基因工程荧光素酶问世

中国科学院上海植物生理研究所研究采用分子克隆技术成功地构造了带虫荧光素酶基因的工程菌株、经微生物发酵,研制成功两种剂型的基因工程菌荧光素酶试剂:纯酶和粗酶。其测定ATP的最低浓度分别为10~(-14)～10~(-15)mol/ml和10~(-13)～10~(-14)mol/ml,酶活性达到天然酶水平,可以取代萤火虫荧光素酶,目前国内外尚无同类产品。经情报所国际联网检索证明:该研究成果达到国际先进水平,属国内首创。今年初这项上海市科委下达的科研项目通过专家鉴定。     

不同保存方法对柽柳基因组总DNA产量和质量的影响

通过比较不同保存方法对柽柳(Tamarix chinensis)基因组总DNA提取效果的影响,确定合适的野外采集植物样品的保存方法。采用改良CTAB法提取了室温风干、4℃、-20℃、-80℃和硅胶干燥5种保存方法分别保存24 h、1周和1月后的柽柳基因组总DNA,结果表明:4℃保存1月后DNA产量最低,为60.35μg/g,-80℃条件下保存24 h的材料中提取的DNA产量最高,为246.92μg/g,保存效果最好。但在野外仪器条件不具备的情况下,柽柳可采用室温风干或硅胶干燥保存的方法,1月内材料中DNA降解程度较轻,可以扩增出所需目的片段。     

百合鳞茎淀粉磷酸化酶提取条件的优化

为深入研究百合鳞茎淀粉磷酸化酶（SP）的性质及其在鳞茎淀粉代谢中的生理作用,本试验确定了兰州百合鳞茎内SP的最佳提取和测定条件,并对部分酶学性质进行了初步探索。结果表明：SP的最适提取缓冲液为pH5.8的琥珀酸缓冲液;最佳反应体系为以25 mmol·L^-1的Glc-1-P为底物,在30℃条件下反应10 min。在pH5~6范围内,SP活性最高;百合鳞茎的SP不易保存且不耐热,4℃条件下保存12 h,酶活力最高残留50%;40℃条件下保存30 min后,SP活力几乎完全丧失。     

HPLC法测定九节菖蒲中琥珀酸含量

目的:建立九节菖蒲中琥珀酸含量的HPLC测定法。方法:采用Kromasil C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm);甲醇-0.02mol/L KH2PO4缓冲液(7:93)(pH 2.5)为流动相;流速0.5 mL/min;柱温为30℃;检测波长为214 nm。结果:琥珀酸在4～48μg范围内具有良好的线性关系,平均加样回收率为99.15%。九节菖蒲样品中的琥珀酸含量,以干燥品计为0.200%～0.318%。结论:该方法可行,重复性好,可用于九节菖蒲中琥珀酸含量的测定。     

重组鼠疫耶尔森菌LcrV抗原原液性质研究

目的进行重组鼠疫耶尔森菌LcrV抗原原液二聚体含量及性质研究,确定LcrV原液的相关质控标准。方法在不同缓冲体系(0.85%NaCl(NS)、20 mmol/L PBS),不同蛋白浓度(2.0、1.5、1.0、0.5、0.1 mg/mL)及不同保存温度(4℃、-20℃、-70℃)条件下保存LcrV抗原,采用SDS-PAGE和HPSEC方法定期检测LcrV二聚体含量及纯度。将连续三批检定合格的LcrV抗原原液进行质谱相对分子质量测定、等电点测定、N末端氨基酸序列测定、圆二色(CD)谱、HPLC肽谱及氨基酸组成分析,研究LcrV抗原的相关性质。结果随着保存时间的延长LcrV抗原二聚体含量增加,低温保存时二聚体不易大量形成。在-20℃和-70℃条件下,NS保存的LcrV抗原比PBS体系保存稳定,而在4℃条件下NS保存的LcrV抗原容易降解。LcrV抗原高浓度保存容易发生聚合。LcrV抗原在低质量浓度(0.1 mg/mL)保存时免疫学活性明显下降。质谱检测到LcrV单体和二聚体共同存在,且与理论相对分子质量一致。LcrV原液检测等电点范围为4.6～6.3。N末端测序、CD谱、HPLC肽谱图及氨基酸组成分析与理论结果一致。结论 LcrV抗原原液保存条件确定为:NS体系,蛋白质量浓度1.0～2.0 mg/mL,-20℃以下冻存。制备的LcrV抗原各项检测结果与理论结果一致,抗原性质稳定。     

HPLC法测定九节菖蒲中琥珀酸含量

目的:建立九节菖蒲中琥珀酸含量的HPLC测定法.方法:采用Kromasil C18色谱柱(150 mm×4.6mm,5μm);甲醇-0.02mol/L KH2PO4缓冲液(7∶93)(pH 2.5)为流动相;流速0.5 mL/min;柱温为30℃;检测波长为214nm.结果:琥珀酸在4～48μg范围内具有良好的线性关系,平均加样回收率为99.15％.九节菖蒲样品中的琥珀酸含量,以干燥品计为0.200％～0.318％.结论:该方法可行,重复性好,可用于九节菖蒲中琥珀酸含量的测定.     

