拮抗菌株的筛选及其发酵滤液抑菌活性考察

从土壤中筛选出3株具有抑菌活性的菌株,其中1#菌株对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、灰霉葡萄孢菌、变异链球菌、大肠杆菌均有较强抑制作用,初步鉴定为地衣芽孢杆菌。对其性质进行考察结果表明,在30℃,pH 7.0,150 r/min的条件下,恒温振荡培养24 h,测其发酵滤液的抑菌活力约为2 000 IU/mL。该发酵滤液具有较强的热稳定性,60℃放置1 h,抑菌活性下降了29%;100℃放置30 min,抑菌活性下降了45%,放置1 h,抑菌活性下降了48%;121℃放置1 h,抑菌活性仍能保持40%。该发酵滤液抑菌作用的最适pH值为7.0,在pH 3.0时能保持71%的抑菌活性,在pH 11.0时,仍能维持67%的抑菌活性,此发酵滤液对蛋白酶K不敏感,并且蛋白酶K对该发酵滤液的抑菌活性也起一定的促进作用。     

金黄色葡萄球菌滤液制剂中肠毒素的检测研究

使用反向被动血凝试验(RPHA),对金黄色葡萄球菌滤液制剂中的肠毒素(SET)进行了检测研究.证明已生产和临床应用近10 a的金黄色葡萄球菌滤液制剂中检测到SET存在.其型别系属SET中的C型.按原生产工艺所生产的金黄色葡萄球菌滤液制剂原液中SET的含量在12.5～50 mg/L.生产时欲提高SET含量的条件试验中证实,使用葡萄球菌产毒的胰酪胨综合培养基,以摇瓶方式培养24～36 h,可使SET含量比用生产培养基培养提高16倍.金黄色萄萄球菌滤液制剂中SET的成分是极其稳定的,室温存放2 a未见该成分降低.其半衰期可达4 a.在采用RPHA和RPLA检测SET比较试验中证明:RPLA试剂的敏感性高于RPHA的4倍.但对于检测金黄色葡萄球菌滤液制剂中SET的实际含量几乎是相等的.     

反复冻融对枯草芽孢杆菌St-zn-34抑制链格孢菌活性的影响北大核心CSCD

【目的】以从冬枣分离的内生枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis St-zn-34)为供试菌株,明确反复冻融对菌体形态及其发酵滤液抑制枣缩果病初侵染病菌(Alternaria alternata)活性的变化。【方法】对供试菌株分批发酵后进行反复冻融,采用梯度稀释计数法、滤纸片法分别测定活菌数量和芽孢含量、发酵滤液抑菌活性,对供试菌株的形态变化进行电镜观察。【结果】发酵培养中pH值、活菌量、芽孢量及抑菌活性随发酵时间的增加均呈先上升后下降的趋势,其中发酵60 h发酵滤液抑菌活性最大,对此时的发酵液反复冻融,冻融3次枯草芽孢杆菌活菌量和发酵滤液抑菌活性依次减少,以后再冻融差异不显著(P>0.05),电镜观察发现随冻融次数增加,菌体变小,表面凹陷、扭曲,胶状物流出。抑菌谱检测发现发酵滤液对12种植物病原菌具有抑菌能力。不同温度和蛋白酶处理发酵滤液表明,低于60℃以下,抑菌活性与对照相比差异不显著;80℃以上抑菌活性随温度上升而下降,与对照相比差异显著;蛋白酶K可降低抑菌活性。【结论】反复冻融影响细菌形态并降低发酵滤液的抑菌活性。     

