表达传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因的重组马立克氏病病毒的构建

传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）是一种由鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）引起的危害3～12周龄青年鸡的急性、高度接触性传染病.IBDV属于双RNA病毒科的禽双RNA病毒属,其基因组由A和B两个节段组成.研究表明,IBDV主要的抗原性及致病性位点均位于A片段,其中VP2蛋白具有血清型特异性位点,并能诱导产生抗病毒的血清中和抗体,是该病毒的主要抗原.     

含HVT部分gB基因马立克氏病病毒的转移载体的构建及表达

根据己发表马立克氏病病毒(MDV)血清Ⅰ型短独特区(US)基因序列,设计一对引物用PCR方法扩增出CVI988/Rispens株的包括部分sorf2和sorf3基因及全部us1和us10基因,并克隆入SK( )载体中,筛选出阳性载体pBUS10。用PCR的方法在火鸡疱疹病毒(HVT)gB基因主要抗原决定簇的前端及后端分别加上血凝素基因(HA)及终止子TAA,并克隆到pcDNA3载体中,构建出在CMV启动于和增强于控制下含HA及gB基因主要决定簇的表达盒;将此表达盒克隆入pBUS10载体的us10基因中,构建出一种含HA及gB基因主要决定簇的转移载体pBUS10gB3。转染CHO细胞后,用兔抗鸡IgY进行间接免疫荧光试验,证实该转移质粒载体可有效地表达HVT gB基因。     

表达禽流感病毒M2基因的重组马立克氏病病毒的构建

将禽流感病毒M2基因克隆于真核表达质粒pIRES-EGFP中,使其位于pCMV启动子的调控下,并与绿色荧光蛋白基因（EGFP）串联后,将上述串联基因插入到含MDV CVI988的非必需区US基因的重组质粒pUS2中,构建带标记的重组质粒,然后将此重组质粒转染感染了MDV CVI988的鸡胚成纤维细胞,利用同源重组的方法,筛选了表达禽流感病毒M2基因的重组病毒MDV1。经PCR、Dot-blotting,Western-blotting等实验的结果表明,禽流感病毒M2基因的确插入到MDV1（CVI988）基因组中并获得表达。重组MDV1免疫1日龄SPF鸡21天后,用ELISA可检测到M2蛋白的特异性抗体。接种了重组病毒rMDV的鸡体内针对H9N2疫苗血凝素的抗体滴度(p<0.05)明显提高,以禽流感病毒AIV A/Chicken/Guangdong/00（H9N2）攻毒后进行病毒重分离试验的结果发现,重组病毒能有效地降低病毒的排出量(p<0.01),说明该重组病毒可以用于防制禽流感的免疫。     

马立克氏病病毒的分子生物学研究进展

马立克氏病病毒的分子生物学研究进展罗满林,蔡宝祥,陈溥言（南京农业大学动物医学系,南京２１００９５）ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＭａｒｅｋ＇ｓＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓ￥ＬｕｏＭａｎｌｉｎ;ＣａｉＢａｏｓｉａｎｇ;ＣｈｅｎＰ...     

马立克氏病病毒（MDV）814株B抗原基因的克隆及部分序列分析

提取感染鸡胚成纤维细胞ＭＤＶ－Ｉ弱毒株８１４病毒ＤＮＡ为模板,根据ＲＢＩＢ株ｇＢ基因５′及３′两端核苷酸离列设计引物,利用ＰＣＲ技术扩增了我国ＭＤＶ－Ｉ弱毒株８１４ｇＢ基因（２．９ｋｂ）将扩增片段平末端克隆到载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ中ＥｃｏＲＶ位点,经ＢａｍＨＩ,ＨｉｎｄＩＩＩ酶切鉴定得到不同插入方向的重组质粒。构建圹增片段的酶切图谱及部分序列分析证明与ＲＢＩＢ株ｇＢ基因无差异,显示了极高的     

鸡马立克氏病病毒糖蛋白gB基因的表达及基因免疫

将马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)gB基因插入真核表达载体pcDNA3中,经酶切和PCR鉴定为正向插入了gB基因的重组质粒,命名为pcDNA3-gB。体外转染COS-7细胞,经间接免疫荧光染色证实转染pcDNA3-gB后的COS-7细胞内有糖蛋白B的表达。用pcDNA3-gB对从肉用雏鸡腿部肌肉注射,进行一免。间隔2周后,用pcDNA3-gB再加强免疫一次。之后2周攻毒,观察免疫保护效果。结果表明,MDV gB基因DNA免疫可以诱导鸡体产生免疫保护,免疫保护指数为72．2％。     

