应用聚合酶链式反应扩增和光敏生物素标记的cDNA探针检测马铃薯纺锤块茎类病毒

以含马铃薯纺锤块茎类病毒(potato spindle tuber viroid,PSTV)RNA的总核酸为模板,加入人工合成的互补DNA引物,用反转录酶合成PSTV cDNA;在聚合酶链式反应系统中,用两个PSTV特异性引物进行cDNA扩增,用以制备光敏生物素标记的PSTV cDNA探针。用此探针进行斑点杂交检测含PSTV的马铃薯核酸提取液和汁液均出现阳性杂交信号,而健康马铃薯的核酸提取液和汁液的结果均为阴性。光敏生物素标记探针检测纯化PSTV的灵敏度可达5pg;检测感染PSTV的马铃薯块茎汁液的可测出最高稀释度为1:400。     

RecA蛋白介导的三链核酸结构形成及其序列提取

人工合成的单链DNA分子经PCR扩增形成双链DNA分子。将RecA蛋白与生物素标记的寡聚核酸探针序列在ATPγS存在的情况下共同哺育,使RecA蛋白包裹寡聚核酸探针,然后加入含同源序列的上述双链DNA分子经适当环境哺育形成了稳定的局部三链核酸结构。通过加入链亲和素包裹的磁珠吸附生物素化的探针,这样同源双链DNA分子与寡聚核酸探针形成的局部三链核酸结构也被吸附在磁珠上。使用磁分离装置提取这一结构,逐步降低盐离子浓度以洗脱双链DNA分子。将洗脱液中残留的蛋白质去除,经PCR扩增可获得目的DNA序列。同时使用同源探针和非同源探针在其它序列中提取目的DNA序列,结果显示目的DNA序列只被同源探针提取。实验结果显示了这一三链核酸结构形成的序列特异性,并且其稳定性随盐离子浓度降低而下降。提示在这一结构中同源的寡聚核酸单链与双链DNA分子形成了氢键结合,同时提示使用文中描述的方法可以提取特异的序列,用以克隆相应的基因。     

基于纳米金复合探针的基因芯片膜转印检测法

建立了一种基于纳米金复合探针的基因芯片膜转印核酸检测新方法。首先,用纳米金颗粒同时标记检测探针P2和两种长短不同且生物素化的信号探针 (T10,T40),其中检测探针与靶DNA 5￠端互补,两种信号探针起信号放大作用。当靶DNA分子存在时,芯片表面捕捉探针P1 (与靶DNA分子3￠端互补) 通过碱基互补配对原则结合靶DNA分子,将其固定于芯片上,同时检测探针通过与靶DNA 5￠端互补配对将纳米金复合探针结合于芯片表面,结果在芯片表面形成“三明治”结构,后通过链霉亲和素-生物素反应,使芯片表面对应有靶DNA分子的部位结合上碱性磷酸酶,最后利用BCIP/NBT显色系统使芯片表面信号结果镜面转印至尼龙膜表面。当检测探针和信号探针摩尔比为1∶10,T10和T40摩尔比为9:1时可以检测1 pmol/L合成靶DNA分子或0.23 pmol/L结核分枝杆菌16S rDNA PCR扩增产物,检测结果通过普通的光学扫描仪读取或肉眼直接判读信号有无。本芯片检测系统灵敏度高,操作方法简单、快速,不需要特殊仪器设备,在生物分子的检测方面具有较高的应用价值。     

生物工程技术讲座(十) 核酸标记—生物探针法

在核酸的研究中不用放射性同位素,而用生物素(biotin)标记DNA或RNA分子做为探针来检测核酸分子的方法,是最近几年内开展起来的实验新技术。按一般常规在进行核酸的分析、鉴定以及分子杂交等实验之前,首先以所谓“DNA缺口翻译”的方法制备用同位素标记的DNA(探针)。即把待标记的已知DNA分子用核酸酶(DNase)切成缺口,加入能识别并附着在缺口上的大肠杆菌     

人巨细胞病毒的生物素DNA探针的制备和应用

本研究用克隆的HCMV AD169株DNA片段,制备了生物素标记的DNA探针,建立了检测临床脐带血、尿标本中HCMV DNA的核酸探针杂交方法。该探针可测出100pg同源DNA,不与人胚肺细胞、Hep-2细胞DNA以及其他疱疹病毒的DNA发生反应。用核酸杂交方法检测了30份脐带血标本,有11例阳性,阳性率为33％。10例孕妇尿标本中,3例阳性,阳性率为30％。检测结果表明：我们建立的生物素标记的HCMV DNA探针的点杂交法,具有高度的特异性、敏感性,比分离病毒法更迅速,可用于HCMV感染的临床标本的病毒核酸检测。     

