结核分枝杆菌H37有毒株与无毒株的代谢相关基因pabB和lpdA启动子活性分析

【目的】通过分析结核分枝杆菌无毒株H37Ra的全基因组序列,并与H37Rv基因组序列比较,发现pabB和lpdA预测的启动子区发生了突变。我们利用报告基因,确认启动子突变与其基因转录水平的关系,探索结核分枝杆菌H37Ra毒力丧失的内在原因。【方法】利用生物信息学方法预测这两对基因的启动子区,采用PCR技术克隆这两对基因的启动子,与分枝杆菌启动子探针载体pMC210相连,DNA测序证实连接片段正确后,用电穿孔法将重组质粒转化至耻垢分枝杆菌mc2155。利用Quantitative Real-Time RT-PCR检测报告基因lacZ转录水平的差异,进一步验证这两对基因启动子的突变对相应基因转录水平的影响。【结果】Quantitative Real Time PCR检测结果显示H37RapabB启动子活性是H37Rv pabB启动子活性的6倍(p0.05),而H37Rv lpdA启动子的活性是H37RalpdA启动子的2倍(p0.05)。【结论】pabB,lpdA的启动子在H37Ra中的突变对其启动子的活性产生了影响,其中lpdA启动子的突变可能与结核分枝杆菌H37Ra的毒力丧失有关。     

AphA蛋白对副溶血弧菌vopT的转录调控研究

【目的】研究副溶血弧菌AphA对vopT的转录调控机制。【方法】提取野生株(WT)和aphA突变株(ΔaphA)的总RNA,采用引物延伸实验研究vopT的转录起始位点,并根据产物的丰度差异判断AphA对其调控关系。分别将WT和ΔaphA的总RNA逆转录成cDNA,利用实时定量RT-PCR进一步研究AphA对靶基因的调控关系。将vopT的启动子区克隆入pHRP309质粒的β-半乳糖苷酶基因上游,构建LacZ重组质粒,并将该重组质粒转入WT和ΔaphA中,通过测定并比较两株菌中β-半乳糖苷酶活性的差异来判定AphA对vopT的调控关系。PCR扩增靶基因整个启动子区DNA序列,并纯化His-AphA蛋白,利用凝胶阻滞实验(EMSA)验证His-AphA对靶基因启动子区是否具有直接的结合作用。【结果】vopT只有一个转录起始位点A (?86),且其转录活性受AphA的间接抑制。RT-PCR和EMSA结果显示AphA对vtrA的转录也具有间接的抑制作用。【结论】AphA间接抑制vopT转录,且该间接抑制作用与VtrA无关。     

苏云金芽胞杆菌aiiA的5'端侧翼序列的克隆与功能鉴定

为了研究苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)N-酰基高丝氨酸内酯酶(N-acylhomoserine Lactonase,AiiA蛋白)表达调控机制,确定aiiA的启动子区域。本研究克隆了aiiA的5'端侧翼区(aP-1930--1),以gfp作为报告基因,分段克隆aiiA的5'侧翼区,鉴定启动子活性,并对aiiA启动子序列中的碱基对-150和-142之间的2个连续的TATA盒进行定点突变。结果显示,侧翼序列aP-295--101和aP-295--1可作为启动子,实现GFP在大肠杆菌中的异源表达,启动子序列aP-295--101比aP-295--1活性更强,aP-101--1序列不能启动GFP表达。定点突变pET28a-aP-295--101-gfp载体2个TATA盒显著降低GFP表达。表明-295--1bp为aiiA的启动子区,-429--296与-100--1序列是aiiA的负调控序列。-150--142 bp区域的2个TATA盒对aiiA的5'侧翼区域的启动子活性起关键的作用。     

