Two small heat shock protein genes in Apis cerana cerana: characterization,regulation, and developmental expression

In the present study, we identified and characterized two small heat shock protein genes from Apis cerana cerana, named AccHsp24.2 and AccHsp23.0. An alignment analysis showed that AccHsp24.2 and AccHsp23.0 share high similarity with other members of the α-crystallin/sHSP family, all of which contain the conserved α-crystallin domain. The recombinant AccHsp24.2 and AccHsp23.0 proteins were shown to have molecular chaperone activity by the malate dehydrogenase thermal aggregation assay. Three heat shock elements were detected in the 5′-flanking region of AccHsp24.2 and eleven in AccHsp23.0, and two Drosophila Broad-Complex genes for ecdysone steroid response sites were found in each of the genes. The presence of these elements suggests that the expression of these genes might be regulated by heat shock and ecdysone, which was confirmed by quantitative RT-PCR (RT-qPCR). The results revealed that the expression of the two genes could be induced by cold shock (4 °C) and heat shock (37 °C and 43 °C) in an analogous manner, and AccHsp24.2 was more susceptible than AccHsp23.0. In addition, the expression of the two genes was induced by high concentrations of ecdysone in vitro and in vivo. The accumulation of AccHsp24.2 and AccHsp23.0 mRNA was also detected in different developmental stages and tissues. In spite of the differential expression at the same stage, these genes shared similar developmental patterns, suggesting that they are regulated by similar mechanisms.     

中华蜜蜂ZFP37基因的生物信息学分析及高温下表达特性的研究

锌指蛋白(Zinc finger proteins, ZFPs)是一类在真核生物体内广泛分布的蛋白质。锌指蛋白作为一类转录因子,它能够调控基因的表达和细胞的分化,最近的研究显示其在动植物抗逆方面也发挥着重要作用。本研究对中华蜜蜂Apis cerana cerana ZFP37的蛋白结构进行了预测分析,并通过qRT-PCR分析了中华蜜蜂在遭受高温胁迫时ZFP37的表达情况,进一步了解锌指蛋白在中华蜜蜂应对热胁迫过程中的作用。结果显示,中华蜜蜂ZFP37可编码123个氨基酸,蛋白分子量为13.7 kDa,无跨膜结构。氨基酸同源序列比对结果表明,中华蜜蜂ZFP37序列与蜜蜂科昆虫的相似性最高,与其他膜翅目昆虫的相似性存在差异。基因的表达模式显示,ZFP37在高温下表达升高,此外,胁迫时间的增加也可导致ZFP37表达的升高。这些结果表明ZFP37对于中华蜜蜂应对热应激有重要的生物学意义。     

Expression of the melittin gene of Apis cerana cerana in Escherichia coli

A cDNA encoding melittin in Apis cerana cerana was obtained by PCR from the recombinant plasmid and cloned into the GST fusion expression vector pGEX-4T-2 for expression of the protein. The expressed protein of about 29 kDa was detected by Western blot and triple antibody sandwich ELISA, indicating that the recombinant protein is the fusion protein of GST-AccM. The expression conditions of GST-AccM fusion protein for Escherichia coli BL21 transformant were optimized. Thin layer scanning on the SDS-PAGE profiles of GST-AccM showed that the expressed protein accumulated up to about 15.2% of total protein of bacterial cells under the optimized expression condition. Purified and recovered recombinant melittin of A. cerana cerana showed bioactivity in activating rabbit platelets to aggregate.     

