受较大形变而不破坏本身结构,故应用于弹性器官的组织工程重建中。为获得高生物活性的弹性蛋白样多肽(elastin-like polypeptides,ELP),根据其基本重复单元Val-Pro-Gly-Xaa-Gly设计了氨基酸序列,并进行优化,构建成原核表达质粒,通过大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行诱导表达并收集,SDS-PAGE鉴定。通过流变检测、扫描电镜检测、细胞活性检测等方法鉴定材料的弹性性能、物理结构及生物活性,为下一步通过调整交联方法提高其弹性提供了材料,也为ELP作为生物材料应用于组织工程器官重建奠定了基础。     

自组装ELP多肽的从头设计及其在生物医药领域中的应用进展

重组类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptides,ELPs)是一种通过基因工程方法合成的多肽聚合物,其结构由类弹性蛋白的肽段单元重复串连组成,具有刺激响应性、自组装特性、显著的弹性和良好的生物学特性,如低血小板黏附性和低免疫原性等,因此ELPs材料已被广泛应用于组织工程、药物输送和纳米生物器件制备...     

ELP[Ⅰ]50标签在重组硫氧还蛋白分离纯化中的应用及PEG对其相变温度的影响

[目的]使用自行设计的类弹性蛋白(Elastin-like protein,ELP) ELP[Ⅰ]50作为非色谱纯化标签,分离纯化重组硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx),并研究聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)对ELP[Ⅰ]50-Trx相变温度(Inverse temperature transition,Tt)的影响.[方法]人工合成Trx基因,将其亚克隆到自行构建的表达载体pET28编码ELP[Ⅰ]50标签下游,转入大肠杆菌BLR(DE3)进行表达.融合蛋白表达后,采用可逆相变循环(Inverse transition cycling,ITC)分离纯化,并检测不同浓度PEG时的Tt值.[结果]成功表达、分离纯化出融合蛋白ELP[Ⅰ]50-Trx,检测出该蛋白浓度为25 μmol/L时,Tt为28.6℃;而当PEG的浓度为5％、10％、15％、20％时,Tt分别降至22.3℃、15.9℃、6℃、0℃.[结论]ELP[Ⅰ]50标签高效纯化重组蛋白具有操作简便、成本较低、易于扩大的优势,而PEG能降低蛋白的Tt值,进一步增强分离纯化效果,扩大使用范围,可望应用于分离纯化多种重组蛋白.     

ELP[I]50标签在重组硫氧还蛋白分离纯化中的应用及PEG对其相变温度的影响

【目的】使用自行设计的类弹性蛋白(Elastin-like protein, ELP) ELP[I]50作为非色谱纯化标签, 分离纯化重组硫氧还蛋白(Thioredoxin, Trx), 并研究聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)对ELP[I]50-Trx相变温度(Inverse temperature transition, Tt)的影响。【方法】人工合成Trx基因, 将其亚克隆到自行构建的表达载体pET28编码ELP[I]50标签下游, 转入大肠杆菌BLR(DE3)进行表达。融合蛋白表达后, 采用可逆相变循环(Inverse transition cycling, ITC)分离纯化, 并检测不同浓度PEG时的Tt值。【结果】成功表达、分离纯化出融合蛋白ELP[I]50-Trx, 检测出该蛋白浓度为25 μmol/L时, Tt为28.6 °C; 而当PEG的浓度为5%、10%、15%、20%时, Tt分别降至22.3 °C、15.9 °C、6 °C、0 °C。【结论】ELP[I]50标签高效纯化重组蛋白具有操作简便、成本较低、易于扩大的优势, 而PEG能降低蛋白的Tt值, 进一步增强分离纯化效果, 扩大使用范围, 可望应用于分离纯化多种重组蛋白。     

