家蚕BmN铁微载体培养及HBeAg的高效表达

选择微载体Ｃｙｔｏｄｅｘ３对家蚕ＢｍＮ（从Ｓｉｌｉｗｏｒｍ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ获得的细胞系）细胞进行高密度培养,并获得成功。观察了家蚕ＢｍＮ细胞在微载体Ｃｙｔｏｄｅｘ３上的贴壁分布,研究了不同接种浓度与微载体浓度时细胞的生长情况,并筛选出最佳的技术参数。在１０００ｍＬ滚瓶中用微载体Ｇｙｔｏｄｅｘ３培养家蚕细胞,在合适的培养条件下（细胞接种浓度３．６×１０＾５细胞／ｍＬ、微载体浓度５ｇ／Ｌ）,５     

家蚕BmN细胞的微载体培养及HBeAg的高效表达

选择微载体Ｃｙｔｏｄｅｘ３对家蚕ＢｍＮ（从ＳｉｌｋｗｏｒｍＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉ获得的细胞系）细胞进行高密度培养,并获得成功。观察了家蚕ＢｍＮ细胞在微载体Ｃｙｔｏｄｅｘ３上的贴壁分布,研究了不同接种浓度与微载体浓度时细胞的生长情况,并筛选出最佳的技术参数。在１０００ｍＬ滚瓶中用微载体Ｇｙｔｏｄｅｘ３培养家蚕细胞,在合适的培养条件下（细胞接种浓度３．６×１０５细胞／ｍＬ、微载体浓度５ｇ／Ｌ）,５ｄ后,细胞的终密度达到２．８×１０６细胞／ｍＬ,细胞增长指数为７．９。在细胞指数生长期（传代后４８～６０ｈ）用载有ＨＢｅＡｇ基因的重组病毒（ｒＢｍＨＢｅ）接种（感染量为０．４ＰＦＵ／细胞）,５ｄ后,培养上清中ＨＢｅＡｇ滴度为１∶９．６×１０４,是用方瓶静止培养的家蚕细胞表达量的３倍。     

两种昆虫细胞的微载体培养

斜纹夜蛾细胞系(SL-1)和家蚕细胞系(BmN)均能在国产微载体上正常生长增殖。以3mg/ml微载体培养细胞,两种昆虫细胞生长最高密度分别为8.2×10~5细胞/ml和7.6×10~5细胞/ml。扫描电镜观察显示一个微载体可贴附几十个,有的多达上百个细胞。两性昆虫细胞的微载体培养特征与常规静止培养无甚差异。     

国产生物反应器大规模高密度培养Vero细胞

本文考察了在2．5LcelliGen细胞培养器和国产20LcellCul-20细胞培养生物反应器中采用微载体技术培养细胞的情况。分析了用cellcul-20细胞培养生物反应器进行大规模培养时细胞的生长、代谢规律,研究了从2．5L扩大到20L规模的细胞转移条件。采用微载体球间直接转移技术。提高了接种效率,减少了接种步骤和污染机会。当国产GT一25微载体用量为5g／L,采用连续灌注工艺培养vero细胞,在国产20L cellCul—20细胞培养生物反应器中,连续培养5天,细胞数增加7倍,细胞密度超过1．0×10⁷ cells／m】。本文开发的细胞培养工艺,对于中试及工业规模的动物细胞大量培养具有一定的指导意义。     

微载体高密度培养Vero细胞的研究

微载体是动物细胞高密度培养的有效手段。首先在硅化的方瓶中对Cytodex 1、Cy-todex 3、Biosilon、Bellco Glass Microcarrier、CT-1、CT-3、MC-1、CT-28种国产和进口微载体进行了比较和筛选。确定以Biosilon作为Vero细胞高密度培养的首选微载体。用500mlWheaton搅拌瓶探索影响Vero细胞高密度培养的条件,表明50～60mg/ml的微载体浓度、1～2×10⁶/ml的细胞接种密度、适当的通气(95％O_2+5％CO₂)对该细胞的高密度培养具有重要意义。在200ml培养体积的Wheaton搅拌瓶中,微载体浓度为50～60mg/ml,细胞接种密度为9.24×10⁵/ml,搅拌速度为65～85r/min,经25d培养,Vero细胞密度可达2.34×10⁷/ml,表明50～60mg/ml的微载体浓度对培养细胞没有毒性。接着在1.5L CelliGen生物反应器中进行培养,细胞接种密度为4.98×10⁵/ml,培养体积为1.2L,日灌流量从0.20L逐渐加大到3.65L,经22d连接灌流培养,最终细胞密度可达2.05×10⁷/ml。     

