ESAT6-CFP10融合蛋白基因的克隆及其在耻垢分枝杆菌中的表达

目的:构建能表达ESAT6-CFP10融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗。方法:以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,克隆cfp10基因,将其插入到pGEM-T-easy载体后与esat6基因连接,构建含有esat6和cfp10融合基因的重组载体pGEM-e6c10。酶切消化pGEM-e6c10重组质粒,将esat6-cfp10基因亚克隆到pDE22分泌表达穿梭载体,以电穿孔方法将重组质粒转化至耻垢分枝杆菌。PCR筛选到的阳性克隆经温度诱导后,SDS-PAGE和Western印迹检测表达蛋白的正确性。结果:可表达出相对分子质量约23000的ESAT6-CFP10融合蛋白。Western印迹证明重组蛋白有较好的免疫原性。结论:获得能表达ESAT6-CFP10融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌,为结核病的预防奠定了一定的基础。     

结核分枝杆菌esat6-rpfD融合基因的原核表达及产物纯化

目的：构建结核分枝杆菌融合基因esat6-rpfD的原核表达载体,表达和纯化ESAT6-RpfD融合蛋白。方法：从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中经PCR分别扩增esat6和慢周基因,克隆入pMD19-T载体,测序后克隆入原核表达载体pProExHTB,酶切重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达融合蛋白,亲和层析纯化融合蛋白。结果：PCR扩增的esat6、rpfD基因序列与GenBank报道一致;诱导表达后,经SDS-PAGE和Western blot分析,在相对分子质量约30000处有目的条带,融合蛋白以包涵体形式表达。结论：构建了esat6-rpfD融合基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达并纯化得到ESAT6-RpfD融合蛋白。     

结核分枝杆菌esat6-mpt64融合基因真核表达载体的构建

目的:构建结核分枝杆菌分泌蛋白基因esat6-mpt64的真核表达载体。方法:用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中分别扩增esat6、mpt64基因,插入pGEM-T-easy载体,序列测定正确后,将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1( );重组质粒经酶切鉴定正确后,用LipofectAMINE2000转染COS-7细胞;用RT-PCR检测mRNA的表达,用间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。结果:RT-PCR表明esat6-mpt64融合基因可在COS-7细胞中转录;用间接免疫荧光检测,有表达蛋白的细胞着染。结论:构建了真核表达载体pcDNA-esat6-mpt64,并在真核COS-7细胞中表达。     

人BMP4基因的克隆及其原核表达载体的构建

以成熟人胎盘组织为材料来源,克隆人BMP-4基因的全长cDNA,经过PCR扩增后与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-BMP4克隆质粒.酶切后回收小片段与表达载体pET-22b的多克隆酶切位点连接,构建原核表达载体pET22b-BMP4,酶切及测序鉴定重组子.重组质粒转化至感受态的Rosseta宿主菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况.结果显示,从胎盘组织中成功地克隆到人BMP4基因,与NCBI中公布的序列100％相符合,原核表达载体pET22b-BMP4转化至Rosseta构建表达菌体,经IPTG诱导后电泳分析可见重组蛋白表达的条带.     

猪白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆与表达

目的克隆猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因,并在植物乳杆菌(Lb.plantarum)NC8中进行表达。方法通过RT-PCR方法从猪脾脏细胞中扩增出pIL-18成熟蛋白基因,克隆到T载体pMD18-T后测序;将阳性基因片段克隆至大肠埃希菌-乳酸菌穿梭表达载体pSIP-409构建重组表达载体pSIP-409-IL-18,进行酶切和PCR鉴定;应用电穿孔技术将其转化至Lb.plantarum NC8中,经SppIP诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western-blot分析。结果经测序,pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为579 bp,编码193个核苷酸;酶切和PCR鉴定证明成功构建了重组表达载体pSIP-409-IL-18;SDS-PAGE及Western-blot分析表明重组菌表达了18 kD的融合蛋白,该重组蛋白可以与鼠抗猪IL-18多克隆抗体反应。结论成功克隆了pIL-18成熟蛋白基因,并获得有生物活性的pIL-18重组乳酸菌,为研制开发IL-18重组乳酸菌制剂奠定基础。     

轮状病毒VP7基因的克隆与表达

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增轮状病毒VP7基因,并将其克隆到pMD18-T simple载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定DNA全序列。结果显示,克隆片段全长为981 bp。将轮状病毒VP7基因定向的克隆到原核表达载体pET-32a启动子下游,构建原核表达载体pET-32aVP7。将质粒pET-32aVP7转化Transetta表达菌株进行诱导表达,裂解菌体细胞抽提蛋白质进行SDS-PAGE。结果表明,轮状病毒壳蛋白VP7基因在Transetta表达菌株内得到成功表达。     