基于功能宏基因组学技术的金黄色葡萄球菌生物被膜抑制物的发现与活性分析

宏基因组学方法直接提取环境中的全部微生物基因组DNA,并使其得到功能性表达,为微生物天然产物的开发利用提供了新的方法。利用功能宏基因组学技术,使用大肠杆菌-链霉菌穿梭载体构建四川峨眉山土壤宏基因组文库,并将文库菌中所携带的环境DNA接合转移到链霉菌宿主中。通过活性筛选获得两个具有抗菌活性的阳性链霉菌克隆,其发酵粗提物对金黄色葡萄球菌生物被膜的形成均有很好的抑制作用,当浓度达到2 MIC(Minimum inhibitory concentration)时,抑制作用超过90%;同时,两种粗提物样品对金黄色葡萄球菌生物被膜也存在显著的清除作用,其中EM110样品对金黄色葡萄球菌生物被膜的清除率高于EM123样品。本文通过功能宏基因组学技术,直接从土壤中筛选获得了对金黄色葡萄球菌生物被膜有较强抑制及清除作用的活性物质。     

乳酸杆菌发酵滤液对人宫颈癌细胞株Hela细胞的抑制作用

目的观察乳酸杆菌DM9811发酵滤液及其主要成分对宫颈癌细胞株Hela细胞的体外增殖的影响,探索乳酸杆菌发酵滤液对宫颈癌细胞是否有抑制作用及解析作用的有效成分。方法用MTr法研究不同浓度乳酸杆菌DM9811发酵滤液在不同时间对Hela细胞的抑制作用,在此基础上研究脂肪酸、菌体核酸在不同时间对Hela细胞的抑制作用。结果不同浓度乳酸杆菌DM9811发酵滤液及相关物质在不同时间对Hela细胞的抑制作用显示：（1）乳酸杆菌DM9811发酵滤液各浓度组对Hela细胞的生长均有抑制作用,且这种抑制作用呈剂量-时间依赖方式。24、48、72h达到半数抑制率的发酵滤液浓度分别为8．9％、5．3％、3．8％。（2）乳酸杆菌DM9811发酵滤液脂肪酸对Hela细胞的生长有一定抑制作用,抑制率在7．0％～34．0％。（3）乳酸杆菌DM9811菌体核酸对Hela细胞的生长有抑制作用,抑制率为9．7％-53．4％,呈剂量一时间依赖方式。72h达到半数抑制率核酸的浓度为5．5μg/ml。结论乳酸杆菌DM9811发酵滤液对Hela细胞的生长具有显著的抑制作用,其中脂肪酸组分是有效成分之一。     

FTA滤膜用于PCR检测肉中的金黄色葡萄球菌

利用FTA滤膜,采用PCR技术可直接检测肉及肉制品中的金黄色葡萄球菌,无需增菌,灵敏度高。在采用浮选与溶剂萃取相结合方法的基础上,使用FTA膜可高效地从鲜肉中提取金黄色葡萄球菌的DNA,消除PCR反应的抑制因子。以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因（nuc）为靶基因,经过PCR扩增得到279bp的产物。经过DNA测序证实该产物为目的扩增产物。使用FTA滤膜处理样品,再通过PCR方法检测金黄色葡萄球菌,猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉匀浆液的检出限均为10cfu/mL,可在6h内完成对肉中金黄色葡萄球菌的检测,比目前普遍采用的先增菌再进行PCR检测的方法缩短了12～24h 。实际检测了72份样品,同时与GB 4789.10-94方法及两种快速检测致病性金黄色葡萄球菌检测方法做比较,PCR方法的检出率为72.2％,检出时间为6h,GB 4789.10-94方法检出率为70.8%,检出时间为5d,Prfilm RSA方法的检出率为61.1％, 检出时间为18h,BairdParker R.P.F方法的检出率为69.4％,检出时间为18h,结果表明FTA滤膜用于PCR检测肉中金黄色葡萄球菌检出率高,耗时短。使用FTA滤膜法制备模板DNA,为食品中的致病菌快速检测构建了一个技术平台。     

