高产人参寡糖素培养细胞克隆系的筛选

人参（ＰａｎａｘｇｉｎｓｅｎｇＣ．Ａ．Ｍｅｙ．）培养细胞经细胞平板克隆,获得近３００个克隆系。克隆系在细胞生长速率和寡糖素含量及产率上均存在显著差异,且寡糖素产率和细胞生长之间有明显的相关性。经１１代连续继代培养观察及过氧化物酶同工酶谱特征分析,筛选到一株寡糖素产率高且稳定的克隆系ＰＧ－１８０,其平均生长速率是０．４９５ｇ于重／Ｌ·天,为原始株系的１．３９倍,平均寡糖素含量为１４．６９％干重,是亲本的１．６５倍,平均寡糖素产率是２．１８３ｇ／Ｌ,为原始株系的２．３２倍。比较克隆系ＰＧ－１８０和原始株系细胞悬浮培养时间进程发现,由人参培养细胞生产寡糖素的最佳细胞收获期为３周左右。     

粉叶小檗愈伤组织单细胞克隆

以粉叶小檗愈伤组织为材料 ,用B5液体培养基进行悬浮培养建立悬浮细胞系。经 3～ 4次继代培养即可得到悬浮的单细胞。悬浮细胞通过细胞平板克隆 (一般B5培养基平板克隆 ,优化培养基平板克隆和条件培养基平板克隆 ) ,经 5代连续继代培养观察和薄板层析 -分光光度法分析 ,发现用优化培养基进行平板克隆植板率最高 ,且克隆最易成功 ,并且还筛选到一株小檗碱产率高且稳定的克隆CV 5 7,其平均生长速率为 14 .4 12mg .Fw/L .d ,为原始株系的 1.91倍 ,平均小檗碱含量为 2 .17%干重 ,是原始株系的 2 .2 6倍。     

人参寡糖素M对红花培养细胞生长与α-生育酚形成的影响

人参寡糖素M能提高红花(Carthamus tinctorius)培养细胞的生长速率和培养细胞中代谢产物α-生育酚的含量。其最适作用浓度在愈伤组织培养中为5mg/L。在红花细胞悬浮培养加入人参寡糖素M1d后,培养细胞中α-生育酚的含量即提高,但由于累积效应,因而于细胞接种当天同时加入人参寡糖素M对细胞生长和α-生育酚含量的提高效果较好。加入人参寡糖素M可缩短红花悬浮培养细胞生长的延缓期,并于指数生长期作用最明显;另外可使细胞生长及α-生育酚积累同时提前达到最高值,因而缩短了细胞收获时间。     

诱导子人参寡糖对红花培养细胞的生理效应

从人参(Panax ginseng)培养细胞中分离纯化出不同寡糖。这些寡糖能促进红花(Car-thamus tinctorius)培养细胞的生长及提高细胞中α-生育酚的含量。其中以Ⅶ、Ⅷ、Ⅵ等三种寡糖的效果较为显著。这三种寡糖的最适浓度在愈伤组织培养(5—8 mg/L)中要比在细胞悬浮培养(1—2mg/L)中高。对Ⅶ、Ⅷ两种寡糖不同时期加入的效应进行了试验,结果发现,加入寡糖后1—3天,α-生育酚的含量即提高。在红花细胞悬浮培养过程中同时加入2mg/L 的寡糖Ⅵ和寡糖Ⅶ及1mg/L 的寡糖Ⅷ,可使红花细胞生长速率提高18.11%,α-生育酚含量比对照提高3.5倍,其产率比对照提高4.3倍。     

粉叶小檗愈伤组织单细胞克隆

以粉叶小檗愈伤组织为材荆,用B5液体培养基进行悬浮培养建立悬浮细胞糸。经3～4次继代培养即可得到悬浮的单细胞。悬浮细胞通过细胞平板克隆(一般B5培养基平板克隆、优化培养基平板克隆和条件培养基平板克隆),经5代连续继代培养观察和薄板层析-分光光度法分析,发现用优化培养基进行平板克隆植板率最高,且克隆最易成功,并且还筛选到一株小檗碱产率高且稳定的克隆CV-57,其平均生手速率为每天14．412mg／L,为原始株系的1．91倍,平均小檗碱含量为干重的2．17％,是原始株系的2．26倍。     