用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素

构建了家蚕核多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)新型载体pBm92,该载体将多角体蛋白基因的起始密码ATG改变为ATT,然后在多角体蛋白基因的+12位后连接有5个外源基因的克隆位点。将HulFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的+12位后,构建了pBmIFN+12;同时构建了HuIFN－β克隆在－3位后的转移载体pB．mIFN－3。将两种转移载体DNA分别与BmNPV基因组DNA共转染Bm—N细胞。利用重组病毒不产生多角体蛋白的特征,筛选重组病毒。用HuIFN－β基因探针与重组病毒DNA进行杂交鉴定。重组病毒BmIFN+12感染Bm-N细胞,其上清IFN活性为2．0×10⁶Iu／ml,将BmIFN+12注射5龄家蚕虫体,表达水平为5．O×10⁷Iu／ml,是HulFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的-3位后获得的重组病毒表达量的2—4倍。构建的新型BmNPv载体能够在家蚕高效地表达HuIFN-β。家蚕虫体生产的rHulFN-β蛋白具有天然HuIFN-β的抗原性。     

葡萄糖的添加对昆虫细胞Sf21悬浮生长的影响

添加葡萄糖对昆虫细胞Sf21(Spodoptera frugiperda)悬浮生长的影响,发现补加糖量在lg／L时·能明显提高细胞生长的速度和最高密度,细胞最高密度由2．5×10⁴／ml增加到4.9×10⁶／ml; 朴加糖量在2g／L时,则有显著的抑制作用,即使增加接种密度．细胞生长的最高密度也只有2．1×10⁶／ml。当采取流加葡萄糖方法来培养细胞时,则其生长的最大密度可提高到5．2×10⁶／ml。     

家蚕微孢子虫感染对家蚕BmN细胞凋亡以及凋亡蛋白抑制因子IAPs表达的影响

【目的】在无任何外界凋亡因素诱导条件下,探究家蚕微孢子虫感染对家蚕卵巢细胞-BmN凋亡的影响,以及凋亡蛋白抑制因子IAPs实相表达的变化情况。【方法】显微镜下观察家蚕微孢子虫感染BmN细胞后不同时间段宿主细胞的变化情况,以及利用荧光定量PCR方法检测家蚕促凋亡基因——细胞色素C(BmCyt c)表达水平的变化,随后检索家蚕基因组与蛋白质家族数据库搜寻家蚕凋亡蛋白抑制因子IAPs基因信息,并通过荧光定量PCR方法对这些基因的实相表达情况进行定量分析。【结果】家蚕微孢子虫感染BmN细胞的前5 d,细胞状态未见明显变化。感染后7 d,BmN细胞的生长受到了一定程度的影响。第12天时,对照组中几乎所有细胞出现空泡化或细胞死亡的现象,而感染家蚕微孢子虫的BmN细胞未见空泡的出现,并且大量细胞形态完整,细胞核清晰可见。同时,BmCyt c基因的表达几乎一直处于被抑制状态,特别是感染后的第10天与第12天,该基因的表达量显著性降低(P0.01)。通过数据库检索共得到4个家蚕凋亡蛋白抑制因子:BmIAP-1、BmIAP-2、BmSurvivin-1与BmSurvivin-2。荧光定量PCR结果表明:BmIAP-1和BmSurvivin-1基因在感染后期(10 d与12 d)表达量有上升趋势,尤其是感染后的12 d,表达量显著上升(P0.01)。然而,BmIAP-2与BmSurvivin-2基因的表达在大多数时间段均处于下调状态。【结论】当无任何外界凋亡因素诱导条件下,家蚕微孢子虫感染BmN细胞后可影响宿主细胞的生长,并可抑制细胞的正常生理凋亡。依据荧光定量PCR结果,我们推测在家蚕微孢子虫感染BmN细胞时,BmIAP-1和BmSurvivin-1蛋白可能在调节细胞凋亡的过程中起一定作用。     

家蚕生存素基因在BmN4细胞有丝分裂中的功能分析

【目的】阐明生存素基因在家蚕Bombyx mori BmN4细胞有丝分裂中的功能。【方法】qRT PCR分析家蚕生存素基因BmSurvivin在家蚕5龄第3天幼虫不同组织(丝腺、中肠、马氏管、精巢、卵巢、脂肪体、皮细胞层和表皮)中的表达量;构建pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP (BG)融合载体并转染BmN4细胞,以免疫荧光标记检测BmSurvivin和第10位丝氨酸(Ser10)磷酸化的组蛋白H3(H3Ser10ph)在BmN4细胞有丝分裂分裂不同时期的定位。【结果】BmSurvivin在家蚕5龄第3天幼虫马氏管中表达量最高,其次是在丝腺和中肠中。成功构建pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP载体。免疫荧光结果显示,在BmN4细胞间期核中可以看到明显的GFP信号,涵盖了细胞核和细胞质区域,指示BmSurvivin的定位;随着细胞进入分裂期,GFP信号指示BmSurvivin与染色质共定位,待细胞形成明显的双取向时在纺锤体区域也可以看到GFP信号;后期随着姐妹染色单体分开,GFP信号指示BmSurvivin定位在染色质及胞质分裂区;末期随着两个新的子细胞形成GFP信号指示BmSurvivin仅定位在胞质分裂区。H3Ser10ph定位在BmN4细胞前中期染色质凝缩处,至中期信号最强,与整条染色体重合,后期信号消失。【结论】BmSurvivin与有丝分裂周期中染色质和纺锤体的动态变化相关。     