疏水性ELP基因设计与基因库构建

[目的]设计合成疏水性类弹性蛋白(Elastin-like polypeptide,ELP)基因,建立ELP基因库.[方法]选择疏水性最强的异亮氨酸(I1e,I)(疏水参数:4.5)取代ELP五肽重复序列单元(缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-客座氨基酸-甘氨酸,VPGXG)中客座残基X.全基因合成一段含编码(VPGIG)10序列,上游含Dra Ⅲ酶切位点、下游含BglⅠ酶切位点的ELP单元.将Dra Ⅲ和BglⅠ设计为一对同尾酶(Isocaudarner),利用这对同尾酶定向克隆(Recursive directional ligation,RDL)一系列不同拷贝数的ELP基因.为鉴定基因库有效性,随机选取库中ELP[Ⅰ]50基因进行蛋白表达、纯化并测定其相变温度(Inverse temperature transition,Tt).[结果]建立了ELP[Ⅰ]n(n=10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120)基因库.测定ELP[Ⅰ]50的Tt为24.3℃.[结论]首次单独选用I1e(I)作为ELP蛋白质标签中客座残基氨基酸,增加了ELP中疏水性氨基酸的含量,为进一步筛选出表达量高、Tt低、分子量小的ELP标签奠定基础.     

组织工程的一般考虑

组织工程的最终目标是通过体外增减活细胞与其胞外环境相互作用而发育成具胡生物活性的组织或器官替代物,替换、修复组织或器官,或强化其生物学功能。本文主要讨论细胞移植和组织重建的影响因素和可能的方法。     

高中综合实验设计——以"表达和纯化红色荧光蛋白标记的类弹性蛋白"为例

以类弹性蛋白(elastin-like polypeptide,ELP)作为非色谱纯化标签,分离纯化红色荧光蛋白 mCherry.ELP 与△ I-CM(intein cleavage mutant)的 N 端连接,mCherry 片段与△I-CM的C端连接,在ELP的N端插入GFP片段,用于检测蛋白纯度.采用低温诱导...     

聚乙二醇对ELP[I]40相变温度的影响

目的:研究聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)对类弹性蛋白(elastin-like protein,ELP)ELP[I]40相变温度(inverse temperature transition,Tt)的影响.方法:设计并合成ELP[I]40基因(由40个(VPGIG)五肽单元串联组成),表达纯化后,检测不同浓度PEG条件下ELP[I]40的Tt.结果:在ELP[I]40终浓度为25 μmol/L时,PEG浓度为5％,10％,15％,20％,25％时分别使Tt由29℃降至26.5℃,22℃,15.2℃,8.8℃,2.5℃.结论:PEG可降低ELP的Tt,可通过PEG促进ELP重组蛋白分离纯化.     

类弹性蛋白标签在大肠杆菌周质空间中表达研究

旨在研究类弹性蛋白[I]_(40)(elastin-like polypeptide[I]_(40),ELP[I]_(40))在大肠杆菌周质空间的表达。构建表达载体pIG6LH/ELP[I]_(40)及pIG6LH/ELP[I]_(40)+Trx,分别将构建的表达载体转化入表达宿主菌E.coli BLR(DE3),IPTG诱导表达,采用可逆相变循环(Inverse transition cycling,ITC)技术纯化蛋白。测定ELP[I]_(40)及ELP[I]_(40)+Trx蛋白相变温度(T_t),检测ELP[I]_(40)、ELP[I]_(40)+Trx蛋白浓度及NaCl对相变温度的影响。结果显示,经3轮ITC纯化得到了ELP[I]_(40)、ELP[I]_(40)+Trx蛋白。分别测定ELP[I]_(40)和ELP[I]_(40)+Trx在10、25、50、75和100μmol/L浓度下的T_t,其T_t依次为31.5℃、29℃、27℃、26℃、25℃和31.8℃、29.5℃、27.5℃、26℃、25.5℃;测定了不同浓度的NaCl对T_t影响,在ELP[I]_(40)和ELP[I]_(40)+Trx终浓度为25μmol/L,NaCl浓度为0.25、0.5、0.75、1.00和1.25 mol/L时,分别使ELP[I]_(40)的T_t由29℃降至24.5℃、22℃、19℃、15℃和11.5℃,使ELP[I]_(40)+Trx的T_t由29.5℃降至25℃、23℃、20.2℃、15.5℃和11.8℃。在大肠杆菌周质空间表达的ELP[I]_(40)与胞内表达的具有相同的理化性质,ELP可作为在大肠杆菌周质空间表达的蛋白质分离纯化标签。     