红花单细胞克隆的建立

KT,2,4-D 及 NAA 能提高红花(Cathamus tinctorius)细胞克隆平板培养的植板率。这三种激素对细胞生长的最佳搭配是2,4-D2.0mg/l,KT0.3mg/l,NAA 0.5mg/1。红花细胞悬浮继代培养代数不同,其植板率相差甚远,用悬浮培养第三代的细胞做材料最好,其植板率是第一代悬浮培养细胞做材料的8.5倍。红花细胞克隆的条件培养的植板率是普通平板培养的3.6倍。固-液双层培养的植板率是普通平板培养的4.7倍。对已建立的红花细胞克隆进行生长速率的比较表明,生长最漫的克隆的生长速率为3.08g/g/35天,生长最决的克隆的生长速率高达23.33g/g/35天。     

植醇与寡糖对红花悬浮培养细胞的生长及α-生育酚积累的效应

在红花细胞悬浮培养基中加入α-生育酚的前体植醇能显著增加α-生育酚的积累,较高浓度的植醇(50～100 ppm)能同时促进细胞的生长。在培养基中加入抗氧剂角鲨烯也能提高α-生育酚的积累。诱导因子寡糖对细胞的生长和α-生育酚含量均有提高作用,其中以寡糖F_(11)效果较佳。悬浮细胞培养基中同时加入15ppm的寡糖F_(11),75ppm的植醇和100 ppm的角鲨烯,细胞生长速率可提高23.81％,α-生育酚含量及产率分别比对照提高2.8倍和3.6倍。     

红花愈伤组织诱导、生长及其α-生育酚的产生

通过TLC和HPLC初步分析和鉴定,证明从红花(Carthamus tinctorius)无菌苗的胚根、胚轴及子叶和花蕾中诱导出的愈伤组织均具有合成α-生育酚的能力。其中以胚轴的愈伤组织和悬浮培养细胞的生长速率及α-生育酚的含量较高,分别达到0.35、0.39克干重/升·天和0.62、2.28毫克/100克干重样品。对红花细胞生长较适宜的培养基为MC培养基。培养基中附加10％椰子汁或0.1％酪蛋白氨基酸可使细胞生长显著提高,分别达到0.45和0.41克干重/升·天。     

高产人参寡糖素培养细胞变异克隆系的筛选

用２ｍｍｏｌ／Ｌ的ＭＮＮＧ处理经过滤的人参悬浮培养细胞１小时后,细胞存活率下降显著,细胞克隆植板率只是对照组的１０．１２％。经细胞平板克隆共获得克降系１５１株,其中很多克隆系转移培养中生长缓慢,甚至不生长而死亡,经分析可供测定的克隆系生长的寡糖素含量的差异,对１１株寡糖素含量较高克隆系经连续１０代继代培养观察,选出一株稳定高产人参寡糖素优良克隆系ＰＧＭＢ－３７,其平均生长速率是０．５５８ｇＤＷＬ＾     

精胺对霍山石斛类原球茎悬浮培养细胞生长和多糖合成的影响

研究了在添加外源精胺时,霍山石斛类原球茎细胞生长、多糖积累、主要营养物质消耗以及细胞内多胺含量的变化。结果表明,0.6mmol/L的精胺明显促进霍山石斛类原球茎细胞的生长和多糖的合成。细胞的比生长速率从0.046d-1提高到0.054d-1。培养30d时,类原球茎干重达32.4gDW/L,多糖总产量为2.46g/L,分别是对照的1.32和1.31倍。添加外源精胺能够提高内源多胺的含量,同时,蔗糖酶和硝酸还原酶等相关代谢酶的活性增强,促进了碳、氮的吸收和利用。     

银杏细胞固定化培养及银杏内酯的产生

探讨利用银杏 (GinkgobilobaL .)细胞固定化培养方法 ,大规模生产药用成分银杏内酯类化合物的可能性。考察了植物生长调节剂对银杏固定化培养细胞生长及发酵液中银杏内酯类成分产生的影响。结果显示 ,最优培养基生长调节剂配比为 2 ,4 D 8 0mg L KT 0 0 4mg L NAA 0 4mg L。优化培养后 ,固定化细胞最高生物量出现在第 1 2d ,为 0 4gDW 瓶。发酵液中银杏内酯含量 :GKA在 2 2d时最高 (2 0 0 μg L) ,GKB在 1 8d时最高 (1 2 2 μg L) ,GKC在 1 8d时最高 (5 0 9μg L)。     