利用荧光素酶生物发光体系测定Mg~(2+)-ATP酶结合和水解活性

本文应用LKB公司的ATP测液建立了Mg~(2 )-ATP酶的ATP结合及水解活性的测定方法;利用国产荧光素酶粗品在连串反应体系中建立测定Mg~(2 )-ATP酶结合活性的方法,并与水解活性相比较.对Mg~(2 )-ATP酶的去脂样品,Mg~(2 )-ATP酶与卵磷脂复合物以及微粒体样所做的测定表明,上述两种方法是可靠、简便的,尤其是利用国产荧光素酶粗品建立的ATP结合活性的测定方法,能避免水解对结合活性测定的干扰,刘其它的酶-底物的结合研究有参考价值.     

不同切制条件对大黄饮片中蒽醌化合物含量的影响

目的:采用高效液相色谱法比较不同的大黄切制条件对蒽醌类化合物含量的影响.方法:以大黄素和大黄酚为对照品,采用Merck C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),甲醇-水-磷酸(体积比78.7:20.9:0.4)为流动相,检测波长254 nm,外标法测定了不同切制条件下得到的18份饮片样品中游离和结合型大黄素和大黄酚的含量.结果:从18份样品测定的平均值来看,游离型大黄素和大黄酚的含量为8.69 mg/g,结合型的为4.45 mg/g.从切制条件来看,薄片、中片、厚片总蒽醌(即游离型和结合型大黄素和大黄酚之和)含量平均分别为13.47、13.33和12.6mg/g;60℃干燥10.5 h、80℃干燥6.5 h和100℃干燥4 h,其总蒽醌含量平均分别为13.73、12.86和12.8 mg/g.结论:大黄类饮片切制的适宜条件为薄片或中片,60℃干燥10.5 h.     

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微量ATP的荧光素酶分析方法的研究

利用荧光素酶发光系统、测定ATP及有关的代谢物和酶的方法首先为McElvoy和Strechler报道。荧光素酶系统的发光机制可归纳为二步反应:LH_2(荧光素) ATP AMP·LH_2 P-P (1)LH_2·AMP 1/2 O_2→L·AMP~* H_2O→L·AMP hγ H_2O (2) 由于这一反应系统简单、快速、灵敏、专一性强,因此,不仅在生命科学研究中有重要的用途,而且在工农医生产中,也得到日趋广泛的应用。本文旨在说明:1.自己装置的测量仪器灵敏度     

高效毛细管电泳分离多种植物激素的方法研究

建立了高效毛细管电泳法分离测定茶叶中赤霉素(GA)、吲哚-3-乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、吲哚-3-丁酸(IBA)、细胞分裂素(CTK)等5种植物激素的分析方法。采用正交试验设计对高效毛细管电泳方法中的运行电压、缓冲液pH值和添加剂SDS浓度等分离条件进行优化,结果发现在30 mmol/L H3BO4-KH2PO4、40 mmol/LSDS组成的pH9.0缓冲液中,选择18 kV电压,25℃柱温和200 nm波长,可在11 min以内实现茶叶中5种激素的分离检测。本方法具有较高的灵敏度,5种激素的相关系数r=0.9907～0.9974,加标回收率为78.06%-95.5%,变异系数≤1.8%。利用本方法测定了茶叶不同部位的5种植物激素的含量变化。     

钨酸盐去阻遏的棕色固氮菌提取液中无机钼酸对固氮酶的活化

钨酸盐中培养并去阻遏的棕色固氮菌(W-Av)只有极微弱的固氮酶活性(0.3～0.5 nmole C_2H_4/分/毫克W-Av蛋白)。当以部分纯化的钼铁蛋白补入W-Av的提取液中,后者的固氮酶活性能够上百倍地提高。当有适量保险粉及ATP和ATP发生系统存在时,W-Av提取液与钼酸钠在30℃下保温,固氮酶得到活化。在本实验的最适条件下,固氮酶的活性可达5～8nmole C_2H_4/分/毫克W-Av蛋白或25～40n mole C_2H_4/分/n mole Mo。就固氮酶的活化来说,W-Av提取液是比较稳定的,在-15℃下冻存可维持二十天以上,60℃加热5分钟,总活性约降低一半。W-Av提取液与钼酸钠保温后在-15℃下保存四天,已活化的固氮酶活性也只比对照略为降低。钨酸盐抑制固氮酶的活化,但不抑制已活化的固氮酶活性。     