微载体浓度与细胞接种密度对ST细胞生长的影响

选择合适的微载体浓度、细胞接种密度以提高微载体利用率,优化微载体培养体系猪睾丸细胞(Swine testicle cells)的贴附生长与维持。使用DMEM补加10%血清、LSM(Low serum medium)两种培养基考察微载体浓度、细胞接种密度对细胞生长维持的影响,进而比较ST细胞在不同条件下对Cytodex1微载体的利用率。结果显示,使用LSM在T150方瓶中连续传代培养30d,平均比生长速率为0.626d~(0-1),是DMEM补加10%FBS培养基的1.15倍。选择10×10~5cells/mL细胞接种3g/LCytodex1搅拌瓶体系,最大细胞密度为38.3×10~5cells/mL,微载体利用率上升到58.8%。在灌注培养体系中培养ST细胞15d,最终细胞密度达到36.6×10~5cells/mL,扩增了13.6倍。微载体悬浮培养的使用一方面有利于ST细胞的贴附与生长,实现高密度生长,另一方面增加了微载体的使用成本,选择合适的微载体浓度、细胞接种密度,能够最大化利用微载体与培养基中的营养物质实现细胞的最优生长。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

Cause of Senescence of Nine Sorts of Flowers

The levels of endogenous phytohormones and respiratory rate in nine sorts of flowers such as Cymbidium faberi Rolfe, Nopalxochia ackermannii Kunth and others were investigated both at full bloom and senescence and meanwhile the effect of exogenous phytohormones on prolonging the blossoms and promoting ethylene production were tested. There is a high content of endogenous ethylene in all the long-lived flowere, about 3–16 folds higer than the short-lived ones. There is a high level of ABA at full blooming flowers of short-lived flowers, in which there is no or only some cytokinins in it, but the ratio of CTK (6BA+zeatin)/ABA is smaller(l.7). The endogenous ABA reached a much higher level at senescence in all nine sorts of flowers, so it is reasonable to consider that it is ABA which plays an important role of regulation in controlling flower's senescence. There is a much higher level of GA3 and zeatin in the long-lived flowers which is not demonstrated in the shortlived ones. The respiratory rate is one of the factors controtling the longevity of flowers, but it does not play a decided role. Application of 6BA and zeatin prolongs distinctly orchid’s longevity, however exogenous IAA through the promotive action on ethylene production, evidently extends the longevity of the flowers of the Nopalxochia ackermannii Kunth.     

真菌类遗传学分析的知识结构教学

本文以认知结构理论为指导,讨论了真菌类遗传分析与高等动植物遗传分析的内在联系,认为利用这种内在联系进行教学可收到好的效果并说明了作者的具体教学过程。 Abstract:In the paper, the relationship between genetic analysis of Fungi and genetic analysis of high animal and plant was discussed.A good results were obtained when we adopted this method in the teaching.     

医疗机构合理用药评价模型的构建研究

目的 针对医疗机构的合理用药水平进行评价研究。方法 根据医疗机构合理用药的具体要求,构建医疗机构合理用药评价指标体系,采用基于模糊群决策的方法和多指标评价分析法构建医疗机构合理用药评价模型。结果 构建了基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型,并通过实例分析证明了评价模型的可行性。结论 建立的基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型能够对医疗机构的合理用药水平进行科学评价,为提高医疗机构合理用药水平奠定基础。     

棉铃虫钙粘蛋白N端多肽多克隆抗体制备及对Bt抗性的初步检测

用重组表达的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)中肠钙粘蛋白N端多肽片段制备兔多克隆抗体,并利用其对Bt抗性进行鉴定。通过RT-PCR方法对棉铃虫中肠钙粘蛋白N端多肽的基因片段Cad285进行PCR扩增,将其克隆到pET-30a原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到35ku的重组融和蛋白,融合表达的包涵体经过变性、Ni-NTA柱亲和纯化、复性等方法处理包涵体,获得可溶性纯化蛋白,用纯化后蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测其效价高于1∶16000;利用最终获得的多克隆抗体对室内纯合Bt抗/感品系的棉铃虫中肠钙粘蛋白进行Western blot分析,结果显示敏感和抗性品系之间有明显差异,表明其能够应用对Bt抗性进行初步检测。     

龙胆科药用植物化学成分的研究现状

龙胆科植物在我国的分布范围很广,且多数为药用植物,其多数种属的药用植物,至今其化学成分尚未被系统研究。综述了目前龙胆科药用植物的化学成分的研究现状及一般提取方法,对近年来发现的环烯醚萜及裂环烯醚萜类化合物进行了总结,为本科药用植物的更深入研究提供了参考。     

青蒿素生物合成机理研究现状

本文总结了目前有关青蒿素生物合成机理方面的研究,主要包括青蒿素生物合成中生理因子的影响,青蒿素生物合成中间体及前体,青蒿素生物合成细胞定位等。指出了存在的一些问题及今后的研究发展前景。