H2O2对蛇足石杉离体培养物诱变效应的研究

为了获得高产石杉碱甲(Huperzine A,Hup A)的蛇足石杉[Huperzia serrata(Thunb.)Trev.]叶状体,对H_2O_2诱变后的叶状体进行了研究。结果表明,诱变后叶状体株系的Hup A含量显著提高,并获得高产株系SH42,其相对生长率和Hup A含量分别达到4499.28%和261.17μg g~(–1) DW,比起始叶状体分别提高了2.35倍和2.43倍;且株系间可溶性蛋白质谱带和SOD同工酶谱均存在差异,经过连续9代培养,变异叶状体可以稳定遗传。因此,H_2O_2对叶状体细胞具有良好的诱变效应,可以用于筛选高产Hup A株系。     

HPLC法分析油菜种子油中维生素E的组成与含量

利用HPLC法分析了50份遗传背景丰富的白菜型油菜、甘蓝型油菜、芥菜型油菜和芸芥种子油中维生素E的组成与含量.研究结果显示,油菜种子油中主要含α-生育酚和γ -生育酚,且a-生育酚、γ-生育酚和维生素E总量均存在明显的基因型差异,甘蓝型油菜种子油中维生素E含量总体水平最高,平均总量较高,为123.11 mg/100g油,维生素E含量最高的Omega,总量为144.73 mg/100g油,α/γ-生育酚比值最高可达0.77.α-生育酚、γ-生育酚和维生素E总量与类胡萝卜素含量均呈现显著负相关,种子油中α-生育酚与含油量呈现显著正相关,α-生育酚、γ -生育酚和维生素E总量与生育期均呈现显著或极显著正相关,α-生育酚和维生素E总量与株高均呈现显著正相关,维生素E总量与千粒重呈显著正相关,而α-生育酚、γ-生育酚和维生素E总量与全株角果数和每角粒数相关不显著.     

HPLC分析油菜籽油中维生素E的组成与含量

本文利用ＨＰＬＣ法分析了５０份遗传背景丰富的白菜型油菜、甘蓝型油菜、芥菜型油菜和芸芥种子油中维生素E的组成与含量,研究结果显示,油菜种子油中主要含α-生育酚和? -生育酚,且α-生育酚、? -生育酚和维生素E总量均存在明显的基因型差异,甘蓝型油菜种子油中维生素E含量总体水平最高,平均总量较高,为123.11 mg/100g油, 维生素E含量最高的Omega,总量为144.73 mg/100g油, α/ ? -生育酚比值最高可达0.77。α-生育酚、? -生育酚和维生素E总量与类胡萝卜素含量均呈现显著以上负相关,种子油中α-生育酚与含油量呈现显著正相关,α-生育酚、? -生育酚和维生素E总量与生育期均呈现显著或极显著正相关,α-生育酚和维生素E总量与株高均呈现显著正相关,维生素E总量与千粒重呈显著正相关,而α-生育酚、? -生育酚和维生素E总量与全株角果数和每角粒数相关不显著。     

单克隆人胰腺干细胞分离培养体系的建立

本研究探讨了建立单克隆人胰腺干细胞分离培养体系及单克隆人胰腺干细胞系．对一些影响干细胞增殖的因素进行了分析。无菌取人流产胎儿胰腺组织,切碎至1mm3,0．1％ Ⅳ型胶原酶消化,低糖DMEM、10％FBS、3．7g／LNaHCO3、0．08g／L青霉素及0．1g/L链霉素培养液贴壁培养细胞,2．5g／L胰蛋白酶＋0．4g／LEDTA消化传代。克隆环筛选单克隆干细胞,培养液中添加10ng／mLEGF．扩增单克隆干细胞。采用核型分析法检测干细胞染色体,MTT法测定干细胞生长曲线。胶原酶消化胰腺组织．获得单个细胞和细胞团。贴壁培养．原代上皮样胰腺干细胞克隆性生长。胰蛋白酶消化传代,上皮样胰腺干细胞逐渐被纯化。克隆环筛选,获得单克隆人胰腺干细胞。扩增培养,1例来源于4月龄男性流产胎儿胰腺组织干细胞建系,传50代。染色体核型分析．该干细胞系为正常的二倍体细胞。细胞生长曲线显示培养1—4d,干细胞生长缓慢,5-6d,进入倍增期。培养液中添加15％FBS,干细胞增殖较快。再添加15ng／mLEGF或10ng／mL IGF—Ⅱ．干细胞增殖更快。研究结果表明应用本实验建立的细胞分离培养体系获得了单克隆人胰腺干细胞系。     

