作用于种属差异性表位的细菌α-半乳糖苷酶(EmGalase)的鉴定和研究

对脑膜炎败血伊丽莎白金菌进行糖苷酶功能基因组分析发现,该菌存在一个GH27家族α-半乳糖苷酶基因。克隆该基因并表达蛋白后,利用人工合成的pNP底物研究其酶学性质,发现该酶具有α连接的半乳糖(α-galactose,α-Gal)底物特异性,酶反应pH为3.0~8.0,反应温度为4~45 ℃。用不同寡糖底物进一步确定,该酶能够酶切直链末端α-1,3、1,4、1,6Gal。在猪红细胞上进行的酶切实验显示,该酶能够高效清除存在于猪红细胞表面的末端Gal α 1-3Gal表位。末端α-半乳糖基化修饰在免疫与感染中发挥着重要的生物学作用,作用于种属差异性表位的细菌α-半乳糖苷酶的发现将为该领域的研究提供一个新的工具,为缓解异种输血中的超急性免疫排斥反应提供一种可能。     

异种移植中Galα(1,3)Gal抗原的研究近况

同种异体组织和器官移植物供体来源有限,使得异种移植再度成为移植领域的研究热点。异种移植的主要障碍是人体内存在的天然抗体与移植物表面含有α1,3半乳糖残基[Galα(1,3)Gal,αGal]的抗原结合,激活补体系统和炎症反应,导致超急性移植排斥反应(HAR)的发生,使移植物失活。除人类和旧世纪猴外,其它所有哺乳动物的体内都含有αGal抗原,该抗原是由一组具有Galα(1,3)Gal双糖末端的糖蛋白或糖脂组成的,它的形成依赖于α1,3半乳糖基转移酶(αGT)的催化。目前,针对αGal抗原克服超急性移植排斥反应的方法主要有如下几种：(1)酶处理去除内皮细胞表面的αGal抗原;(2)物理化学方法去除人体血浆中存在的特异性天然抗体;(3)基因工程方法改造表达催化αGal抗原形成的相关酶基因,从而影响该抗原的表达。     

人α-半乳糖苷酶转导克服异种移植HAR的小鼠实验研究

α 半乳糖苷酶可以特异地清除半乳糖α 1,3 半乳糖抗原 (Galα1,3Galantigen) ,此抗原是引起异种器官移植超急性排斥反应 (HyperacuteRejection ,HAR)的主要异种抗原 .将构建好的α半乳糖苷酶转基因载体通过显微注射的方式注入小鼠受精卵 ,培育出了转基因小鼠 .结果表明 ,转基因小鼠的心、肝、肾、脾、肺组织中均有人α 半乳糖苷酶基因的表达 ,其表达可以有效减少小鼠器官表面Galα1,3Gal抗原的表达水平 ,可以降低转基因小鼠脾细胞对补体介导的杀伤作用的敏感性 .研究表明人源α半乳糖苷酶基因可用于研制不表达Galα1,3Gal抗原的转基因动物 ,从而可以降低异种器官移植HAR的反应强度 ,提高移植物的存活期     

冠状病毒糖基化呈现的α-半乳糖表位能增强COVID-19疫苗的免疫原性

正新型冠状病毒SARS-CoV-2上的多糖链及S蛋白形成了一层聚糖屏障(glycan-shield),掩盖了抗原肽,减少了抗原呈递细胞(APC)对灭活病毒或S蛋白疫苗的摄取。对灭活流感病毒和重组HIV疫苗gp120的研究表明,糖基化聚糖屏障呈现的α-半乳糖表位(Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R)能够利用天然抗半乳糖抗体增强疫苗效力,这在能够产生抗半乳糖的小鼠中进行了评估。α-半乳糖表位是天然抗半乳糖抗体的配基,     

中国版纳小型猪近交系动脉异种移植靶抗原研究

目的　研究中国版纳小型猪近交系动脉的异种靶抗原α -Gal的分布和半定量分析 ,为研究异种移植超急性排斥反应和异种生物材料提供资料。方法　通过亲和免疫组织化学法和图象分析对 10头版纳小型猪的四级动脉进行α Gal的分布和半定量研究。结果　 (1)各级血管组织中血管内皮细胞阳性表达明显 ,弹性纤维、胶原纤维和平滑肌细胞未见表达 ,外膜有微弱表达 ;(2 )图象分析显示 ,管径越细 ,其内皮细胞的表达越高 (P <0 .0 1) ,各级动脉内皮细胞阳性表达的面积密度比的组间差异显著 (P <0 .0 1) ,t检验发现每两组间的动脉内皮细胞阳性表达面积密度比相差显著 (P <0 .0 1)。结论　 (1)版纳小型猪动脉内皮细胞均有异种抗原α Gal分布 ,但是分布不均匀 ;(2 )微血管血栓是异种移植超急性排斥反应中的重要环节 ,小型猪的异种器官移植、彻底解决异种移植超急性排斥反应的关键是防治微血管栓塞     

