严重急性呼吸综合征患者血清特异性抗体消涨规律的长期追踪研究

目的:追踪检测SARS冠状病毒(SARS-CoV)抗体在严重急性呼吸综合征(SARS)患者血清中的产生及其转归规律,为SARS诊断及防治提供依据。方法:对41例临床诊断SARS患者的血清进行了连续3年的检测,分别应用间接免疫荧光(IFA)检测患者血清特异性IgG抗体平均滴度,应用双抗原夹心ELISA法检测患者血清核衣壳蛋白(N蛋白)抗体的平均滴度,绘制消涨曲线,得出消涨规律。结果:应用IFA检测患者血清特异性IgG抗体与应用双抗原夹心ELISA法检测N蛋白抗体所得到的消涨规律不同,前者测得康复者血清IgG抗体滴度维持在较低水平,但后者检测35例康复者血清N蛋白抗体仍维持在较高水平。结论:SARS-CoV的N蛋白是免疫原性较强的抗原,感染3年后仍存在高滴度抗体;抗原夹心ELISA检测SARS-CoV N蛋白抗体的灵敏度较IFA方法高。     

啮齿类动物中汉坦病毒感染血清学和病原学检测方法比较研究

致病性汉坦病毒的宿主主要为啮齿类动物,其病毒感染状况是人间疫情发生的关键影响因素,可通过检测宿主动物标本中病毒基因组RNA、蛋白抗原及特异性抗体而进行监测。本研究利用367份鼠肺及鼠血标本,对双抗原夹心ELISA(ELISA)、实时荧光RT-PCR(RT-PCR)和免疫荧光(IFA)等三种分别检测抗体、核酸和抗原的方法进行比较评估。ELISA法检出抗体阳性鼠血标本46份,阳性率为12.53%;RT-PCR法检出病毒RNA阳性鼠肺标本28份,阳性率为7.63%;IFA检出抗原阳性鼠肺标本24份,阳性率为6.54%。宿主动物组织标本中检出汉坦病毒RNA和(或)结构蛋白抗原的标本,对应的血液标本中可检出病毒特异性抗体,100%(24/24)IFA检测阳性标本和89.3%(25/28)RT-PCR检测阳性标本对应血标本ELISA抗体检测阳性,反之亦然,检出抗体的标本基本包含了可检出抗原和RNA的标本。RT-PCR与IFA检测结果差异无显著性(χa2=0.64,P0.05),一致性检验Kappa系数为0.71,一致性高(Z=13.66,P0.05),首先对血标本开展基于ELISA的特异性抗体检测,可显著缩小RT-PCR或IFA法检测病毒RNA或抗原的范围(χb2=12.04,χc2=20.05,P0.05)。本研究为宿主动物汉坦病毒感染实验室监测方案优化提供了有益的依据。     

寨卡病毒IgG抗体间接ELISA检测方法的初步建立

初步建立了寨卡病毒(Zika virus)IgG抗体的间接ELISA检测方法,为开发相应的血清学诊断试剂提供理论依据。选取寨卡病毒四种抗原,即E蛋白胞外区(Ectodomain)、NS1蛋白、C蛋白和rEⅢ蛋白进行重组表达和纯化,分别包被ELISA板并用间接法检测寨卡病人临床血清和正常人血清,确定每种检测抗原的检测敏感度和特异度。重组表达并纯化的四种寨卡病毒抗原浓度和纯度均达到检测要求。间接ELISA检测结果显示E蛋白胞外区和NS1蛋白的检测敏感度和特异度均达到较高水平,但C蛋白和rEⅢ蛋白的检测敏感度很低,不适合作为寨卡病毒的检测抗原。本研究初步评价了寨卡病毒四种抗原检测相应IgG抗体的敏感度和特异度,为研制血清学诊断试剂奠定了基础。     

TT病毒ORF1基因在大肠杆菌中的表达及TTV酶免疫诊断方法的初步建立

为建立免疫学检测TT病毒抗体的方法,我们表达了硫氧还蛋白与TTV ORF1 497aa～770aa段融合蛋白,采用免疫印迹分析表达产物的抗原性,并以表达产物为抗原检测TTV抗体,结合TTV DNA检测结果分析其抗原特异性。     