一种含ELP60基因的载体pRELPN促进大肠杆菌的外源基因的高表达

类弹性蛋白多肽（ELP）为含有人工合成的ELP60基因的表达载体pRELPN,能促使外源基因在大肠杆菌中的高表达。当ELP60在大肠杆菌表达载体pET28a的多克隆位点被克隆后,其自身的表达低,也不与目的基因构成ELP融合蛋白质,而是促进克隆在ELP60基因后的含起始密码ATG的外源目的基因独立高表达。外源目的基因表达量占宿主蛋白的20% ～ 60%,比用pET28a载体表达的外源基因表达量高2～10倍。此类表达载体pRELPN适合于表达包括抗体、抗原、酶、重组蛋白质、多肽及ELP融合蛋白质等的外源基因的独立高表达。这些结果表明,pRELPN代表了一种有效的表达载体,有助于解决在原核表达中,所受限的普通载体对外源基因低表达或不表达所导致的不能产业化的问题。     

连接肽对融合蛋白ELP[I]_(30)-linker-eGFP相变的影响

研究G4S和Poly N连接肽对融合蛋白ELP[I]30-linker-eGFP相变的影响.将编码两种不同连接肽G4S和Poly N的绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)基因克隆到pET28-ELP[I]30表达载体中,在宿主菌E.coli BLR(DE3)中经IPTG诱导表达ELP[I]30-linker-eGFP,通过可逆相变循环(inverse transition cycling,ITC)及镍柱亲和层析纯化ELP[I]30-linker-eGFP蛋白.结果显示,成功构建、表达具有活性的两种连接肽的融合蛋白ELP[I]30-linker-eGFP,连接肽G4S使融合蛋白产生不可逆相变,而Poly N不影响融合蛋白可逆相变,该研究对类弹性蛋白标签的应用具有指导意义.     

基于天然水凝胶的生物材料在骨组织工程中的应用*

天然水凝胶是指原材料来自于天然生物材料的水凝胶。由于这种天然的聚合物含有构成生物体的天然成分,与天然组织具有生物学和化学相似性,而受到特别关注。天然水凝胶由于其与细胞外基质高度的相似性被认为是骨组织工程中优良的仿生基质材料。而针对天然水凝胶机械性能差、成骨诱导性能弱等缺陷,通常需要对天然水凝胶进行改性、引入其他材料或生物活性因子,以此来获得更适用于骨组织工程支架材料。对近年来基于天然水凝胶的生物材料在骨组织工程的应用,与其不同的应用形式(可注射水凝胶、多孔水凝胶支架、3D生物打印水凝胶支架等)进行了概述,以期对这类基于天然水凝胶的生物材料在未来骨组织工程中的应用提供参考。     

组织工程的突破与挑战——组织工程国家工程中心科研进展

组织工程技术已被普遍认为是解决组织、器官缺损修复与功能重建的有效手段,它的飞速发展依赖于细胞学、材料学、工程学、临床医学等多学科的交叉渗透.作为组织工程的三大核心,种子细胞、生物材料、组织构建各方面的突破,为组织工程技术的发展奠定了基础.组织工程国家工程中心近年来围绕上述核心开展了系列研究,通过研究胚胎干细胞、成体干细胞、同种异体干细胞、以及发育同源细胞替代的探索,为解决种子细胞来源问题提供了多种选择;生物支架材料的开发,为细胞增殖分化、组织再生提供理想的支持与空间,而生物反应器的开发与应用,进一步提高了组织构建技术,为促进组织的体外形成、重塑和功能成熟创造了条件.在此基础上,开展了大动物体内组织构建和缺损修复的研究,形成了以应用为目标的研究特色,并成功将部分技术应用于临床治疗.本文将对组织工程国家工程中心已有进展做简单介绍并对面临的挑战进行分析.     

类弹性蛋白标签在重组蛋白分离纯化中的应用

类弹性蛋白(elastin-like polypeptide,ELP)是一种非常有前途的重组蛋白分离纯化标签.这种人工合成的蛋白质多肽是由五肽重复序列单元(VPGXG)串联组成,具有温度诱导的可逆相变特性.ELP与目的蛋白融合后,赋予重组蛋白相类似的可逆相变性质.多次可逆相变循环(inverse transition cycling,ITC)之后,就可以从蛋白溶液混合液中选择性地分离出ELP融合蛋白,再经特异性酶切或者改变环境条件引发内含肽发生自我剪切去除ELP标签,从而得到单一的目的蛋白,实现简单快速分离纯化重组蛋白.目前,该技术已成功应用于原核大肠杆菌和植物表达系统中.大肠杆菌表达ELP-绿色荧光融合蛋白的最高产量可达1.6 g/L.这种非色谱分离纯化重组蛋白的方法具有技术简单、操作快速、成本低、易于扩大等优点.重点从该技术的原理、技术路线以及发展方向进行综述.     