中华蜜蜂感觉神经元膜蛋白基因克隆、组织表达分析及原核表达

为明确中华蜜蜂Apis cerana cerana嗅觉形成中重要功能因子的信号转导通路, 本研究利用RT-PCR方法, 克隆了中华蜜蜂感觉神经元膜蛋白 (sensory neuron membrane protein, SNMP) 基因编码区, GenBank登录号为KC012595, 命名为AccSNMP1。序列分析表明, 该编码区开放阅读框长1 563 bp, 编码520个氨基酸, 推测的编码蛋白的相对分子量和等电点分别为58.02 kD和5.83。同源性比较发现, 中华蜜蜂AccSNMP1与其他昆虫感觉神经元膜蛋白基因同源性差异很大, 在氨基酸水平上与西方蜜蜂Apis mellifera SNMP基因一致性达99.2%, 与熊蜂Bombus impatiens SNMP基因一致性达90.9%, 而与赤拟谷盗Tribolium castaneum SNMP基因一致性仅为22.7%。系统发育树显示中华蜜蜂与西方蜜蜂遗传距离最近。实时荧光定量PCR结果分析表明, AccSNMP1在触角中表达量最高, 在足中表达量较高, 与胸、 腹、 头（去除触角和喙）、 喙中表达量相比差异显著（P<0.05）。构建原核表达载体pEASY-E1-AccSNMP1, 经IPTG诱导, 中华蜜蜂感觉神经元膜蛋白在大肠杆菌Escherichia coli BL21 （DE3）中高效表达。结果为进一步研究AccSNMP1在中华蜜蜂体内的作用机理奠定了基础。     

中华蜜蜂mab-21基因序列分析及表达特征

【目的】探究中华蜜蜂 Apis cerana cerana Male abnomal 21（mab-21）基因在不同发育阶段的表达特性及染螨条件下mab-21基因表达变化规律。【方法】本研究利用RT-PCR方法,克隆了中华蜜蜂mab-21的基因编码区;采用荧光定量PCR方法检测了中华蜜蜂mab-21在不同发育时期（新出房蜂、哺育蜂、守卫蜂及采集蜂）工蜂头部中mRNA的表达量以及接种大蜂螨 Varroa destructor 前后mab-21基因的表达变化。【结果】克隆获得中华蜜蜂mab-21 cDNA,命名为 Accmab 21（GenBank登录号KR000001）。序列分析显示, 该编码区开放阅读框长为1 098 bp,编码365个氨基酸,推测的编码蛋白的相对分子量和等电点分别为41.63 kD和8.53。系统发育分析表明中华蜜蜂mab-21与西方蜜蜂 Apis mellifera mab-21、小蜜蜂Apis florea mab-21和熊蜂Bombus impatiens mab-21聚成一支。该基因在中华蜜蜂工蜂的不同发育时期均有表达,其中哺育蜂阶段显著高于新出房蜂、守卫蜂和采集蜂(P<0.05)。接种大蜂螨后,哺育蜂和守卫蜂中mab-21基因的表达下降显著(P<0.05);而在新出房蜂和采集蜂中表达量变化不显著。【结论】该基因可能与中华蜜蜂抗螨行为相关。     

中华蜜蜂气味受体基因AcOr170的克隆与序列分析

本研究采用自行设计的引物对中华蜜蜂Apis cerana cerana雄蜂触角中气味受体基因(Odorant receptors 170)Ac Or170的c DNA序列进行了克隆和序列分析,以探寻中华蜜蜂雄蜂气味受体Ac Or170基因在近缘种昆虫间的进化差异。结果表明:中华蜜蜂雄蜂气味受体基因Ac Or170的c DNA序列总长度为1356 bp,编码区序列长度为1188 bp,共编码396个氨基酸,其分子量为46.272 k Da,等电点8.96,Genbank登录号:KX264359。结构域的分析结果显示,该蛋白具有7tm-6一个保守结构域。经序列比对后发现,Or170的序列在中华蜜蜂、西方蜜蜂和大蜜蜂间的亲缘性很近。     