轮状病毒VP7基因的克隆及其植物表达载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了轮状病毒VP7基因,并将其克隆到pMD18-Tvectr载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了DNA全序列.结果表明,克隆片段全长为981 bp.将轮状病毒VP7基因定向的克隆到植物表达载体pBI121启动子下游,构建了植物表达载体.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达研究

采用RT-PCR方法自猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组分离出核衣壳蛋白基因(orf 7),克隆到pMD18-T载体构建成重组质粒pMD18N并进行测序比较,结果表明,所克隆的核衣壳蛋白基因序列与PRRSV美洲型ATCC VR-2332株的同源性为100%,表明orf 7 是PRRSV基因组内很保守的序列;将orf 7亚克隆到原核表达载体pGEX-KG,构建成重组质粒pGEX-KGN,用pGEX-KGN转化表达菌株BL21,经SDS-PAGE和 Western-blot分析表明克隆在谷胱苷肽转移酶(Glutathione S-transferase(GST)下游的核衣壳蛋白基因与GST获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-N分子量约为41kDa,并且有免疫学反应活性;这为猪繁殖与呼吸综合征的血清学诊断方法的建立打下了基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5a多克隆抗血清的制备

构建XX2012株猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5a蛋白基因的真核表达载体,并制备出GP5a蛋白的多克隆抗血清。以XX2012株PRRSV GP5a蛋白的基因序列为扩增模板,设计并合成一对特异性扩增引物,通过RTPCR扩增得到该病毒株的GP5a蛋白全长基因片段,将其定向克隆到真核表达载体p CAGG中,构建含有GP5a蛋白基因的重组表达载体p CAGGS-GP5a,并将获得的p CAGGS-GP5a载体采用基因免疫的方式免疫BALB/c小鼠制备GP5a蛋白的多克隆抗体。结果显示,成功克隆出了XX2012株PRRSV GP5a蛋白全长基因,片段大小为156 bp;构建的p CAGGS-GP5a载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误;通过三次基因免疫小鼠成功制备出了GP5a蛋白的多克隆抗体,间接免疫荧光试验证实制备出的多克隆抗体能特异性识别病毒感染后的细胞。由此获得了PRRSV GP5a蛋白基因的真核表达载体,制备出了GP5a蛋白的特异性多克隆抗血清,为今后开展GP5a蛋白的亚细胞定位及相关功能的研究奠定了基础。     

猪丹毒丝菌C43311株spaA基因N端免疫保护区的克隆和表达

采用PCR从猪丹毒丝菌C43311株基因组中扩增出编码表面保护性抗原A的spaA基因片段,将其克隆到pMD18-T载体并对插入片段进行测序.用spaA基因N端免疫保护区(spaA-N)的特异引物从重组质粒pMD18-spaA中扩增得到spaA-N片段,将其定向插入原核表达载体pGEX-6p-2中,构建重组表达质粒pGEX-spaA-N,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达融合蛋白GST-SpaA-N,用SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物.测序结果表明spaA基因片段大小为1881bp,与已报道的不同血清型菌株spaA基因的核苷酸序列比较,核苷酸序列同源性在93%～99%之间.SDS-PAGE结果显示表达蛋白约为64kDa,与预期的大小相近.Western印迹检测结果表明,表达的融合蛋白GST-SpaA-N能与C43311株SpaA蛋白的抗血清发生特异性反应,证明原核融合表达蛋白具有免疫反应性.     

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6的表达、纯化和鉴定

目的：克隆结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法：用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出ESAT-6基因片段,克隆至pMD18一T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T－1并在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白经SDS—PAGE及Westem—blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。结果：成功克隆了ESAT-6基因,并对其在E．coli中进行了表达,SDS—PAGE及Western—blot分析表明表达产物正确。通过GST纯化系统获得34kD纯化蛋白,与文献报道相符。结论：成功获得了纯化的ESAT-6蛋白,为进一步研究ESAT－6蛋白的致病机理提供了实验依据。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因在毕赤酵母中克隆与分析

目的:克隆丙型肝炎病毒核心蛋白基因及其上游DNA序列,为此基因的表达研究作准备。方法:用反转录和PCR方法从HCV的总RNA中扩增得到核心蛋白基因及其上游DNA序列,连接到pMD18-T载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成重组质粒,测序证明正确后,再将目的基因在毕赤酵母中进行克隆,鉴定。结果:重组质粒转化毕赤酵母后,经PCR鉴定,证明形成了目的基因的克隆。结论:应用毕赤酵母作为受体菌,pPIC9K为载体,成功克隆了HCV核心蛋白基因。     