ECM支架与软骨修复

细胞外基质(extracellular matrix,ECM)支架是含有很多生物活性分子的天然生物材料,可以维持组织内稳态并诱导组织再生。ECM支架最大的优势是其可降解,且不会引起免疫排斥。目前,临床应用中ECM支架已经成功用于心血管、软骨组织等重建。软骨组织工程中,利用ECM支架进行修复的软骨组织具有结构稳定,低免疫原性,生物可降解及天然成分保留完整等优势特点。本综述回顾了ECM支架的来源、制备方案,评述了其在软骨组织修复中的优势与前景,有助于ECM支架在未来更好地应用。     

组织工程生物支架材料

组织工程支架材料表面的微观和亚微观结构对细胞的黏附与生长有很重要的影响,纳米结构材料的应用为该结构展现了较广阔的前景。另外,组织工程支架材料的表面修饰及孔径调控对生物材料的改进有很重要的作用。介绍了生物材料的基本要求和分类,纳米结构材料在组织工程中的应用及生物材料表面修饰,以及以泡沫支架为例介绍材料孔径调控。     

内皮祖细胞及其在组织工程中的应用

目前,组织工程化血管的构建和工程化组织器官的血管化因内皮种子细胞的扩增能力不足和生物活性不强而受到限制。内皮祖细胞(EPC)是内皮细胞的前体细胞。出生后,EPC主要存在于骨髓,可向外周血液缓慢释放,参与机体缺血组织的血管重建和损伤血管的重新内皮化。现对EPC的来源、分布、表型特征、动员、分化、归巢、分离、培养与鉴定等生物学特性和EPC在组织工程中的应用进行了全面的综述,并指出目前存在的问题和研究方向。     

明胶微球在骨组织工程中的应用

骨组织工程通过联合利用种子细胞、生物活性因子和支架材料等要素来构建骨组织再生微环境,从而促进骨缺损的修复重建来诱导骨再生。明胶微球具有多孔性、生物降解性、生物相容性及生物安全性等优势,是一种极具应用潜能的骨修复材料。明胶微球用于体外培养种子细胞时可实现高效扩增。多官能团结构使其可作为促血管再生因子、促骨再生因子及抗感染因子等多种药物的递送载体,缓释药物的同时也可实现微球的多功能化。在构建明胶微球支架时与其他生物材料复合及血管化性能的赋予可提高支架材料的综合性能,但目前支架的设计还存在如何兼顾材料多孔结构和力学性能的问题。本文主要综述了明胶微球的常见制备技术及其近年来在骨组织工程中的应用,并对未来的发展前景进行展望。     

骨生物材料通过细胞途径降解的研究进展

生物材料作为移植物已广泛应用于骨组织修复,在应用生物材料时需要考虑材料各个方面的性能,如生物兼容性、力学强度、可塑性等。材料的可降解性也是骨修复材料不得不考虑的方面。既往研究表明,生物材料可以通过物理、化学和生物三种方式进行降解。在材料的生物降解过程中,经细胞途径降解是其中重要的一环。这种降解途径主要是通过巨噬细胞、破骨细胞的生物学行为及其所分泌的生物活性氧、酶、酸性代谢物等作用机制进行。认识细胞作用对生物材料的降解有助于更好地理解细胞的生物学行为,精准设计、制造更合理的骨修复材料,既利于材料植入时的初始稳定,也可以符合材料降解与新骨形成的匹配,促进骨再生和骨修复。     

重要生命器官组织工程研究进展

<正>重要生命器官的丧失或功能障碍是人类健康面临的主要危害之一。传统的治疗方法通常很难有效地达到治疗目的,而器官移植不但费用昂贵且供体资源少,无法作为常规治疗手段。重要生命器官组织工程的发展为治疗该类疾病提供了新的有效途径。近年来,随着生物材料和干细胞等相关技术的迅速发展,重要生命器官组织工程研究也相继取得一系列突破,并在其相关产品的产业化方面已也获得了一定的进展。文章综述了国内外重要生命器官组织工程研究最新进展及相关的产业化情况,可望为重要生命器官组织工程的研究和产业化发展提供一定的参考。