中华蜜蜂Malvolio基因 Acmvl 的克隆及组织表达分析

【目的】本研究克隆了中华蜜蜂Apis cerana cerana Malvolio (Mvl)基因的cDNA序列,分析了其编码蛋白的结构特点,并探讨其mRNA在内勤蜂、采蜜蜂和采粉蜂各部位组织中的表达差异,以期为该基因的生物学功能研究提供参考。【方法】利用RT-PCR技术从中华蜜蜂内勤蜂头部组织中扩增和克隆获得Acmvl的全长序列,并采用多种生物信息学软件分析Acmvl蛋白的结构特征;采用Real-time PCR对中华蜜蜂Acmvl在内勤蜂、采蜜蜂和采粉蜂各组织中的表达特征进行分析。【结果】Acmvl基因cDNA全长为2 130 bp（GenBank登录号：KP662686）,编码587个氨基酸,预测该蛋白分子量为65.86 kD,等电点为6.03,无信号肽,存在11个跨膜结构域、9个糖基化位点和14个潜在磷酸化位点;系统发育树分析结果显示,中华蜜蜂Acmvl与其他膜翅目昆虫Malvolio聚为一支,与小鼠Mus musculus和人Homo sapiens Nramp家族的Nramp2聚为另一大分支,且与小鼠、水稻 Oryza sativa 、黑腹果蝇 Drosophila melanogaster 和酵母Saccharomyces cerevisiae的Nramp家族同源体在跨膜区、跨膜区带电残基及转运蛋白特征结构域上有很高的保守性,尤其是与Nramp2。Acmvl 基因在中华蜜蜂各部位组织中均有表达,但高表达于内勤蜂的胸部及采蜜蜂和采粉蜂的腹部和足部,提示该基因表达的差异影响采集行为。【结论】Acmvl 属于Nramp基因家族,可能为Nramp2的同源基因,该基因影响采集行为可能与转运Cu²⁺, Mn²⁺和Fe²⁺（尤其是Fe²⁺）有关。     

中华蜜蜂气味结合蛋白AcerOBP14的表达及配体结合特性分析

[目的]气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)在昆虫寄主定位、产卵地选择等行为中发挥着重要作用,明确中华蜜蜂Apis cerana cerana AcerOBP14与配体的结合特性有助于阐明中华蜜蜂嗅觉识别的分子机制.[方法]通过qRT-PCR测定OBP14在20日龄中华蜜蜂成年工蜂...     

中华蜜蜂蜂毒镇静肽基因的cDNA克隆和表达

从中华蜜蜂 (Apisceranacerana)工蜂毒腺中快速抽提总RNA ,用RT PCR扩增得到大小约为2 5 0bp的cDNA片段 ,测序得到的片段长度为 2 34bp ,为蜂毒前镇静肽原 (preprosecapin)基因编码区的cDNA .以 3′RACE方法 ,扩增和测定了 3′端非编码区 2 19bp序列 .中蜂前镇静肽原cDNA序列与已报道的欧洲意蜂该基因cDNA序列具有 92 %同源性 ,氨基酸序列具有 87%同源性 .代表成熟肽镇静肽的最后 2 5个氨基酸序列 ,中蜂与意蜂同源性为 88% .3′端非编码区cDNA序列与欧洲意蜂序列有 73 1%同源性 .将中华蜜蜂蜂毒镇静肽成熟肽编码区与 3′非编码区部分克隆 ,构建了镇静肽与谷胱甘肽转移酶融合表达的载体pGEX AcSecapin .将载体转化大肠杆菌BL2 1(DE3)进行融合表达 .表达产物与抗GST抗体在 2 9kD处有很强的交叉反应 .大肠杆菌超声破碎后的上清液用SDS PAGE检测到表达的蛋白多为可溶性融合蛋白 ,通过亲和层析柱纯化和凝血酶的切割得到了镇静肽蛋白     

中华蜜蜂溶血肽基因在杆状病毒系统中的表达

构建含中华蜜蜂溶血肽基因的重组转移载体pBacHT-GFPTAccM,转化受体菌DH10Bac,得重组穿梭载体Bacmid-GFPTAccM, Lipofectin介导其基因组DNA转染粉纹夜蛾细胞系Tn-5B1-4。SDS-PAGE分析表明,感染重组杆状病毒Bacmid-GFPTAccM的细胞表达产物在约为34 kD处出现特异性条带,其表达量约占细胞总蛋白的3%。Western blotting和细胞表达时相动态分析证明中华蜜蜂溶血肽基因已在粉纹夜蛾细胞系Tn-5B1-4中进行了成功的表达。     