ANKRD17蛋白抗体的制备、纯化及检测

目的：制备ANKRD17（P260）蛋白的兔多克隆抗体,以与抗原相结合的方法进行抗体的纯化,并利用纯化的抗体对该蛋白进行细胞内免疫荧光检测。方法：构建表达GST—ANKRD17C端融合蛋白的质粒,在大肠杆菌中诱导表达;制备GST—ANKRD17C端抗原融合蛋白后免疫家兔,对获得的兔多克隆抗血清进行亲和纯化;纯化后的抗体经过Western blot鉴定,用于细胞免疫荧光染色检测。结果：获得较高效价的血清抗体,并对血清抗体进行了纯化;利用纯化的抗体对ANKRD17蛋白进行了细胞内免疫荧光检测,发现改蛋白定位于细胞质中。结论：制备得到的纯化抗体为研究ANKRD17蛋白的功能打下了必要的基础。     

SIV抗体简便快速免疫测定法

SIV(simian immunodeficiency virus)抗体测定法已在很多研究课题中被证明是有用的。但是在野外条件或设备条件差的实验室里很难开展常规免疫测定法。现已发展了一种价廉、简便、快速的免疫测定法,即用灭活SIV抗原和F-C试剂盒(美国加州E.Y药厂出品)检测SIV抗体。F-C试剂盒是一种薄膜滤纸装置,利用金标记A-蛋白测定抗体或抗原。这种低费用     

重组SCIRR39多克隆抗体的制备及检测

目的：在大肠杆菌中表达大鼠脊髓损伤与修复蛋白39（SCIRR39）的C端抗原表位,并制备其多克隆抗体。方法：从大鼠脊髓全横断损伤脊髓cDNA中扩增1386bp的Scirr39基因编码框,亚克隆该基因编码蛋白C端359～461位氨基酸残基的DNA片段,插入表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况,切胶纯化目的蛋白;利用多克隆抗体制备技术,制备重组SCIRR39蛋白的多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体效价,Western印迹检测抗体的特异性。结果：SCIRR39蛋白C端抗原表位与GST的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式高表达,相对分子质量为37．9×103;获得抗SCIRR39蛋白C端抗原表位的兔抗血清,其效价达到1：104;Western印迹显示多克隆抗体能特异识别重组SCIRR39蛋白的C端抗原表位。结论：在原核系统中表达纯化了重组SCIRR39抗原表位蛋白,制备的重组蛋白多克隆抗体将用于检测SCIRR39在脊髓损伤过程中的表达变化。     

猴结核病血清抗体检测方法的建立

目的目前活检猴感染结核病的检疫方法只有结核菌素试验。由于检测方法的单一性,结核菌素试验敏感性和特异性低,给灵长类结核病的管理带来困难。为此,开展了猴结核病血清抗体的检测方法。方法利用胞浆蛋白、结核菌素、Trehalose 6,6-’dimycolate(TDM)分别作为抗原建立猴结核病血清抗体ELISA检测方法,检测了28份自然感染血清和121份阴性血清,评价其应用价值。结果根据三种抗原对标本检测结果的敏感度和特异度,用受试者工作特性曲线(ROC)进行分析比较。胞浆蛋白、结核菌素、TDM三种抗原检测的敏感度分别为89.3%、75%与64.3%;特异度分别为93.4%、95.9%与88.4%。ROC曲线下面积都大于0.5(P<0.01)。结论表明三种抗原能用于抗猴结核病的ELISA检测,具有较好的准确性。其中,胞浆蛋白抗原的敏感性和特异性最高,是猴结核病血清抗体检测较好的一种抗原。     