紫外诱变筛选海洋红酵母S8的尿嘧啶缺陷型菌株

本课题组从海南天然海域筛选到一株高产类胡萝卜素的海洋红酵母菌株S8,该菌株对鱼无毒害,并与鱼共生,欲将其应用于盐诱导表达外源蛋白的海洋红酵母工程菌的构建。本研究利用紫外诱变筛选的方法处理S8菌株,通过统计其UV致死率、5-氟乳清酸致死率等筛选S8的尿嘧啶营养缺陷型突变株。研究结果表明,供试菌株通过紫外线诱变、5-氟乳清酸致死和回复突变率的实验筛选,共获得16株稳定的尿嘧啶缺陷型突变株,突变菌株在基本培养基中培养了8d仍不能生长。选择了其中的一株ST5进行了产胡萝卜素能力的测定,结果表明,在同样的培养条件下,野生型S8菌株细胞生物产量可达87.55g/L,类胡萝卜素含量可达520μg/g,突变株ST5的细胞生物产量为85.45g/L,类胡萝卜素含量为512μg/g;ST5的产胡萝卜素能力方面与野生型S8无明显差异。因此,尿嘧啶缺陷型菌株ST5可为下一步海洋红酵母工程菌的构建提供受体菌。     

杜仲细胞悬浮培养产黄酮及其动力学研究

本文应用正交设计对杜仲细胞悬浮培养的基本培养基和植物生长物质浓度进行了筛选,并对影响杜仲细胞悬浮培养和总黄酮含量的不同因素进行了考察。结果表明,B5培养基+0.5mg/L NAA+0.6mg/L 6-BA、蔗糖30g/L、初始pH 5.0-5.5、接种量20g(FW)/L以及摇床转速110r/min为杜仲细胞悬浮培养的适宜条件。通过对杜仲悬浮细胞生长和代谢动力学的分析表明：杜仲细胞悬浮培养生长符合Logistic生长模型,最大比生长速率( m)为0.417d-1;细胞基于蔗糖的真正比生长得率(YG)与维持系数(m)分别为0.619g/g和0.0206g/(g·d-1);黄酮合成属部分生长耦联型,可用Luedeking-Piret模型进行描述。研究结果为杜仲细胞大规模悬浮培养生产天然活性成分奠定了基础。     

尿素对中肋骨条藻与米氏凯伦藻生长的影响

采用实验室一次性培养,研究了尿素对我国东海赤潮优势藻中肋骨条藻(Skeletonema costatum)和米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)生长的影响。结果表明,中肋骨条藻和米氏凯伦藻均能在不同比例尿素的条件下较好地生长。随着培养液中尿素比例的增大,中肋骨条藻细胞生长速率(0.91—0.82/d)逐渐减小,平台期最大生物量(2.0×10~5—1.2×10~5个/m L)也逐渐减小,而米氏凯伦藻细胞的生长速率(0.36—0.51/d)逐渐增大,最大生物量基本不变(约1.1×10~4个/m L)。在平台期中肋骨条藻培养液中氮盐浓度最低下降到2.5μmol/L左右维持不变,而米氏凯伦藻氮盐浓度最低下降到1.0μmol/L左右。在指数生长期,随着细胞的生长溶解有机氮(DON,Dissolved Organic Nitrogen)含量迅速增加,中肋骨条藻介质中DON的浓度达到最大值(5—6μmol/L),然后浓度基本不变。米氏凯伦藻介质中DON在指数生长阶段达到最大值(2—3μmol/L)后开始下降。中肋骨条藻单细胞颗粒氮的含量(约为10~(-6)μmol,平台期约为10~(-7)μmol)要远远小于米氏凯伦藻(指数期约为10~(-4)μmol,平台期约为10~(-6)μmol)。研究表明,两种藻对尿素的吸收利用存在明显差异,在较低的溶解无机氮和较高的溶解有机氮环境中,甲藻有更好的适应性,该研究对于解释我国长江口春季硅藻和甲藻赤潮的演替有借鉴的意义。     

高产人参寡糖素培养细胞克隆系的诱变筛选

紫外辐射能显著地降低人参培养细胞单细胞克隆的植板率。当紫外辐射悬浮细胞３０ｓ后,细胞克隆的植林率是对照组的２１．４３％。细胞克隆平板培养６０ｄ,挑取克隆连续转移培养３次,共获得克隆系１２２株。对所有克隆系进行变异分析并经１０代连续继代培养,从中筛选到一株稳定的高产寡糖素克隆系ＰＧＵＡ－０８,而且它的过氧化物酶同工酶谱特征也保持稳定。克隆系ＰＧＵＡ－０８的生长速率为０．５３７ｇＤＷＬ－１ｄ－１,是亲本的１．４６倍,寡糖素含量为１７．１６％ＤＷ,是亲本的１．８１倍,寡糖素产率为２．７６４ｇ／Ｌ,是亲本的２．６２倍。