中华蜜蜂mrjp1 cDNA的克隆及其序列分析

构建中华蜜蜂(Apis cerana cerana)8日龄工蜂头部cDNA文库,利用中蜂基因组的mrjp3部分基因片段作为杂交探针,采用DIG标记筛选cDNA文库,获得mrjps阳性克隆120个;对阳性克隆进行PCR扩增和测序,通过NCBI的BLAST序列比对,获得12个与印度蜂(Apis cerana india)、西方蜜蜂(Apis mellifera L.)mrjp1基因同源的中蜂mtjp1 cDNA片段,并进一步对中华蜜蜂mrjp1的cDNA全序列进行测定和分析。序列比对分析表明,东方蜜蜂(Apis cerana)与西方蜜蜂mrjp1的cDNA序列相似性为93．78％,中华蜜蜂与印度蜂的相似性高达99．36％,这一结果从分子水平证实中华蜜蜂与印度蜂有较近的共同祖先,而东方蜜蜂与西方蜜蜂的亲缘关系较远。     

中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交文库的构建

【目的】本研究旨在利用位点特异性重组技术(FullCoV)将中华蜜蜂 Apis cerana cerana 幼虫膜蛋白cDNA连接到pPR3-N载体上,构建中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库。【方法】提取2-3日龄中华蜜蜂工蜂幼虫总RNA;分离mRNA后,在反转录酶的作用下合成幼虫膜蛋白cDNA第1链,并合成双链cDNA。在双链cDNA的5′端加上带有重组序列的接头后,通过FullCoV技术与载体pPR3-N进行连接,然后将连接产物电转化到DH10B感受态细胞,构建中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,并对该文库插入片段大小和文库滴度进行检测。【结果】通过FullCoV技术成功构建了中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,经检测,中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母cDNA文库的总库容量为1.5×10^7 cfu,文库滴度为3×10^6 cfu/mL,重组率达到100%。【结论】本研究利用FullCoV技术成功构建了中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母cDNA文库,为进一步探究感染中华蜜蜂的病原微生物与宿主蛋白互作研究奠定了基础。     

中华蜜蜂气味结合蛋白基因OBP4的分子特性及时空表达

气味结合蛋白OBPs在蜜蜂识别气味分子和生理反应的过程中起到了十分重要的作用。本研究通过利用生物信息学软件预测分析中华蜜蜂Apis cerana cerana气味结合蛋白基因OBP4(AcerOBP4)编码的蛋白理化特性和结构特征;采用MEGA 5.2软件中的邻位相连法(Neighbor-joining, NJ)构建AcerOBP4及其它昆虫OBPs的系统发育树;通过qRT-PCR技术分析AcerOBP4在中华蜜蜂的哺育蜂、采集蜂和1日龄工蜂各组织的表达情况。结果表明,中华蜜蜂和意大利蜜蜂Apis melliferaOBP4(AmelOBP4)氨基酸同源性为78%,AcerOBP4在中华蜜蜂的触角表达量最高,其次是足和头部组织表明该基因与蜜蜂的嗅觉行为密切相关。此外,AcerOBP4在蜜蜂脑部有一定的表达,但是在腹部组织表达量很低。该研究结果丰富了蜜蜂OBPs表达特性的研究数据,同时也为继续深入研究OBP4在中华蜜蜂中是否影响嗅觉行为提供了基础。     

Molecular characterization and tissue localization of sensory neuron membrane protein from Chinese honey bee, Apis cerana cerana (Hymenoptera: Apidae)