北极狐β-防御素103基因 (CBD103) 启动子活性及转录调控元件分析

本研究旨在筛选调控北极狐毛色基因CBD103的启动子活性区域及转录因子结合位点,为揭示CBD103基因调控北极狐毛色形成的分子遗传机制提供依据。克隆获得了北极狐CBD103基因5′侧翼区2 123 bp的片段,并构建了4个不同长度的启动子缺失片段表达载体,通过双荧光素酶检测系统对启动子活性进行检测。对启动子活性最高区域预测出的3个特异性蛋白1 (Sp1)转录因子结合位点分别进行点突变并构建3个突变载体,利用双荧光素酶检测系统测定其活性。结果显示,在构建的4个不同长度启动子缺失片段中1 656 (-1 604/+51)区域活性最高,在此区域构建的3个突变载体的启动子活性较野生型(片段1 656)均显著降低,说明-1 604/+51区域为北极狐CBD103基因的核心启动子区,-1 552/-1 564、-1 439/-1 454和-329/-339区域为正调控区域。文中成功获得了北极狐CBD103基因的核心启动子区域和正调控区域,这为进一步研究该基因调控北极狐被毛颜色分子遗传机制奠定了基础。     

端粒、端粒酶结合因子hPinx1基因启动子的克隆及活性分析

目的：克隆端粒、端粒酶结合因子hPinx1基因的启动子,分析并鉴定其活性调控元件。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增出hPinx1启动子,构建到萤光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在HepG2细胞中检测其活性。结果：克隆了hPinx1基因转录起始位点上游4661bp且序列正确;活性分析表明hPinx1启动子含有多个调控元件,其中核心序列位于530bp内,在1329-2174bp间存在正调控序列,在2174-4661 bp间存在负调控序列。结论：构建的hPinx1启动子具有活性,为hPinx1的功能研究提供了重要基础。     

端粒、端粒酶结合因子hPinxl基因启动子的克隆及活性分析

目的：克隆端粒、端粒酶结合因子hPinx1基因的启动子,分析并鉴定其活性调控元件。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增出hPinx1启动子,构建到萤光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在HepG2细胞中检测其活性。结果：克隆了hPinx1基因转录起始位点上游4661bp且序列正确;活性分析表明hPinx1启动子含有多个调控元件,其中核心序列位于530bp内,在1329-2174bp间存在正调控序列,在2174-4661 bp间存在负调控序列。结论：构建的hPinx1启动子具有活性,为hPinx1的功能研究提供了重要基础。     

坝上长尾鸡pmel基因核心启动子的鉴定

为探明坝上长尾鸡的前黑素小体蛋白(Pre-melanosomal protein,Pmel)基因核心启动子区,首先构建了双荧光素酶表达载体,通过脂质体瞬时转染鸡胚成纤维细胞DF1,并利用双荧光素酶检测试剂盒进行启动活性检测。成功克隆了坝上长尾鸡pmel基因5?侧翼区片段1268bp,预测启动子区(-1200–+68)含有2个CpG岛和多种转录因子结合位点,构建了9个含有不同长度pmel基因启动子片段的表达载体及1个核心启动子区突变载体,说明鸡pmel基因启动子的核心区域为-840–+68bp,其中-840–-590bp和-525–-266bp区域为正调控区,-590–-525bp区域为负调控区,多态位点(-456、-435、-410、-374和-341)对pmel基因启动子活性有较大影响。     