高效亲和色谱法测定牛初乳加钙咀嚼片中免疫球蛋白IgG的含量

目的:建立高效亲和色谱法(HPAC)测定牛初乳加钙咀嚼片中免疫球蛋白IgG含量的方法。方法:采用HI-Trap Protein G HP亲和色谱柱(1 mL)色谱柱,以0.05 mol/L磷酸盐缓冲液和0.05 mol/L的甘氨酸-盐酸缓冲液为流动相,流速0.4 mL·min-1,检测波长280 nm,柱温30℃。结果:IgG含量在0.1502~0.7512 mg/mL浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 9);平均回收率为98.5%,RSD为1.2%(n=6)。结论:方法简便、快速,重现性好。可作为牛初乳加钙咀嚼片的质量控制方法。     

荧光素浓度对于用荧光素酶测定ATP含量的影响

在粗荧光素酶液中加合成的荧光素和不加荧光素,观察其发光反应动力学,反应系统中外加荧光素后,发光强度明显增加,以适当低浓度的荧光素酶液的发光强度增加最大。在室温(20℃)下,不同贮放时间的荧光素酶液,其反应活性随贮放时间的延长而下降。外加荧光素后,反应活性可以恢复并达到最大后保持恒定。在-15℃贮放一年后的荧光素酶粉剂,反应活性下降,外加荧光素后,反应活性可以提高到原来的水平。     

腺苷三磷酸和环腺苷单磷酸对丝状真菌纤维素酶合成的调节

以虫荧光素酶法检验了四株丝状真菌在葡萄糖—无机盐液体培养过程中的胞内ATP含量。结果表明,只有当胞内ATP浓度低于10~(-S)mg/ml时,真菌才开始合成胞外纤维素酶(FPA)。以不同浓度的各种碳源培养时,菌体胞内ATP含量只要超过10~(-1)mg/ml,FPA的合成即发生阻遏。菌体胞内ATP含量与FPA合成呈显著负相关。以高效液相色谱(HPLC)法检测了菌体培养液中的cAMP含量。在非阻遏条件下,外源cAMP可以提高FPA的合成水平。但外源cAMP不能解除已经发生的酶合成阻遏。菌体ATP和cAMP水平是调节真菌纤维素酶合成的重要因子。     

食药用菌功能性β-葡聚糖荧光法测定研究

以酵母功能性β-1,3/1,6-葡聚糖为对照品,利用苯胺蓝和β-1,3/1,6-葡聚糖特异结合荧光特性,研究了葡聚糖荧光法测定时的各影响因素,建立了荧光法测定食药用菌功能性β-葡聚糖的方法。pH9.6缓冲液,80℃条件下避光反应15min,室温30min冷却后,398nm激发波长,508nm发射波长,20℃下进行荧光测定。在测定浓度2-20μg/mL范围内,荧光强度与浓度具有良好的线性关系(R2=0.9977),其中检出限为45μg/L,测定精密度和加样回收率良好,相对标准偏差(RSD)分别为1.86%和3.40%,并与酶法进行了比对验证,一致性良好,且荧光法更为节约时间和成本,并对灰树花菌、巴氏蘑菇、香菇和鲍氏针层孔菌四种食药用菌β-葡聚糖提取样品进行了葡聚糖纯度和提取率测定。     

甘油氧化酶发酵条件及酶学性质的研究

日本曲霉 (AspergillusjaponicusAj113)发酵生产甘油氧化酶 (GlycerolOxidaseEC 1 1 3 - )的最适产酶条件 :初始pH 6 0- 6 5 ,温度 2 9± 1℃ ,培养时间 36h ,5 0 0ml三角瓶发酵液的装量为 10 0ml;酶的最适作用pH为 5 0 ,该酶在pH9 5 ,温度 30℃以下时稳定性较好 ;0 0 5mol L的硼砂 -碳酸钠缓冲液 (pH9 5 )对酶有较好的保存效果 ,Zn2 + 、Cu2 + 、Fe3+ 、Ca2 + 离子对酶有激活作用 ,Hg2 +离子对酶有强烈的抑制作用     