金黄色葡萄球菌通过NF-κB信号对破骨细胞分化的影响及作用

为探讨金黄色葡萄球菌对破骨细胞分化的影响和可能的作用机制,本研究采用活的金黄色葡萄球菌、灭活的金黄色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌滤液处理RAW 264.7细胞5 d。观察破骨细胞样细胞和吸收凹坑的形成,并通过实时定量PCR检测破骨细胞特异性基因(TRAP, MMP-9,组织蛋白酶K, CTR和Atp6v0d2)的表达。此外,用蛋白质印迹法检测了与破骨细胞分化有关的信号通路中的关键蛋白。结果显示,灭活的金黄色葡萄球菌的感染复数和金黄色葡萄球菌滤液以及活的金黄色葡萄球菌(MOI为10∶1 CFU)对RAW 264.7细胞没有明显的细胞毒性。当没有RANKL时,活的金黄色葡萄球菌、灭活的金黄色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌滤液以剂量依赖性方式促进破骨细胞样细胞的形成及再吸收凹坑的诱导形成;当用JSH-23预处理时,活的金黄色葡萄球菌、灭活的金黄色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌滤液诱导的破骨细胞样细胞的形成明显减少,再吸收的凹坑诱导形成明显降低(p0.05)。RT-PCR结果显示,活的金黄色葡萄球菌、灭活的金黄色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌滤液以剂量依赖性方式增加了RAW 264.7细胞中破骨细胞特异性基因的mRNA表达;当用JSH-23预处理时,活的金黄色葡萄球菌、灭活的金黄色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌滤液诱导的破骨细胞特异性基因的表达明显降低(p0.05)。蛋白印迹检测结果显示,活的金黄色葡萄球菌处理后10 min,IκBα发生降解,而NF-κBp65的磷酸化在5 min和10 min时显著上升(p0.05),而Akt和MAPKs信号通路中的蛋白质没有明显变化。本研究结果可为理解金黄色葡萄球菌介导的骨髓炎的发病机理提供了分子基础。     

黑水虻抗菌肽诱导条件优化及粗提物活性研究

采用不同诱导方法、不同诱导剂量及不同诱导时间诱导黑水虻Hermetia illucens L.幼虫产生抗菌肽，通过研磨提取法提取幼虫抗菌肽粗提物，并对所提取粗提物进行抑菌活性的比较研究，以优化黑水虻幼虫抗菌肽的诱导条件，为黑水虻抗菌肽的分离纯化提供最佳的实验方法。结果表明，不同龄期黑水虻幼虫产生抗菌肽的抑菌活性不同，最佳诱导龄期为5龄；不同诱导方法产生抗菌肽对大肠杆菌抑菌活性不同，大肠杆菌菌液针刺浸泡60 s，诱导后饲养24 h提取抗菌肽抑菌活性最好，其次为超声波100 W诱导20 min产生抗菌肽抑菌活性，但二者活性相比差异不显著；大肠杆菌菌液、金黄色葡萄球菌菌液注射诱导、金黄色葡萄球菌菌液针刺浸泡诱导及40 w超声波诱导所产生抗菌肽虽有一定的抑菌效果但与前两种方法相比差异显著。     

连翘对金黄色葡萄球菌的抑菌作用及机制的试验研究

探讨连翘对金黄色葡萄球菌的抑菌作用及机制。根据2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法测定连翘对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)。用连翘的MIC浓度的处理金黄色葡萄球菌,分别在0、4 h、8h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h取样测定光密度值(OD值),绘制其生长曲线。用MIC的连翘处理金黄色葡萄球菌24 h,检测琥珀酸脱氢酶(SDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)活性。用MIC的连翘作用于金黄色葡萄球菌,电导仪检测0、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h时上清液稀释20倍的电导率,紫外分光光度计检测DNA、RNA等大分子物质的外渗水平。连翘对金黄色葡萄球菌的MIC为0.12 mg/m L。连翘作用后的金黄色葡萄球菌生长明显受到抑制并且提前4 h进入衰亡期。连翘作用后的金黄色葡萄球菌中SDH和MDH活性显著下降,而培养基上清的电导率明显升高,DNA、RNA等大分子物质外渗水平明显增多。连翘能抑制金黄色葡萄球菌的生长,作用机制可能与细胞膜通透性及SDH和MDH代谢酶活性有关。     