小鼠肝癌及肝正常组织B4GalT糖基转移酶家族mRNA表达差异及其对细胞膜相关糖链的影响

探讨肝癌模型鼠与正常小鼠肝组织B4GalT(β-1,4-半乳糖转移酶)家族mRNA表达差异以及对细胞膜相关糖链的影响.采用RT-PCR方法检测肝癌模型鼠和正常对照小鼠肝癌组织中B4GalT家族7个成员以及唾液酸α-2,3转移酶ST3GalⅢ、ST3GalⅣ、ST3GalⅥ、α-1,6-岩藻糖转移酶FUT8 mRNA表达差异,应用凝集素芯片检测细胞膜表面半乳糖、岩藻糖、唾液酸表达情况.结果显示:与正常对照组相比,肝癌模型鼠肝组织中B4GalT-1和B4GalT-3、ST3GalⅣ和ST3GalⅥ、FUT8呈现高表达,肝癌细胞膜半乳糖、岩藻糖、唾液酸类型糖链增加,提示B4GalT-1和B4GalT-3与肝癌细胞膜半乳糖链增加相关.由于细胞Galβ-1,4-GlcNAc糖表位在ST3GalⅢ、ST3GalⅣ或ST3GalⅥ催化下与唾液酸α-2,3连接生成s-lewis x抗原前体,本实验中B4GalT-1和B4GalT-3与ST3GalⅣ、ST3GalⅤ、FUT8 mRNA表达具有相关性,提示B4GalT-1和B4GalT-3可能与ST3GalⅣ、ST3GalⅥ以及FUT4协同作用,导致肝癌细胞膜半乳糖、岩藻糖、唾液酸类型糖链增加.     

表达人α-1，2-岩藻糖苷转移酶、衰变加速因子和CD59基因的转基因小鼠的建立及其抗异种移植排斥反应的研究

在进行非协调性异种器官移植时,目前已经证实表达人α-1,2-岩藻糖苷转移酶（HT）或者补体调节蛋白的供体动物器官均可以部分克服超急性排斥反应．本文的研究目的是探讨是否共表达人HT和补体调节蛋白（衰变加速因子与CD59）的转基因小鼠的外周血单核细胞能更有效的克服异种移植排斥反应．利用受精卵显微注射技术建立转人HT,DAF和／或CD59基因的小鼠动物模型,流式细胞技术筛选表达不同基因的转基因小鼠．将小鼠的外周血单核细胞与15％的人血清共孵育,检测细胞表面天然抗体的沉积、补体的激活以及黏附分子的表达等．三种目的基因均可以在转基因小鼠体内表达,并且HT基因的表达显著减少了引起异种移植排斥反应的主要抗原半乳糖α-1,3-半乳糖（α—Gal）的表达．功能实验表明,与单一目的基因表达的转基因小鼠相比,共表达HT／DAF或HT／CD59的转基因小鼠的外周血单核细胞对抗人血清介导溶破细胞的能力显著增强．而且三基因共表达的外周血单核细胞对抗人血清介导溶破细胞的能力最强,可以克服超急性排斥反应并且可以减少黏附分子的表达．高水平表达人HT,DAF和CD59基因的转基因小鼠可以完全克服异种器官移植超急性排斥反应并且可以部分克服急性血管排斥反应．本研究表明,表达三种基因的转基因小鼠的器官异种移植时存活时间可以显著延长,对异种移植来说也许是更合适的选择．     

沙门菌鞭毛蛋白的研究进展

沙门菌属于肠杆菌科,其鞭毛主要收蛋白质组成。近年在对其遗传学,免疫学的研究基础上建立了有效的鞭毛表达系统。用多种异种抗原表位在该系统的表达实验中均有力证明了该系统的有效性,这对进一步探索增强疫苗抗原性的方法和新的免疫途径有重要意义。     

Galanin可能是一种内源性镇痛物质

Galanin(甘丙肽,Gal)最早由Tatemoto等从猪肠中分离,以后从猪、鼠、牛中分别克隆了Gal,均由29个氨基酸组成。最近,人的Gal也已克隆,不同的是,人的Gal由30个氨基酸组成。Gal前体含有一个类似的生物活性肽:Gal信使相关肽(GMAP),免疫组化分析表明,GMAP和Gal具有平行分布并广泛分布在大鼠CNS。猴     