结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c 的表达、纯化和鉴定

目的:克隆结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c基因,构建其原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1733c基因片段,克隆入pMD18-T载体,序列测定正确后将其亚克隆入原核表达载体pPro-EXHTb,并在大肠杆菌DH5α中进行表达,表达蛋白经SDS-PAGE及Western-blot分析后,以Ni-NTA亲和层析纯化蛋白。结果:成功克隆了Rv1733c基因片段并构建了其原核表达载体pPro-EXHTb-1733c,转化E.ColiDH5α后能表达大小约30 KD的蛋白,Western-blot分析表明表达产物正确。通过亲和层析获得纯化蛋白。结论:成功构建结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c原核表达载体pPro-EXHTb-1733c,并获得纯化蛋白,为研究新型结核疫苗的靶抗原奠定了基础。     

斜纹夜蛾核多角体病毒VP39-GST融合蛋白的原核表达

用PCR的方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒（Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV）vp39全长基因。将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上,构建重组表达质粒pGEX-4T-vp39,转化大肠杆菌BL21（DE3）,在1 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下超量表达了与理论预测值相符的一个约60 kD的VP39-GST融合蛋白。VP39-GST融合蛋白的成功表达为进一步研究VP39在病毒侵染过程中与宿主细胞成分或病毒粒子蛋白间的相互作用奠定了基础。     

牛凝乳酶基因在毕赤酵母中的重组表达

通过PCR技术从克隆载体pMD18T-Prochy上扩增牛凝乳酶原基因,双酶切后定向插入到酵母表达载体pPICZaA中,构建表达质粒pPICZaA-Prochy,线性化后电转化毕赤酵母GS115,经PCR和测序鉴定凝乳酶原基因成功插入到毕赤酵母的基因组中。在甲醇诱导下进行凝乳酶的表达,SDS-PAGE分析证明重组凝乳酶的分子量约为37 kD,培养基上清液中凝乳酶的活性为12.2 SU/mL。本研究首次应用毕赤酵母表达牛凝乳酶,在培养基中获得分泌表达的重组凝乳酶,为干酪工业提供了新型及优良的凝乳酶来源。     

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅢA基因的克隆、序列分析及原核表达

因胸膜肺炎放线杆菌的致病性主要是由毒素决定的,故参照猪胸膜肺炎放线杆血清2型菌株的序列（GenBank L12145）设计了一对特异性引物,用PCR的方法扩增apxⅢA基因并得到了长3 466bp的片段,然后将其克隆到pMD18T中,经酶切鉴定和序列分析表明克隆是成功的;再将apxⅢA插入到原核表达载体pET28b后,转化BL21(DE3),在IPTG诱导下获得高效表达,经Western blotting检测证实表达产物有活性。以表达产物包被ELISA板,建立了特异、敏感的ELISA诊断方法。     

含CSFV E2基因A/D区原核表达载体的构建、表达及其抗原性研究

应用RT PCR方法扩增了编码猪瘟病毒石门株 (CSFVshimenstrain)囊膜糖蛋白E2全基因 ,然后将其克隆到pMD 1 8T质粒中 ,获得重组质粒pMD E2。再以pMD E2为模板 ,另行设计两对引物 ,同时扩增其中一段适于在E .coli中表达且抗原反应性较好的基因片段 (E2蛋白A D抗原区基因序列 ) ,将扩增的两片段串联插入原核表达载体pET 32a中构建成重组质粒pET 2e。用酶切和序列分析鉴定插入目的基因的正确性。SDS PAGE和Western blot分析表明 ,经pET 2e转化、IPTG诱导的受体菌可表达目的蛋白 ,克隆在硫氧还蛋白 (thioredoxinprotein ,TrxA)基因下游的E2蛋白基因与TrxA基因获得了高效融合表达 ,并且具有免疫学反应活性 ,这为猪瘟的血清学诊断方法的建立打下了基础 。     

猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原AN端保护区在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原A（SpaA）N端保护区（SpaA-N）,并检测其抗原性。方法：利用PCR方法从猪丹毒丝菌C43065株基因组中扩增出spaA基因片段,构建pMD18-spaA重组质粒并对插入片段进行测序;以pMD18-spaA重组质粒为模板,PCR扩增得到spaA-N基因片段,构建重组表达质粒pGEX-spaA-N,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌BL21（DE3）,再经IPTG诱导表达GST-SpaA-N融合蛋白并纯化。结果：扩增得到的spaA基因长1881bp,编码由626个氨基酸残基构成的多肽;SDS-PAGE和Western印迹检测结果表明,诱导表达获得相对分子质量约64000的GST-SpaA-N融合蛋白,该融合蛋白能与相应抗体发生特异性反应。结论：获得了在大肠杆菌中可溶性表达的GST-SpaA-N融合蛋白,为进一步研究猪丹毒丝菌免疫保护性抗原奠定了基础。