解淀粉芽胞杆菌PC2产抑菌物质培养基及发酵条件优化

【目的】优化解淀粉芽胞杆菌PC2产抑菌活性物质发酵培养基及发酵条件。【方法】以马铃薯葡萄糖液体培养基为基础,依据发酵液对金黄色葡萄球菌抑菌圈的单因素试验结果,采用Box-Behnken响应面法优化发酵培养基,二次通用旋转组合设计,频率分析法优化发酵条件。【结果】影响发酵液抑菌活性的培养基主要组分为马铃薯、蔗糖和L-谷氨酸钠,最优发酵培养基配方为:马铃薯188.0 g/L,蔗糖22.0 g/L,L-谷氨酸钠1.80 g/L,培养基成本为0.81元/L;最佳发酵条件为:接种量6%、发酵温度30°C、装液量40 mL/250 mL、摇床转速185 r/min、发酵时间24 h、初始pH 7.0。优化后发酵液对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为30.82 mm,较优化前的18.22 mm增加了12.60 mm。【结论】优化后的培养基和发酵条件提高了解淀粉芽胞杆菌PC2发酵液的抑菌活性,为该菌株的工业化生产应用提供了依据。     

松材线虫拮抗细菌的杀线活性及其发酵培养特性

旨为筛选具有高效杀松材线虫活性的拮抗细菌。采用浸测法对3株芽孢杆菌进行杀线活性测定,并对高效杀线菌株发酵滤液处理线虫后的虫体进行形态观察及该菌株培养条件和杀线物质稳定性测定。结果表明3株细菌发酵滤液处理松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)48 h后,线虫校正死亡率均达100%,且松材线虫在蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)JK-XZ3发酵滤液4倍和8倍稀释液中处理48 h后,其校正死亡率分别达99.55%和88.32%,明显高于短小芽孢杆菌(B. pumilus)HR10和瓦雷兹芽孢杆菌(B. velezensis)YH-20;该JK-XZ3菌株发酵滤液处理过的线虫虫体断裂,内含物外溢,体壁消解;该菌株在30℃培养4 d的发酵滤液杀线活性最高,且松材线虫在发酵滤液4倍和8倍稀释液中处理48 h后,其校正死亡率均达100%;松材线虫在40℃、60℃、80℃和100℃处理后的发酵滤液8倍稀释液中处理48 h后,其校正死亡率均在84%以上;在pH为8-10的发酵滤液8倍稀释液处理48 h后,其校正死亡率均在88%以上;说明该菌株发酵滤液具有耐高温和耐碱特性。蜡样芽孢杆菌JK-XZ3是一株具有开发和应用潜力的高毒力杀线菌株。     

金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B的表达及活性鉴定

目的:以金黄色葡萄球菌基因组DNA为基础,在枯草芽孢杆菌中得到具有剪切功能的金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B。方法:以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到SplB基因,同源重组到表达载体pHTSHIS上,再转化枯草芽孢杆菌;优化诱导条件发酵枯草芽孢杆菌,离心后超滤浓缩上清液,再经镍柱分离纯化;利用SDS-PAGE、Lowry法对蛋白的相对分子质量、浓度等进行分析,对蛋白的酶切活性进行鉴定。结果:金黄色葡萄球菌基因组DNA经PCR扩增得到与预计大小相符的DNA片段,通过同源重组构建了表达载体pHTS-SplB-His;选取诱导前菌液D_(600nm)为2.0、IPTG浓度为0.5 mmol/L、诱导4 h的最优条件发酵枯草芽孢杆菌,表达大量金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B;蛋白浓缩后,经镍柱分离纯化得到纯度较高且具有剪切功能的金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B。结论:采用枯草芽孢杆菌进行发酵表达,可提高金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B的表达量,并且能够得到具有剪切功能的蛋白。本研究可为外源蛋白在枯草芽孢杆菌中的发酵技术提供重要参考。     