HIV-1辅助蛋白Vpr多肽抗体的制备与鉴定

预测Vpr蛋白的B细胞抗原表位,并利用合成的B细胞表位肽制备Vpr特异性抗体。应用生物信息学技术获得Vpr蛋白共享氨基酸序列并预测其潜在B细胞抗原表位,与载体蛋白血蓝蛋白(KLH)偶联合成多肽并免疫家兔,鉴定及纯化获得的多肽特异性抗体。软件预测显示,Vpr蛋白N端的第3～19位(N)和C端的第82～95位(C)氨基酸序列为潜在B细胞抗原表位;ELISA检测抗血清中多肽特异性抗体的效价都达到1:105以上;Western-Blotting结果显示,无论对HIV-1B亚型还是CRF07_BC重组型的Vpr蛋白,其多肽N抗体和C抗体均能特异性识别;免疫沉淀结果显示,Vpr多肽N和C抗体也能特异性结合未变性的野生型Vpr或GFP-Vpr融合蛋白。利用生物信息学技术能成功预测Vpr蛋白B细胞抗原表位,免疫所获得的抗体具有较好的特异性和应用性。     

家兔支气管败血波氏杆菌重组百日咳杆菌粘附素（PRN）蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

目的表达支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica,Bb）PRN蛋白,并以此建立检测Bb抗体的间接ELISA方法。方法参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌prn基因序列（AY376325）设计了一对特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pGEX-4T-1中,以E.coli BL21（DE3）为表达菌株进行诱导表达,以纯化重组蛋白PRN作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数等,建立检测支气管败血波氏杆菌抗体的间接ELISA方法。结果成功克隆了prn全基因序列,并在E.coliBL21（DE3）中获得高效表达,经SDS-PAGE、Western blot分析显示重组蛋白PRN具有良好的抗原性。应用重组蛋白PRN为抗原建立了检测Bb血清抗体的间接ELISA诊断方法。试验确定重组蛋白PRN抗原的包被浓度为500ng/mL,最适血清稀释度为1∶40。结论建立的ELISA检测方法,不仅为Bb抗体检测提供了实用的血清学检测手段,也为进一步开发Bb检测试剂盒奠定了基础。     

禽白血病病毒p27基因在原核细胞的表达及生物学特性的初步分析

将禽白血病病毒(ALV)的p27基因克隆人表达性载体pET28a,在大肠杆菌以His Tag融合蛋白的形式获得了高效表达。以表达产物免疫家兔,制备了抗ALV p27的多克隆抗体,经亲和纯化后,用此抗体建立了对ALV抗原的双抗体夹心法ELISA,并对疑似病料进行了实验室诊断。检测结果与IDEXX的禽白血病抗原检测试剂盒符合率达到98．6％,证明表达产物保留了天然p27蛋白的相关抗原性。交叉试验和群特异性试验证明,此方法具有良好的特异件,并且可以检测出A、B、J亚群的禽白血病病毒p27抗原。用此ALV抗体和所建立的ELISA方法成功地进行了禽白血病病毒抗原的实验室诊断。     

鼠疫菌PsaA 抗原的表达及抗体制备和应用

目的:制备鼠疫菌PsaA抗原及抗体,建立针对PsaA抗体的快速检测方法,并检测鼠疫感染猴血清标本中的PsaA抗体的阳性率。方法:利用PCR方法扩增出PsaA蛋白基因片段,在大肠杆菌原核表达系统中表达出重组PsaA抗原,以镍柱亲和层析纯化包涵体形式的表达蛋白,以尿素梯度透析复性成可溶蛋白。再以表达蛋白为免疫原,常规免疫家兔,收集兔血清制备多抗,并以正辛酸-硫酸铵法提纯获得PsaA抗体IgG。利用得到的PsaA抗原和抗体为材料,建立两种检测PsaA抗体的快速检测方法,即间接ELISA法和上转换发光(Up-converting Phospher Technology,UPT)免疫层析试纸条法。最后利用这两种方法检测18份猴血清标本中的PsaA抗体。结果:鼠疫菌感染猴血清标本中PsaA抗体的阳性率为62%(8/13)。结论:成功建立了针对鼠疫菌PsaA抗体的快速检测方法,并检测到13份鼠疫感染猴血清标本中的PsaA抗体的阳性率为62%。     

