巨噬细胞细胞内吞过程中膜受体流动性的测量——两种标记受体…

本文首次实现了细胞内吞过程中膜受体流动性的测量。实验选择巨噬细胞膜和伴刀豆凝集素Ａ（ＣｏｎＡ）。分别用ＣｏｎＡ－Ｂｉｏｔｉｎ＋Ａｖｉｄｉｎ－ＦＩＴＣ（ＡＢＣ法）和ＣｏｎＡ－ＦＩＴＣ（直接法）两种方法标记巨哓细胞膜ＣｏｎＡ受体,比较了这两咱方法标记的巨噬细胞ＣｏｎＡ受体的荧光强度,利用ＦＲＡＰ技术。分别用两种标记方法测量了巨细胞ＣｏｎＡ受体的流动性。结果显示ＣｏｎＡ－Ｂｉｏｔｉｎ＋Ａｖｉｄｉｎ－ＦＩ     

测量细胞内吞过程中膜受体流动性的新方法

本文首次提出用ＡＢＣ（ＡｖｉｄｉｎＢｉｏｔｉｎＣｏｍｐｌｅｘ）法标记细胞膜受体,通过ＦＲＡＰ（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＲｅｃｏｖｅｒｙＡｆｔｅｒＰｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）技术,测量细胞内吞过程中受体流动性变化的方法。实验选择巨噬细胞ＣｏｎＡ受体,比较了用ＣｏｎＡ－Ｂｉｏｔｉｎ＋Ａｖｉｄｉｎ－ＦＩＴＣ（ＡＢＣ法）和ＣｏｎＡ－ＦＩＴＣ（直接法）标记的膜表面ＣｏｎＡ受体荧光强度和内吞过程中受体的流动性测量结果。结果显示ＣｏｎＡ－Ｂｉｏｔｉｎ＋Ａｖｉｄｉｎ－ＦＩＴＣ标记的巨噬细胞膜受体的平均荧光强度比用ＣｏｎＡ－ＦＩＴＣ标记的平均荧光强度高大约３倍;ＡＢＣ法标记的受体,测量结果误差小、灵敏度高;ＣｏｎＡ刺激１５ｍｉｎ后,巨噬细胞膜表面ＣｏｎＡ受体的扩散系数和荧光恢复率较静息状态时明显下降。讨论了两种标记方法对测量结果的影响     

巨噬细胞吞噬过程中膜磷脂流动性和受体流动性的关系

本文用ＦＲＡＰ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｃｏｖｅｒｙａｆｔｅｒｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）技术,测量了静息状态和刀豆素Ａ刺激不同时间后巨噬细胞膜磷脂、ＣｏｎＡ受体扩散系数和荧光恢复率的变化。结果显示ＣｏｎＡ刺激后膜磷脂和ＣｏｎＡ受体的扩散系数和荧光恢复率均较静息状态的巨噬细胞明显降低,磷脂流动性的变化与ＣｏｎＡ受体流动性的变化呈正相关。提示受体介导内吞导致的膜磷脂流动性的降低,可能是由于配体与细胞膜上受体结合形成配体－受体复合体,增加了受体的负荷,使受体的流动性降低,进而使膜磷脂的流动性降低。巨噬细胞内吞过程中膜磷脂和ＣｏｎＡ受体流动性的降低,可能还与ＣｏｎＡ刺激后巨噬细胞胞浆ｐＨ值有关。     

ABC法在膜受体流动性测量中的应用

本文首次把ABC法应用于受体流动性测量中的膜表面受体荧光标记,利用FRAP(Fluorescence Recovery After Photobleaching)技术实现了细胞内吞过程中膜受体流动性变化的测量.实验用Con A—Biotin和Avidin—FITC(ABC法)标记巨噬细胞ConA受体,测量ConA刺激不同时间细胞膜表面受体的荧光强度、扩散系数和荧光恢复率的变化.结果显示ABC标记法适合于测量细胞内吞过程中膜表面受体的流动性变化,且具有较高的灵敏度高;巨噬细胞受ConA刺激后,膜表面ConA受体的扩散系数和荧光恢复率较静息状态时明显降低.     

ATP对巨噬细胞内吞和溶酶体pH的影响

ＦＩＴＣ－ｄｅｘｔｒａｎ标记培养的小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体,ＣｏｎＡ－ＦＩＴＣ标记细胞内吞。用激光扫描共聚焦显微镜测量伴刀豆球蛋白（ＣｏｎＡ）、ＡＴＰ引起的巨噬细胞溶酶体ｐＨ动态变化和ＡＴＰ对细胞内吞ＣｏｎＡ－ＦＩＴＣ的影响。结果显示ＣｏｎＡ引起巨噬细胞溶酶体ｐＨ迅速增加,６ｍｉｎ左右达到峰值（ｐＨ５．７）;ＡＴＰ刺激３０ｍｉｎ后再加入ＣｏｎＡ,溶酶体ｐＨ无明显变化（ｐＨ４．０）;同时加入ＡＴＰ和ＣｏｎＡ,５ｍｉｎ左右溶酶体ｐＨ降到最低点（ｐＨ４．１）;ＡＴＰ对巨噬细胞内吞ＣｏｎＡ－ＦＩＴＣ有明显的抑制作用。探讨了受体介导内吞与溶酶体ｐＨ的关系。     