五指山小型猪单个核细胞表面α Gal抗原表达差异的分析

利用猪的器官为挽救脏器终末衰竭病人而进行的异种移植是有效救治病人的途径之一.由于猪细胞表面存在的α1,3半乳糖会引起超急性免疫排斥反应,导致移植器官最终被移植受体排斥.除人类和旧大陆猴外,所有哺乳动物细胞表面都有αGal半乳糖表达,但个体间表达量存在显著差异.为研究近交系五指山小型猪细胞表面α1,3半乳糖表达的个体差异,本实验利用FITC-isolectin进行荧光标记,通过流式细胞术以及激光共聚焦分析,对14例5月龄猪样本外周血单个核细胞表面的α1,3半乳糖水平进行检测.利用猪肾上皮PK15细胞确定FITC-isolectin标记的最适浓度为25ng/μl(细胞标记效率大于85%).结果显示,14头猪外周血单个核细胞表面α1,3半乳糖的表达差异范围在1.25～2.09倍之间,远低于普通非近交系猪的个体差异.本研究为利用近交系五指山小型猪作为异种器官移植的研究材料提供了基础数据.     

抗原表位的研究方法及口蹄疫病毒抗原表位的研究进展

本文综述了近几年来用于B细胞表位及T细胞表位研究的常用方法及其在口蹄疫病毒抗原表位研究中的应用,并介绍了口蹄疫病毒抗原表位的研究进展.     

小鼠肝癌与肝正常细胞系ST3Gal和ST6Gal家族mRNA表达差异研究

探讨肝癌细胞系Hepa1-6与肝正常细胞系BNL CL.2唾液酸糖基转移酶ST3Gal和ST6Gal家族mRNA表达的差异以及与细胞膜唾液酸含量的关系,采用RT-PCR方法检测ST3Gal唾液酸转移酶家族6个成员以及ST6Gal唾液酸转移酶家族2个成员mRNA表达差异,用凝集素芯片检测细胞膜表面唾液酸表达情况,结果显示:与正常细胞系BNL CL.2相比,hepa1-6细胞内唾液酸转移酶ST3GalⅠ、ST3GalⅣ、ST3GalⅥ呈现高表达,ST3GalⅤ低表达,ST3GalⅡ、ST3GalⅢ表达无显著性差异,两细胞系内均为检测出ST6GalⅠ表达,ST6GalⅡ表达无显著差异;hepa1-6细胞膜α2-3和α2-6连接唾液酸含量均显著增加;提示ST3GalⅠ、ST3GalⅣ、ST3GalⅤ、ST3GalⅥ可能与肝癌发生过程相关,ST3GalⅠ、ST3GalⅣ、ST3GalⅥ可能与肝癌细胞膜α2-3唾液酸含量增加相关,ST6Gal家族对细胞膜α2-6连接唾液酸含量增加无贡献.     

沉默ST3Gal III抑制MDA-MB-231细胞黏附和侵袭能力

我们前期研究表明α2,3-唾液酸水平与乳腺癌侵袭转移密切相关。人α2,3-唾液酸转移酶（ST3Gal Ⅲ）可催化合成细胞表面的α2,3-唾液酸,并在乳腺癌组织中高表达,此酶活性与肿瘤转移潜能密切相关,但其机制尚未阐明。本研究中我们将继续探讨ST3Gal Ⅲ在对乳腺癌转移关键步骤粘附和侵袭中的作用。构建特异靶向ST3Gal Ⅲ的短发夹RNA（shRNA）序列的慢病毒载体,采用细胞转染沉默乳腺癌MDA-MB-231细胞的ST3Gal Ⅲ,经实时定量PCR及Western印迹检测转染后细胞ST3Gal Ⅲ mRNA及蛋白表达,验证构建了稳定下调ST3Gal Ⅲ表达的两个细胞克隆,分别记作shRNA-2、shRNA-4。细胞表面α2,3-唾液酸是ST3Gal Ⅲ下游产物,可代表酶活性。流式细胞术分析结果证实,shRNA-2、shRNA-4细胞表面α2,3-唾液酸的含量显著降低（P<0.05）。细胞黏附、细胞迁移及侵袭能力等功能学检测结果表明,shRNA细胞黏附能力及侵袭能力明显降低（P<0.05）。β1整合素表达与肿瘤侵袭能力获取密切相关。本研究中,沉默ST3Gal Ⅲ可抑制β1整合素表达（P<0.05）。这些结果提示,ST3Gal Ⅲ在乳腺癌转移关键步骤黏附和侵袭中具有重要作用,沉默ST3Gal Ⅲ抑制MDA MB-231细胞黏附和侵袭能力,其作用机制可能是通过下调β1整合素表达。此研究从新的视角认识了乳腺癌转移的机制,并可能提供乳腺癌转移治疗的新靶点。     