符合大肠癌早期无创分子诊断要求的粪便DNA样本贮存条件考察

目的:考察在不同温度下储存时间和反复冻融对粪便中人基因组DNA含量的影响。方法:1.将粪便样本在室温、4℃、-40℃和-70℃条件下分别放置不同时间和-40℃条件下保存并反复冻融后,使用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒提取得到粪便DNA,通过实时荧光定量PCR体系对人KRAS基因定量确定人基因组DNA含量,评价粪便样本不同冻存条件对其中人基因组DNA含量的影响。2.将粪便DNA样本在4℃和-40℃条件下分别放置不同时间和-40℃条件下保存并反复冻融后,评价粪便DNA样本不同冻存条件下对其中人基因组DNA含量的影响。结果:1).粪便样本常温放置2小时,其中人基因组DNA即发生明显降解(P0.01),4℃可保存3天左右,-40℃可保存4周,-70℃可保存3个月以上,粪便反复冻融第3次,其中人基因组DNA降解具有统计学意义(P0.05)。2).粪便DNA 4℃可保存3天,-40℃可保存4周,粪便DNA反复冻融第4次,其中人基因组DNA降解具有统计学意义(P0.05)。结论:符合大肠癌早期无创分子诊断要求的粪便DNA贮存条件:粪便样本室温收集后尽快保存;短期可处理的粪便样本存放在4℃条件下(3天内);暂无法处理则存于-40℃(1个月内);粪便样本长期保存在-70℃条件下,可保存3个月。     

3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体文库高通量筛选方法的建立

[目的]建立一种快速、高通量筛选3-甾酮-Δ¹-脱氢酶(KstD)突变体库的方法。[方法]基于已发表KstD蛋白晶体结构,设计饱和突变引物,构建突变体文库,优化蛋白表达条件,利用冻融法结合溶菌酶法获得粗酶液;基于分光光度法原理,优化检测反应体系,利用酶标仪检测吸光度的变化来反映酶活力。[结果]利用饱和突变引物成功构建突变体文库,表达KstD最佳条件为：IPTG终浓度0.3 mmol/L,20℃诱导20 h;缓冲液中溶菌酶浓度为0.5 mg/mL时上清目的蛋白含量最高。优化后的酶活检测条件为：Tris-HCl缓冲液50 mmol/L、pH 8.0、0.4 mmol/L DCPIP、1.5 mmol/L PMS、0.7 mmol/L雄烯二酮(4AD)和适量的酶液组成,温度30℃、酶反应时间5 min,于600 nm波长下测定。[结论]成功建立了一种5 min检测96个3-甾酮-Δ¹-脱氢酶(KstD)突变体的高通量筛选方法,重复性变异系数在3%以下。     

花序开放程度、栽培温度和贮藏条件对菊花品种‘钟山金阳’花粉萌发的影响

采用离体培养法和杂交实验法,以菊花品种‘钟山金阳’(Chrysanthemum morifolium‘Zhongshanjinyang’)为实验材料,比较了不同的花序开放程度(花序开放天数和散粉阶段)、栽培温度和贮藏条件对其花粉萌发的影响。离体培养结果表明:在花序开放的第2至第7天花粉萌发率为22.6%~17.3%,第9天为7.7%,第11天仅为2.8%;在散粉的第1阶段(第1和第2轮管状花散粉)和第2阶段(第3和第4轮管状花散粉)花粉萌发率分别为19.5%和17.8%,第3阶段(全部管状花散粉)花粉萌发率仅为9.4%,表明随花序的开放和散粉阶段的延续,花粉萌发率均呈逐渐降低的趋势。在昼/夜温度5℃/0℃、10℃/5℃、15℃/10℃、20℃/15℃、25℃/20℃和30℃/25℃条件下栽培一定时间,其花粉萌发率和花粉管长度均有明显差异;其中,10℃/5℃栽培组培养4.0 h的花粉萌发率最高(23.0%),而30℃/25℃栽培组培养0.5 h的花粉萌发率最低(1.2%);15℃/10℃和20℃/15℃栽培组培养4.0 h的花粉管长度较长(分别为144.4和146.1μm),而30℃/25℃栽培组培养0.5 h的花粉管长度最短(38.3μm)。在不同贮藏温度下[4℃、-20℃和室温(约25℃)],新鲜和干燥花粉的萌发率均随贮藏时间的延长逐渐下降,但降幅存在明显差异;其中,新鲜花粉贮藏12 d后花粉萌发率从21.4%降至5.0%以下,干燥花粉贮藏26 d后花粉萌发率降至5.0%以下;总体上看,干燥花粉的萌发率和贮藏时间均高于新鲜花粉,以-20℃条件下贮藏的干燥花粉萌发率最高且可贮藏至50 d以内。杂交实验结果显示:用不同栽培温度下的品种‘钟山金阳’的花粉对品种‘钟山粉碟’(‘Zhongshanfendie’)进行人工授粉,在柱头上花粉萌发数差异明显;其中,10℃/5℃栽培组的花粉萌发数最多(55.5),30℃/25℃栽培组的花粉萌发数最少(8.8),且二者间差异显著(P0.05)。综合分析结果表明:花序开放天数、散粉阶段、栽培温度及贮藏条件对菊花品种‘钟山金阳’的花粉萌发率均有明显影响。根据研究结果,建议菊花品种‘钟山金阳’花粉的最佳采集时期为花序开放的7 d内且为第1至第4轮管状花散粉阶段,栽培温度应维持在10℃左右,而且采集的花粉应置于-20℃干燥条件下贮藏。