副溶血弧菌ToxR截短体蛋白的表达纯化及其DNA结合活性

【目的】利用大肠杆菌BL21λDE3表达系统,表达出有活性的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)ToxR截短体蛋白,为进一步研究ToxR的转录调控机制奠定基础。【方法】以VP基因组DNA为模板,PCR扩增ToxR蛋白DNA结合结构域(ToxR-N)的DNA片段,并将其直接克隆入pET28a中,获得重组质粒;将重组质粒导入大肠杆菌BL21λDE3中,所得菌株经IPTG诱导后能表达出His-ToxR-N蛋白。利用限制级凝血酶切除His-ToxR-N中的His-标签,进而以VP的calR和VP1687为靶基因,通过体外的凝胶阻滞实验(EMSA)验证ToxR-N蛋白的DNA结合活性。分别构建克隆有calR和VP1687上游启动子区的LacZ重组质粒,并将重组质粒转入野生株(WT)和toxR突变株(ΔtoxR)中,通过测定β-半乳糖苷酶活性来比较两株重组菌中靶基因启动子活性,以验证ToxR对calR和VP1687的调控关系。【结果】成功表达出有活性的ToxR-N蛋白,该蛋白对calR启动子区具有结合活性。LacZ结果显示ToxR对calR的转录具有激活作用,而对VP1687的转录具有抑制作用。【结论】所表达的ToxR-N可用于后续的转录调控机制研究;ToxR通过直接激活calR的转录表达,而间接抑制T3SS1相关基因的表达。     

小鼠精胺氧化酶基因启动子结构和功能研究

目的:克隆和鉴定小鼠精胺氧化酶(mSMO)启动子DNA序列.方法:用Trizol试剂法从小鼠成纤维细胞中提取总RNA,应用5'-RACE法获得mSMO的转录起始位点;巢式PCR方法克隆含有mSMO启动子的DNA序列,并由此构建5'端系列截短的mSMO启动子荧光素酶报告质粒;将报告质粒瞬时转染Cos7细胞后,用荧光素酶分析法测定启动子活性.结果:确定mSMO基因至少有6个转录起始位点(+1,+4,+27,+31,+51,和+63),且均定位于外显子1中.克隆获得mSMO基因转录起始位点上游大约2.1kb的DNA片断,以此片段为基础构建了11个5'端系列截短的启动子报告质粒.报告基因分析证实,该上游DNA片段具有启动子活性,截短至-615和-176bp时,获得2个启动子活性峰值,截短至-373bp时启动子活性最低.结论:mSMO基因含有多个转录起始位点,其上游-176～+124bp为mSMO核心启动子区,-615～-176bp区为重要的转录调控区.     

猪CuZnSOD基因启动子的克隆鉴定及分析

猪铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)是一种重要的抗氧化酶,其功能已被广泛研究,但CuZnSOD基因的转录调控尚不明确。为了研究猪CuZnSOD基因的核心启动子区域,并对其转录调控机制进行探讨,运用PCR方法从猪基因组克隆CuZnSOD基因5′上游调控区853 bp的片段,然后通过巢式PCR方法获得5′末端逐渐缺失的启动子系列片段,并将这些片段定向插入到荧光素酶报告基因表达载体(pGL3-Basic)中。瞬时转染小鼠胚胎细胞(NIH/3T3),利用双荧光素酶报告基因检测不同长度启动子活性。检测结果显示,在CuZnSOD基因5′上游调控区-87 bp和-266 bp处分别存在2个潜在转录起始位点,-383 bp~+67 bp启动区活性最强,进一步缺失分析发现-75 bp~-32 bp区域内含有猪CuZnSOD基因转录所必需的基础启动子序列,其中存在多个潜在的转录因子结合位点,研究结果提示这些转录因子结合位点可能是参与CuZnSOD基因转录的重要调控序列。     

嗜热脂肪芽孢杆菌pgiB基因上游452bp序列的功能分析

用化学诱变剂N甲基N′硝基N亚硝基胍进行随机诱变,获得了穿梭启动子探测质粒pPGV5的温度抗性突变型pPGV5(tr65),序列分析发现质粒上卡那霉素核苷转移酶基因kan的+238位碱基发生了G→T的单点突变。以来自嗜热脂肪芽孢杆菌FDTP3菌株的耐热邻苯二酚2,3双加氧酶基因pheB作为报道基因,构建了转录融合质粒pPGVPB452,用高压电穿孔法将其转化嗜热脂肪芽孢杆菌,通过报道蛋白活性的分析,证明了嗜热脂肪芽孢杆菌T521菌株的6磷酸葡萄糖异构酶同工酶基因pgiB上游含启动子样序列的425bp片段在嗜热脂肪芽孢杆菌中不具有启动子功能。