定量测定DNA杂交物的灵敏方法——时间分辨荧光法

<正>核酸杂交不仅广泛用于分子生物学,而且也用于诊断医学等领域,这就需要有一种稳定、非放射性探针,到目前为止,用于杂交探针的非放射性标记物有:(1)用抗生物素或抗生蛋白链菌素检测的生物素化的核苷,(2)用于免疫学检测的半抗原以及(3)与核酸交联的蛋白质。所有这些方法,最终都要用酶催化显色来检测杂交探针分子,尽管这类非放射性标记探针可以在高浓度使用(这可以增加杂交速率),但是,其检测灵敏度和简易性都无法与放射性核酸     

分子生物学技术讲座（五）：放射性标记的DNA和RNA探针的制备

放射性标记的核酸探针（DNA和RNA探针）目前已被广泛地应用于分子生物学的各个领域,例如克隆的筛选,Southern杂交分析,基因表达水平的测定等等。放射性核酸分子探针是指特定的已知核酸分子片段,内含放射性核素（例：‘千、‘H和”S）,并能与被检测的核酸分子退火杂交（核酸序列互补）,因此可用于待测核酸样品中特定基因序列片段的探测。1探针的种类和选择根据核酸分子探针的来源及其性质可将其分成3大类,即：DNA探针、RNA探针和人工合成的寡聚核青酸探针。而DNA探针又可分为基因组DNA探针和。DNA探针。探针的选择是根据不…     

纳米金标记核酸探针检测小反刍兽疫 病毒核酸的研究

试验旨在探讨利用纳米金标记寡核苷酸探针快速检测小反刍兽疫病毒核酸的方法。针对小反刍兽疫病毒N基因的高度保守区设计两条特异寡核苷酸探针,一条探针5’端修饰生物素,另一条探针3’端修饰巯基。巯基化的探针通过Au-S键连接到纳米金颗粒上。靶核酸两端分别与两条探针结合,形成"生物素化探针-靶核酸-纳米金探针"复合物,该复合物通过生物素-亲和素系统,固定在固相载体上,最后银染放大信号。通过肉眼观察法、光镜观察法、分光光度法分析银染灰度,从而间接测定靶核酸的量。初步检测PPRV核酸最低浓度达10fmol/L,所需时间约为1.5h。该方法灵敏度高、操作简单,为临床检测小反刍兽疫病毒核酸提供实验数据和技术支持。     

生物素标记核酸探针技术

通过缺口移位反应和多种化学标记方法合成生物素化核酸探针,并配以酶化学检测手段的新技术,可以代替放射性同位素标记探针作各种探测和分析。它具有灵敏,快速和安全、简便、经济的特点。     

一种简易SNP 检测方法的建立

目的:建立一种快速、简单的SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)检测方法。方法:设计带生物素标记的扩增引物对检测用具有单碱基差异的野生型和突变型靶序列分别进行扩增,然后通过紫外交联的方式将相应检测靶序列的探针固定在硝酸纤维素膜上,借助Taq酶完成膜上单引物延伸,从而对探针捕获的靶序列进行延伸固定在膜上,最后使用生物素-亲和素酶联显色(ABS-ELISA)反应肉眼观察结果。结果:阳性和阴性对照探针显示正常。野生型探针和突变型探针能够分别特异性结合靶序列,并通过生物素和亲和素显色系统放大为一种肉眼可判断结果的检测形式。结论:建立了一种基于硝酸纤维素膜载体上进行核酸扩增的SNP检测方法。     

谷氨酸棒状杆菌启动子在枯草芽孢杆菌中的克隆及其序列分析

利用枯草芽孢杆菌启动子探针质粒pPL 603为载体,从谷氨酸棒状杆菌1014—6染色体DNA上克隆到一个有较强启动功能的DNA片段。生物素标记的DNA—DNA分子杂交实验证明该片段确实来自谷氨酸棒状杆菌1014—6染色体DNA。在绘制该片段限制酶酶切图谱的基础上,经另一个启动子探针质粒pPL 703的亚克隆,将其启动子功能区定位在Bamm酶切片段中。对后者进行了核苷酸序列分析,发现它具有棒状杆菌类启动子的－35区和－10医序列。     

核酸探针技术简介

<正> 核酸探针实质上是DNA或RNA片段,这类片段或参与某种功能或具有某种特征,并往往被连上放射性物质或非放射性物质的指示剂。探针的作用是探查目的DNA或RNA的存在情况,核酸双链分子中各碱基之间有严格的配对原则,就DNA分子说,碱基间的配对总是A-T,C-G,探针的单链只有和与之相对应的称为互补的单链在一起时才能形成新的双链分子,在一个被探测的体系中如果显示     