Sensory neuron membrane protein (SNMP) is an olfactory receptor with photoaffinity analogs, capable of binding the pheromone membrane protein receptor deduced from receptor membrane protein with the pheromone–pheromone binding protein complex. However, this hypothesis has not yet been experimentally verified. In this experiment, the cDNA sequence encoding an open reading frame (ORF) of the SNMP gene AccSNMP1 (GenBank, KC012595) was cloned from Chinese honey bee, Apis cerana cerana Fabricius. Results from sequence analysis showed that this gene is 1,563 bp long, and that the ORF encodes 520 amino acids with a predicted molecular weight of 58.02 kDa, and has a theoretical isoelectric point of 5.83. Furthermore, there are two putative transmembrane domains. Multiple sequence alignment indicated that the AccSNMP1 gene from A. cerana cerana had different degrees of identity with the corresponding genes in nineteen other insects at the amino acid level. Phylogenetic analysis of the aligned sequences showed that A. cerana cerana is closely related to Apis mellifera Linnaeus and Bombus impatiens Cresson. Its distribution in tissues, as quantified using real-time RT-PCR, indicated that AccSNMP1 is highly expressed in the antennae and legs of A. cerana cerana, and there was a significant difference (p < 0.05) in gene expression between those tissues and tissues in the thorax, abdomen, snout, and head (not including antennae). Western blotting also confirmed the existence in the antennae of AccSNMP1 with an M _W of 58.0 kDa, which is the same as the expected value of 58.02 kDa. An immunohistochemistry study showed that AccSNMP1 is expressed in the trichoid sensilla of A. cerana cerana antenna. Therefore, the results of this study provide the basis for further studies of the function of SNMP from A. cerana cerana.     

温度胁迫下棉花粉蚧热激蛋白基因的表达分析

【目的】为了研究热激蛋白 Hsp70, Hsp70-4和Hsp90在棉花粉蚧Phenacoccus solenopsis抵抗逆温中的作用。【方法】在测序棉花粉蚧转录组的基础上,分析了该虫热激蛋白Hsp70基因家族的2个序列［Pshsp70（GenBank登录号为KJ909505）和Pshsp70-4（GenBank登录号为KJ909506）］和Hsp90基因家族的1个序列,［Pshsp90(GenBank登录号为KJ909507)］,采用实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）检测了在不同温度（18和32℃恒温, 37, 39, 41, 43和45℃热激1 h 后26℃恢复1 h)下棉花粉蚧不同发育阶段（2龄若虫、3龄若虫、雌成虫）3种热激蛋白基因的表达量。【结果】Pshsp70 cDNA序列包含1 923 bp的开放阅读框,编码641个氨基酸,理论分子量和等电点分别为70.9 kDa和5.65; Pshsp70-4 cDNA序列包含1 962 bp的开放阅读框,编码654个氨基酸,理论分子量和等电点分别为71.8 kDa和5.38;Pshsp90 cDNA序列包含2 172 bp的开放阅读框,编码724个氨基酸,理论分子量和等电点分别为83.5 kDa和4.93。Pshsp70 和Pshsp70-4均含有Hsp70基因家族高度保守的基序,Pshsp70编码的氨基酸序列与烟粉虱Bemisia tabaci和家蚕Bombyx mori等昆虫的Hsp70 的氨基酸序列一致性为 85%;Pshsp70-4编码的氨基酸序列与白蜡蚧Ericerus pela和点蜂缘蝽Riptortus pedestris等昆虫的Hsp70的氨基酸序列一致性高达95%;Pshsp90也含有Hsp90基因家族高度保守的基序,Pshsp90编码的氨基酸序列与赤拟谷盗Tribolium castaneum和东亚小花蝽Orius sauteri等昆虫的Hsp90 的氨基酸序列一致性为 87%。热激蛋白基因表达量分析结果表明,在18℃恒温条件下,粉蚧2龄若虫的3个PsHsps基因的mRNA相对表达量均比对照(26℃)低,在32℃恒温条件下,各龄期的Hsp70基因的相对表达量均显著高于对照。在37~45℃下热激1 h并在26℃下恢复1 h,棉花粉蚧3个龄期的3个热激蛋白PsHsps基因的相对表达量随温度的升高总体呈增加趋势,相关性分析表明,除Pshsp70-4在雌成虫中的表达量与热胁迫温度的相关系数为0.225外,各龄期中3个基因的表达量与温度的相关系数均大于0.6,显著相关;43℃和45℃胁迫下,各龄期的3个热激蛋白基因相对表达量均显著高于对照组（P<0.05）。【结论】棉花粉蚧热激蛋白基因的表达与温度呈正相关,在该虫应对高温中起着重要作用。