表位疫苗及相关技术研究进展

表位疫苗是用抗原表位制备的疫苗,是近年来新兴的一种疫苗研制技术,也是今后最具开发前景的疫苗技术之一,在肿瘤、病毒等疾病的防治中有着自身独特的优势。本文详细阐述了T表位和B表位的筛选和鉴定方法、表位疫苗的载体研究及表位疫苗在肿瘤、病毒和微生物感染中的应用等,对表位疫苗的最新研究进展进行了综述。     

表位疫苗研究进展

表位疫苗是用抗原表位制备的疫苗,是近年来新兴的一种疫苗研制技术,也是今后最具开发前景的疫苗技术之一,在肿瘤、病毒等疾病的防治中有着自身独特的优势.详细阐述了T表位和B表位的筛选和鉴定方法、表位疫苗的载体研究及表位疫苗在肿瘤、病毒和微生物感染中的应用等,对表位疫苗的最新研究进展进行了综述.     

Gal80~(ts)与Gal4组合灵敏控制果蝇中UAS转基因的表达水平

【目的】Gal80~(ts)与Gal4组合驱动UAS转基因表达是黑腹果蝇Drosophila melanogaster研究中常用的转基因过表达遗传学工具,通过温度控制实现对UAS转基因表达的灵活开关。Gal80~(ts)是一种温度敏感型蛋白,低温下(18℃)与Gal4蛋白结合并抑制其转录活力,高温下(29℃)解除对Gal4的抑制,从而允许Gal4结合UAS位点,启动UAS转基因的表达。但是从18~29℃的开关只能强烈过表达UAS转基因,而不能灵活调控转基因的表达水平。本实验系统研究一系列温度下转基因的表达水平,从而实现该体系对转基因的表达水平的灵活控制。【方法】以果蝇翅芽这一常用器官组织为研究模型,以2种Gal4品系(dpp-Gal4和en-Gal4,分别由decapentaplgic和engrailed基因的启动子驱动)分别与tub-Gal80~(ts)(微管蛋白基因tubulin启动子驱动)基因重组后,再分别与UAS-wg(wingless)转基因品系杂交;在一系列温度(18,25,27.5,28,28.5和30℃)下进行子代幼虫培养,通过免疫组化染色揭示并量化分析转基因wg在3龄幼虫翅芽上的表达水平。【结果】18~25℃培养条件下,Gal80~(ts)与Gal4组合系统中的UAS转基因不能表达;30℃时培养,转基因强烈地过表达;在25~30℃区间内,随着温度升高,转基因表达水平逐渐上升。【结论】在25~30℃之间的温度调控可以实现对Gal80~(ts)与Gal4组合系统中的UAS转基因表达水平的调控。本研究结果对调控转基因表达程度有重要价值。     

半乳糖苷凝集素Galectin3直接诱发胰岛素抵抗

肥胖时,巨噬细胞和其他免疫细胞在胰岛素靶组织大量聚集,分泌一系列促炎症细胞因子[包括TNFα(tumor necrosis factorα)和IL1β(interleukine 1β)],导致慢性炎症状态。研究表明,由CD11c阳性巨噬细胞引起慢性炎症诱发胰岛素抵抗。然而,通过抑制TNFα或IL1β等方法来改善胰岛素抵抗的临床研究并不成功。该课题组之前的研究发现,将肥胖小鼠由高脂饮食更换到正常饮食后,脂肪组织中CD11c阳性巨噬细胞所表达的半乳糖苷凝集素3(Galectin3,Gal3)水平大幅降低。同时,在这些更换饮食的小鼠中,尽管脂肪组织CD11c阳性巨噬细胞数目相比高脂饮食喂养时并没有变化,但炎症和胰岛素抵抗却得到了明显改善。因此,该课题组提出,Gal3是介导炎症致胰岛素抵抗的关键分子。Gal3是一种主要由巨噬细胞分泌的凝集素,其水平在肥胖病人和肥胖小鼠中都显著增加。在胰岛素敏感性正常小鼠上,给予Gal3可导致胰岛素抵抗和葡萄糖不耐受,通过基因敲除或药物抑制Gal3则可在肥胖小鼠上改善胰岛素抵抗。体外实验表明,Gal3可直接增加巨噬细胞的化学趋化性,减少肌肉细胞和3T3-L1脂肪细胞中胰岛素刺激的葡萄糖摄取,并可在原代肝细胞中阻碍胰岛素对肝糖输出的抑制作用。更重要的是,该课题组发现,Gal3可与胰岛素受体结合并抑制其下游信号传导。这些发现阐明了Gal3在胰岛素三大作用靶细胞中的新作用,Gal3为连接炎症和胰岛素敏感性减低的关键分子,抑制Gal3有望成为胰岛素抵抗和糖尿病的新治疗手段。     