鼠疫菌PsaA抗原的表达及抗体制备和应用

目的：制备鼠疫菌PsaA抗原及抗体,建立针对PsaA抗体的快速检测方法,并检测鼠疫感染猴血清标本中的PsaA抗体的阳性率。方法：利用PCR方法扩增出PsaA蛋白基因片段,在大肠杆菌原核表达系统中表达出重组PsaA抗原,以镍柱亲和层析纯化包涵体形式的表达蛋白,以尿素梯度透析复性成可溶蛋白。再以表达蛋白为免疫原,常规免疫家兔,收集兔血清制备多抗,并以正辛酸-硫酸铵法提纯获得PsaA抗体IgG。利用得到的PsaA抗原和抗体为材料,建立两种检测PsaA抗体的快速检测方法,即间接ELISA法和上转换发光（Up-converting Phospher Technology,UPT）免疫层析试纸条法。最后利用这两种方法检测18份猴血清标本中的PsaA抗体。结果：鼠疫菌感染猴血清标本中PsaA抗体的阳性率为62%（8/13）。结论：成功建立了针对鼠疫菌PsaA抗体的快速检测方法,并检测到13份鼠疫感染猴血清标本中的PsaA抗体的阳性率为62%。     

家兔支气管败血波氏杆菌重组蛋白DNT1的原核表达及其间接ELISA方法的建立

目的表达支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica,Bb）DNT蛋白,并以此建立检测Bb抗体的间接ELISA方法。方法参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌dnt基因序列（AB020025）针对其N-端设计了一对特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pET-28a（＋）载体中,以E.coli BL21（DE3）为表达菌株进行诱导表达,以纯化重组蛋白DNT1作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数,建立检测支气管败血波氏杆菌重组蛋白DNT1抗体的ELISA方法。结果成功克隆了dntN-端的基因序列,并在E.coli BL21（DE3）中获得高效表达,经SDS-PAGE、Western blot分析显示重组蛋白DNT1具有良好的抗原性。应用重组蛋白DNT1为抗原建立了检测Bb血清抗体的间接ELISA诊断方法。试验确定重组蛋白DNT1抗原的包被浓度为6.25μg/mL,最适血清稀释度为1∶100。结论建立的ELISA检测方法,不仅为Bb抗体检测提供了一种比较实用的血清学检测手段,也为进一步开发Bb检测试剂盒奠定了基础。     

影响免疫组织化学敏感性反应的因素分析及对策

免疫组织化学技术是用已知标记的特异性抗体或抗原对组织内相应抗原或抗体进行定性、定位或定量检测,经组织化学反应,使标记于特异性抗体的酶、金属及荧光素等呈现出某种颜色,并借助于光镜,荧光镜及电镜等观察其颜色变化,从而了解抗原抗体结合部位和量的一门新兴检测...     

抗汉坦病毒NP scFv基因表达及生物活性分析

诱导已构建的重组质粒pGEX-6P—1—scFv原核表达抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体,并用酶免疫实验检测单链抗体生物活性。用IPTG诱导重组原核表达质粒pGEX-6P-1-scFv表达抗汉坦病毒NP单链抗体融合蛋白,经亲和层析纯化,并应用SDS—PAGE电泳检测单链抗体融合蛋白,应用酶免疫实验检测抗NP单链抗体生物学活性。SDS—PAGE电泳检测显示,原核重组质粒pGEX-6P-1-scFv已表达分子量约为56ku的单链抗体融合蛋白;酶免疫实验检测显示,单链抗体具有与汉坦病毒NP抗原特异性结合的生物学活性。结果表明,已构建的原核表达重组质粒pGEX-6P-1-scFv,能够成功表达具有与汉坦病毒NP抗原特异性结合生物学活性的单链抗体。     

伤寒沙门氏菌及其抗原检测方法的近年进展

伤寒病的诊断,来自病原学的证据最为可靠。检测伤寒特异性抗体,对诊断有重要的参考价值,但特异抗原刺激机体产生有关抗体,有一定的时间过程,而且受各种因素影响。在一些免疫功能紊乱或缺陷的患者中,检测抗体往往易产生假阳性或假阴性反应,而检测抗原则可     