S.aureus对PMN粘弹性和细胞骨架影响的研究

利用微管吸吮技术和免疫组化染色,研究了在不同浓度金黄色葡萄球菌及其代谢液作用下多形核中性粒白细胞粘弹性的变化,以及在金黄色葡萄球菌作用下PMN细胞骨架的改变。结果发现金黄色葡萄球菌代谢液对PMN粘弹性无显著影响,而金黄色葡萄球菌悬液则对PMN的粘弹性有显著影响。各参数值随金黄色葡萄球菌浓度的增加而显著递增,至金黄色葡萄球菌浓度达10倍PMN浓度时趋于稳定;微丝和微管的免疫组化染色发现其细胞骨架形态发生改变,定量分析其光密度有显著增加。这些结果表明：PMN受金黄色葡萄球菌刺激后,细胞骨架发生了重新组装和骨架蛋白的表达,使PMN刚性和粘性均增加,促进在局部微循环中滞留粘附,发生炎性反应。     

牛奶中金黄色葡萄球菌PCR检测方法的建立与应用

目的:建立一种直接从牛奶中检测金黄色葡萄球菌的PCR快速诊断方法.方法:根据已发表的金黄色葡萄球菌16-23SrRNA特异性序列设计并合成一对引物,通过优化反应条件建立从牛奶中直接检测金黄色葡萄球菌的PCR方法.结果:与细菌的常规分离方法相比,PCR法敏感性高,与其它型葡萄球菌无交叉反应,特异性迭100%,检测细菌基因组DNA最低浓度为35ng/μL,能在5h内对送检的牛奶样品直接进行金黄色葡萄球菌的测定,可用于乳制品中金黄色葡萄球菌的检测.结论:成功建立了快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌PCR方法.     

海洋放线菌HSL-6抗菌物质的发酵优化与性质研究

海洋放线菌HSL-6能产生对金黄色葡萄球菌有强烈抑制作用的活性物质。对其发酵条件和理化性质进行了研究,正交实验证明,其产生抗菌活性物质的最佳条件:发酵培养基pH6.5、培养温度为28℃、振荡频率300r/min、发酵培养基配方为蔗糖2%、黄豆粉1.5%、酵母浸粉0.15%、CaCO30.05%、甘油0.20%;菌龄为36h,接种量为10%,发酵时间为96h;该抗菌活性物质具有较好的热稳定性、pH稳定性,易溶于氯仿,经薄层层析展开后在紫外光下具有发荧光的特点,纸电泳实验证实该物质是一种弱酸性物质。     

冬凌草提取物对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用

研究了冬凌草提取物对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的影响。采用结晶紫染色法评价了冬凌草提取物在不同质量浓度和不同添加时间下干预金黄色葡萄球菌生物被膜的作用。实验结果表明,冬凌草提取物对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC分别为125μg/mL和250μg/mL,在亚抑菌浓度,冬凌草提取物对金黄色葡萄球菌生物膜形成的干预作用不明显;当冬凌草提取物质量浓度大于1倍MIC时,其对金黄色葡萄球菌生物膜形成的有明显的抑制作用,在生物膜形成的初始时间(0 h)添加药物抑制效果最佳,2MIC冬凌草提取物对金黄色葡萄球菌成膜的抑制率达到79%以上;24 h后添加抑制作用较弱,抑制率仅有60%左右。采用银染法和荧光染色法研究了冬凌草提取物对金黄色葡萄球菌生物膜的清除效果和抑制胞外多糖的合成,实验结果也表明,在亚抑菌浓度,冬凌草提取物对金黄色葡萄球菌生物膜的清除和胞外多糖合成的抑制作用很弱,当冬凌草提取物质量浓度大于1 MIC时,在生物膜形成的初始时间(0 h)添加药物,对金黄色葡萄球菌生物膜清除效果明显,胞外多糖的合成也受到显著的抑制。本研究为冬凌草提取物在食品防腐和保鲜,以及无抗饲料的广泛应用提供理论基础。     