香鱼半乳糖凝集素3基因的克隆、鉴定和功能初探

半乳糖凝集素3(galectin-3,Gal3)是凝集素的一类,在哺乳动物非特异性免疫中具有重要作用,但在鱼类中尚未见研究报道。该研究通过香鱼(Plecoglossus altivelis)单核/巨噬细胞转录组测序获得Gal3(Pa Gal3)的c DNA序列,全长2 009个核苷酸,包含一个完整的开放阅读框,推测其编码一个由380个氨基酸组成、相对分子质量为38.28 k Da的蛋白,等电点为4.58,N-末端无信号肽。多重序列比对表明,Pa Gal3具有Galectin(Gal)家族成员典型的结构特征。系统进化树揭示,各物种Gal3的进化关系符合目前广泛认可的动物分类关系,Pa Gal3与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)Gal3紧密成簇,氨基酸序列同源性达77%。实时荧光定量PCR结果表明,鳗弧菌(Vibrio anguillarum)侵染后,香鱼肝、肾、脾等组织和单核/巨噬细胞中Pa Gal3的m RNA表达量显著上调。Western blot结果表明,Pa Gal3存在于香鱼血清中。抗体封闭Pa Gal3后,香鱼单核/巨噬细胞吞噬细菌能力和杀菌活性均显著下降,揭示Pa Gal3可以增强香鱼单核/巨噬细胞功能。综上,Pa Gal3与鱼类免疫紧密相关,可能在香鱼炎症免疫中具有重要作用。     

多拷贝异种化前列腺干细胞抗原融合基因片段的构建及真核表达

目的：构建一系列含有人前列腺干细胞抗原（PSCA）主要T细胞表位的多拷贝异种化融合基因片段,并分别在人胚肾293T细胞中表达。方法：通过重叠延伸PCR法合成单拷贝异种化PSCA基因片段PSCA1,随即应用同尾酶法将该片段串联形成2、3、4拷贝异种化PSCA基因片段PSCA2、PSCA3和PSCA4,并将上述4种基因片段分别插入真核表达载体pCI-Fc-GPI中,构建最终目的片段1～4拷贝异种化PSCA-Fc-GPI（即PSCA1-Fc-GPI～PSCA4-Fc-GPI）,随即分别将重组质粒pCI-PSCA1-Fc-GPI～PSCA4-Fc-GPI体外转染293T细胞,利用间接免疫荧光和流式细胞仪检测其表达情况。结果：测序证实PSCA1片段与设计一致,酶切鉴定证明目的基因片段PSCA1-Fc-GPI～PSCA4-Fc-GPI构建成功;间接免疫荧光和流式细胞仪的检测结果显示,在293T细胞中1～4拷贝异种化PSCA融合基因片段均获得较好表达。结论：构建了目的基因片段PSCA1-Fc-GPI～PSCA4-Fc-GPI,为以PSCA为靶抗原的抗前列腺癌DNA疫苗的构建及功能研究奠定了重要基础。     

反义RNA对猪α-1,3-半乳糖苷转移酶活性的影响

 α 1,3 半乳糖表位是猪 人异种移植超急性排斥反应的主要抗原 ,由α 1,3 半乳糖苷转移酶催化合成 .用RT PCR方法扩增中国实验用小型猪α 1,3 半乳糖苷转移酶cDNA的前 582bp ,测定碱基序列并构建其反义表达载体pLXRN ,将其转染入猪主动脉内皮细胞 .NorthernBlotting表明α 1,3 半乳糖苷转移酶mRNA减少 .检测α 1,3 半乳糖苷转移酶活性表明 ,反义RNA可使其活性下降32 2 % .研究结果表明可能通过反义RNA来抑制猪 人异种移植超急性排斥反应