家蚕GAPDH内参蛋白多克隆抗体的制备及其检测

制备家蚕GAPDH内参蛋白多克隆抗体,并对该抗体进行检测。利用PCR技术从家蚕中克隆GAPDH基因,构建其原核表达载体,转化大肠杆菌,诱导表达重组蛋白并纯化。纯化后的蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔制备GAPDH多克隆抗体。用酶联免疫吸附法和Western blot检测抗体的效价和特异性。结果显示,成功构建GAPDH/p ET-28a原核表达载体,获得高纯度的GAPDH重组融合蛋白;经SDS-PAGE和抗His单抗检测,纯化后蛋白的分子量大小与预测的一致;以该蛋白为免疫抗原,采用4次免疫方式对新西兰大白兔进行免疫,获得GAPDH多克隆抗体血清。酶联免疫吸附检测结果表明,GAPDH抗体的效价为1:8000,并能与天然家蚕蛋白特异性结合。成功制备了家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体,为深入研究家蚕中不同蛋白的生理功能和作用奠定了坚实的基础。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB双抗体夹心ELISA方法的建立

抗原纯净度是口蹄疫 (Foot-and-mouth disease,FMD) 灭活疫苗质量检验的一项重要内容,一般采用疫苗2–3次免疫动物后,检测非结构蛋白 (Non-structural protein,NSP) 抗体是否阳转,判断疫苗抗原的纯净度。文中旨在建立定量检测FMD灭活疫苗抗原中NSP 3AB含量的ELISA方法,为疫苗质量控制提供参考方法。利用口蹄疫病毒 (Foot-and-mouth disease virus,FMDV) NSP 3A单克隆抗体和辣根过氧化物酶 (Horseradish peroxidase,HRP) 标记的3B单克隆抗体,建立定量检测NSP 3AB含量的双抗体夹心ELISA检测方法。采用原核表达并纯化的3AB蛋白作为标准品,标准品系列稀释,绘制标准曲线,以标准品与未加抗原的阴性对照吸光值 (OD) 的比值大于2.0的标准品最低浓度为最低检测限。标准品浓度介于4.7–600.0 ng/mL之间时,测得的OD值与浓度呈线性相关,回归曲线呈直线,相关系数R2=0.99,确定最低检测限为4.7 ng/mL。检测12份未纯化灭活抗原中3AB蛋白含量介于9.3–200.0 ng/mL之间;而纯化后的病毒抗原中3AB蛋白残留量低于最低检测限;33份来自不同厂家的成品疫苗抗原中9份疫苗抗原3AB蛋白含量在9.0–74.0 ng/mL之间,其余24份疫苗抗原中3AB蛋白残留量低于最低检测限。检测3AB蛋白含量的双抗体夹心ELISA方法能够特异、敏感地检测疫苗抗原中的3AB蛋白含量,为疫苗质量控制与纯净度检验提供了一种可供选择的检测方法。     

弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白的融合表达、纯化及抗原性分析

利用基因工程技术制备抗原性好的弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白的融合蛋白,并用作抗原检测弓形虫抗体。根据弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白的氨基酸序列,通过计算机分析,筛选出其中较强的抗原决定簇。用PCR方法分别扩增含抗原决定簇的基因片段。将这两个基因片段克隆至同一质粒pET28a(+)内,表达一个融合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选表达该融合蛋白的工程菌。纯化表达的融合蛋白,用已知的6份抗弓形虫IgM阳性血清和大量正常人血清,ELISA法检测纯化融合蛋白的抗原性和特异性。获得了高效表达含弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白抗原表位的工程菌,表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的25%。纯化获得了表达的融合蛋白,该蛋白有较好的抗原性和特异性。表达的弓形虫GRA6和P30融合蛋白可用做抗原检测弓形虫抗体,用于临床及孕妇检测,对优生优育有较大意义。