用生物素标记DNA探针进行菌落原位杂交*

将生物素标记的DNA探针用于菌落原位杂交,结合链霉菌抗生物素蛋白和生物素碱性磷酸酶系统检测显示信号。结果证明该法快速方便,杂交信号清晰,高度特异,完全可以取代同位素用于细菌分析和克隆筛选。     

一种简易SNP检测方法的建立

目的：建立一种快速、简单的SNP（Single Nucleotide Polymorphisms）检测方法。方法：设计带生物素标记的扩增引物对检测用具有单碱基差异的野生型和突变型靶序列分别进行扩增,然后通过紫外交联的方式将相应检测靶序列的探针固定在硝酸纤维素膜上,借助Taq酶完成膜上单引物延伸,从而对探针捕获的靶序列进行延伸固定在膜上,最后使用生物素．亲和素酶联显色（ABs-ELISA）反应肉眼观察结果。结果：阳性和阴性对照探针显示正常。野生型探针和突变型探针能够分别特异性结合靶序列,并通过生物素和亲和索显色系统放大为一种肉眼可判断结果的检测形式。结论：建立了一种基于硝酸纤维素膜载体上进行核酸扩增的SNP检测方法。     

光敏生物素标记cDNA探针在肾综合征出血热实验诊断中的初步应用

本文用光敏生物素标记的R3 cDNA探针杂交检测了HFRS患者外周血淋巴细胞、血清和尿沉淀细胞中HFRS病毒核酸。结果42份淋巴细胞标本中30份为阳性,48份血清标本中有24份出现阳性杂交信号,81份尿沉淀细胞标本中53份为阳性,表明将此光敏生物素标记的cDNA探针用于HFRS实验诊断和致病机理的研究是可行的。     

基因扩增产物的固相杂交-酶联显色方法的建立

建立基于基因扩增技术的简便、快速的病毒核酸定量检测方法．将标记有生物素的寡核苷酸引物所扩增的病毒基因产物,与通过共价键结合在微孔反应板上的特异性探针进行快速杂交,然后通过辣根过氧化物酶标记的抗生物素进行酶联显色,读取光密度值．应用本方法对血清中乙型、丙型肝炎病毒核酸定量检测,灵敏度分别可达１－５拷贝／反应．此方法简便、快速、特异性好、敏感性高、半定量指标客观,可广泛应用于肝炎病毒感染的临床诊断和疗效评价．     

末端脱氧核苷酸转移酶在生物传感及核酸合成领域的应用*

末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)是聚合酶X家族中的一员,与典型的DNA聚合酶不同,TdT以恒温的无模板依赖的方式催化脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)聚合到寡核苷酸的3'羟基端来合成DNA。并且TdT对底物的耐受性高具有聚合修饰型dNTP的能力,如荧光修饰的dNTP、生物素修饰的dNTP,甚至人工碱基均可作为其良好底物。TdT的这些生化特性使其被广泛的应用在生物传感和核酸合成领域中,促进了许多基于核酸的工具和方法的发展,并为酶促从头合成DNA技术的发展奠定基础。介绍了TdT的性质,重点总结了它在其介导的生物检测技术、核酸的修饰技术以及酶促合成DNA技术三个方面的核心作用、目前面临的挑战以及未来研究的方向,以期促进TdT在生物传感器和核酸合成中的进一步应用。     

莲C0t-1 DNA的荧光原位杂交分析

为分析中国莲Cot-1DNA在其中期染色体上的分布,从中国莲基因组DNA中分离出Cot-1DNA,将基因组和所分离的Cot-1DNA用生物素标记后作探针,对中国莲染色体进行原位杂交。杂交结果用耦联有荧光素Cy3的生物素抗体检测,发现在每对染色体上均显示出特定的荧光原位杂交带。同时分析了FISH和GISH信号分布的异同。基于Cot-1DNA荧光原位杂交带型及染色体型,构建了中国莲核型。     

一种切口平移法制备生物素标记核酸探针的简便方法

用切口平移法制备生物素标记的核酸探针,其所用试剂质量稳定、可靠,标记重复性好,且制备的探针易长期保存.我们在制备人IL-6 cDNA等基因探针的实验中,对常规的切口平移法制备生物素标记核酸探针的方法作了简化改进,省略了分离步骤,经斑点杂交试验证明效果良好.     

光敏生物素标记法制备HPV DNA探针

本文将PBR322与HPV重组质粒DNA转化大肠杆菌HB101株,经氨苄青霉素—四环素平板筛选转化成功的菌落,将其扩增、提取质粒DNA,纯化后用限制性内切酶酶切,琼脂糖凝胶电泳区分不同大小的限制性内切片段,并用电洗脱法回收7.9Kb的HPV DNA片段。在高能卤素灯光照下标记光敏生物素制备HPV DNA探针,并检测其特异性和敏感性。结果表明:此探针具有较高敏感性,可达2.5pg;并且具有较强的特异性。