伴刀豆球蛋白A与巨噬细胞膜上受体作用下膜变形性及细胞吞噬能力变化

本文采用图像分析、相差显微、生物活性测定等技术,研究ConA与巨噬细胞膜受体结合后对细胞行为与功能的影响. ConA与受体结合后巨噬细胞膜面积增大、变形性和吞噬能力增强、细胞产热量增加,表明细胞膜结构与功能发生变化.本实验是将图像分析技术用来研究相对图像采集速度要慢得多的活细胞特性的一次成功尝试.     

伴刀豆球蛋白A与巨噬细胞膜受体结合对膜下F－actin的影响

配体与膜受体结合可启动细胞信息传递通路,激活细胞并产生生物学效应。应用共聚焦激光扫描显微术,流式细胞分光光度计,生物活性测量等技术,研究ＭＡ与巨噬细胞膜受体结合后,膜下肌动蛋白丝构筑和含量随时间变化,以及细胞热能量改变。结果是ＣｏｎＡ结合巨噬细胞膜受体后,膜下肌动蛋白多聚化加快,构筑成细胞内Ｆ－ａｃｔｉｎ立体空间网络,Ｆ－ａｃｔｉｎ含量增加具有时间相关性,细胞热能量增加。巨噬细胞内这些变化提示ＣｏｎＡ通过膜受体诱导膜下肌动蛋白多聚化和构筑过程有信息传递和激活细胞等重要作用。     

不同配体与同一膜受体结合的初步探讨

研究了伴刀豆球蛋白A(ConA)和层粘连蛋白(LN)与巨噬细胞膜受体竞争结合,初步推测两个配体与同一膜受体结合的可能性.结果表明,LN可以竞争抑制FTTC-ConA与巨噬细胞膜受体的结合,说明ConA和LN两种配体各自的巨噬细胞膜受体中有部分可能是共同的,而加入ConA反而增加巨噬细胞膜上结合的FITC-LN量,这可能是因为ConA和LN的分子特性导致的.     

受体介导内吞对巨噬细胞膜电位、胞浆和溶酶体pH的影响

本文利用荧光标记方法测定了刀豆素Ａ、麦芽凝集素、酵母多糖刺激引起的巨噬细胞膜电位、胞浆ｐＨ溶酶体ｐＨ的变化。结果显示三种配体均导致细胞膜电位超极化,胞浆ｐＨ降低、溶酶体ｐＨ或高,三个生理参量趋于稳定时间稍有不同。胞浆ｐＨ的降低可能有抑制内吞的作用,溶酶体ｐＨ上升是触发溶酶体内容物外排的基本因素。内吞引起的这些变化是细胞代谢过程中自我调节和保护的表现。     

受体介导内吞引起的巨噬细胞胞质酸化和胞吐作用

The effects of Con A, WGA, Zymosan A on macrophage cytosolic pH and outflow of lysosomal content through exocytosis were studied with SNAFL-calcein and FITC-Dextran on ACAS570. The results showed all three ligands could induce macrophage cytosolic acidification in about 10 min and kept at the same level hereafter; outflow of lysosomal fluorescent probe through exocytosis appeared in 15-20 min. In resting conditions, macrophage lysosomes mainly distributed in cell center; after stimulated for 15 min by three ligands, the number of lysosomes increased in membrane periphery, in 25-30 min lysosomes moved back toward cell center. We proposed that ligands induced lysosomal pH rises was a basic factor for outflow of lysosomal content through exocytosis, cytosolic acidification inhibited receptor-mediated endocytosis. Cytosolic acidification and outflow of lysosomal content through exocytosis were the results of cellular self-regulation and self-protection during receptor-mediated endocytosis.     

人胃癌不同周期细胞膜表面ConA受体的分布与侧向运动

本文研究了人胃低分化粘液性腺癌细胞MGC 80-3不同周期时相中ConA受体的分布与侧向运动。MGc 80-3细胞经同步化培养,用F-ConA标记。被标记细胞中G_1、S和G_2期呈不连续的分布,但它们之间又存在显著的差异。M期呈较均匀的强荧光分布(与其它时相细胞比较)。荧光漂白恢复方法测定ConA受体复合物侧向运动表明:各个周期时相之间不仅运动方式不同,而且运动速率也有显著差异。M期与G_1期主要表现出扩散型运动;而S期与G_2期表现为流动型运动。G_1期的扩散系数大干M期的;S期的流动速率大于G_2期的。但可动分子百分比以G_2期最高。这些结果表明了ConA受体的动力学性质。它受到细胞周期的调节。