六种微藻的抗MRSA活性筛选

本文以琼脂扩散法为体外抗菌活性测定方法,研究了六种微藻(两种绿藻,三种硅藻和一种蓝藻)的不同溶剂提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑制活性.结果表明,每种微藻的提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有不同程度的抑制活性.其中,蓝隐藻、牟氏角毛藻和青岛大扁藻的提取物具有良好的抗菌活性.结论:微藻是一种新的开发抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌物质的潜在资源.     

产毒金黄色葡萄球菌鉴定及在百叶中生长与产毒特性分析

从生鲜食品中分离鉴定得到产肠毒素SEA的金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）菌株,研究金黄色葡萄球菌在百叶中的生长变化及产肠毒素特性。将不同浓度的金黄色葡萄球菌同时接种到减菌（样品组）和未减菌（对照组）百叶中,高、低初始接种量分别控制在4.0 lg(cfu/g)和2.0 lg(cfu/g)左右,并定时追踪不同储存温度条件下百叶中金黄色葡萄球菌的活菌数及产毒情况。金黄色葡萄球菌肠毒素的检测采用商业化的ELISA试剂盒。在37 ℃储存过程中,金黄色葡萄球菌在样品组中不但能生长良好并在18 h后菌落数可达到7.0 lg(cfu/g)并被检测出肠毒素,对照组中金黄色葡萄球菌生长良好菌落数可达到7.0 lg(cfu/g)却未检测出产肠毒素。在25、15和5 ℃储存过程中,样品组和对照组百叶都未检测出肠毒素。温度对金黄色葡萄球菌在百叶中是否产肠毒素具有决定性的作用,且百叶中本身存在的杂菌可能可以抑制金黄色葡萄球菌产肠毒素。     

海洋链霉菌GB-2发酵产物的抗细菌活性及性质研究

从连云港海域潮间带采集的样品中筛选得到一株产高活性抗细菌物质的链霉菌GB-2。该菌的发酵产物对蜡样芽孢杆菌AS1.1846、金黄色葡萄球菌ATCC25923及6株耐药性金黄色葡萄球菌等11株革兰氏阳性菌,大肠杆菌AS1.487、荧光假单胞菌AS1.1802等4株革兰氏阴性菌有显著拮抗作用。纸层析对抗细菌物质分析结果表明,菌株GB-2所产抗细菌物质是中性的水溶性物质,其产生与海水的存在有显著相关性。发酵液稳定性研究表明,该物质在121℃,pH1和pH12条件下抑菌活性均不变;紫外线照射也不影响其抑细菌活性。显示菌株GB-2产物在生防、食品及医药方面潜在的应用价值。     

海洋链霉菌GB-2发酵产物的抗细菌活性及性质研究

从连云港海域潮间带采集的样品中筛选得到一株产高活性抗细菌物质的链霉菌GB-2。该菌的发酵产物对蜡样芽孢杆菌AS1.1846、金黄色葡萄球菌ATCC25923及6株耐药性金黄色葡萄球菌等11 株革兰氏阳性菌,大肠杆菌AS1.487、荧光假单胞菌AS1.1802等4 株革兰氏阴性菌有显著拮抗作用。纸层析对抗细菌物质分析结果表明,菌株GB-2所产抗细菌物质是中性的水溶性物质,其产生与海水的存在有显著相关性。发酵液稳定性研究表明,该物质在121℃,pH1 和pH12条件下抑菌活性均不变;紫外线照射也不影响其抑细菌活性。显示菌株GB-2产物在生防、食品及医药方面潜在的应用价值。