含HVT部分gB基因马立克氏病病毒的转移载体的构建及表达

根据已发表马立克氏病病毒(MDV)血清Ⅰ型短独特区(US)基因序列,设计一对引物用PCR方法扩增出CVI988/Rispens株的包括部分sorf2和sorf3基因及全部us1和us10基因,并克隆入SK(+)载体中,筛选出阳性载体pBUS10.用PCR的方法在火鸡疱疹病毒(HVT)gB基因主要抗原决定簇的前端及后端分别加上血凝素基因(HA)及终止子TAA,并克隆到pcDNA3 载体中,构建出在CMV启动子和增强子控制下含HA及gB基因主要决定簇的表达盒;将此表达盒克隆入pBUS10载体的us10基因中,构建出一种含HA及gB基因主要决定簇的转移载体pBUS10gB3.转染CHO细胞后,用兔抗鸡IgY进行间接免疫荧光试验,证实该转移质粒载体可有效地表达HVT gB基因.     

马立克氏病病毒REispens株B抗原基因的克隆及其重组鸡痘病毒的构建

Purified DNAs from Chicken Embryo Fibroblast (CEF) cultures infected with MDV strain Rispens were used as templates. Specific fragment with the size of about 2.9 kb was successfully amplified through Polymerase Chain Reaction(PCR) and identified to be gB gene of MDV by dot blot hybridization with a digoxigenin-labelled MDV gB specific oligonucleotide probe. The gB gene from strain Rispens was cloned into pUC19 and FPV insertion vector pFG1175-1 to construct plasmid pMGB and pFGBR1775-1 respectively. DOSPER liposome-mediated transfection with insertion vector DNA pFGBR1175-1 was performed on CEF monolayers infected with FPV 3-4 h earlier. Recombinant FPV was clone purified. Immunofluorescence Assay(IFA) showed that MDV gB gene had been expressed in FPV.     

马立克氏病病毒Md11株pp24基因的原核表达

通过PCR方法扩增MDV Md11株pp24基因的完整ORF,按正确的阅读框架将其克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中,重组质粒转化BL21宿主菌后,经IPTG诱导表达.诱导菌体裂解物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后,用山羊抗GST抗体进行Western-blotting试验,结果确证了GST-pp24融合蛋白的表达.将表达产物从凝胶中回收,免疫4周龄小白鼠,3次免疫后,采血分离血清.所得抗GST-pp24多克隆抗血清分别与GA株、Md11株和CVI988株MDV感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)进行间接免疫荧光试验(IFA),结果表明大肠杆菌表达的pp24融合蛋白至少保留了部分天然pp24蛋白的抗原性.     

表达IBDV VP2融合蛋白的重组MDV的构建及其免疫特性

将增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)与鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的VP2基因融合,插入马立克氏病毒(MDV)CVI988/Rispens的非必需区US10片段中,成功构建表达VP2融合蛋白的MDVCVI988转移载体pUC18-US10-VP2。将转移载体质粒与CVI988/Rispens疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),筛选获得表达VP2融合蛋白的重组MDV(rMDV)。聚合酶链式反应(PCR)和间接免疫荧光实验(IFA)证明,rMDV传至第31代仍能稳定表达VP2融合蛋白。用rMDV免疫SPF鸡,进行IBDV攻毒保护试验,1日龄SPF鸡分别用1000PFU、2000PFU、5000PFU的rMDV进行免疫,33日龄用100LD50的IBDVJS超强毒进行攻毒,鸡的免疫保护率分别为50%、60%、80%。值得注意的是,5000PFU的rMDV一次免疫1日龄SPF鸡,其法氏囊组织病理损伤等级与IBD中等毒力活疫苗常规二次免疫相当(2·0/1·5),其保护效果无显著差异(p>0·05),而与非重组病毒免疫组相比较,保护效果差异显著(P<0·01),这表明构建的表达IBDVVP2融合蛋白的rMDV可以有效地为SPF鸡提供免疫保护作用。     

表达绿色荧光蛋白报告基因重组禽腺联病毒载体系统的构建与鉴定

为了开展重组禽腺联病毒(Recombinant avian adeno-associated virus,rAAAV)介导的基因转移研究,用限制性内切酶消化含AAAV全基因组的重组质粒pCR-AAAV,去除AAAV Rep和Cap蛋白编码序列,将PCR扩增的绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)报告基因插入AAAV末端反向重复序列(Inverted terminal repeats,ITR)之间,获得表达GFP基因的AAAV转移载体pAITR-GFP;以含AAAV全基因组的质粒为模板,用PCR分别扩增AAAV Rep、Cap和Rep-Cap蛋白基因,将Rep和Cap基因分别插入真核细胞双表达载体pVITRO2-mcs的两个多克隆位点,将Rep-Cap蛋白基因插入真核细胞表达载体pcDNA3,获得AAAV辅助质粒pVITRO2-ARC和pcDNA-ARC;将pAITR-GFP、pVITRO2-ARC或pcDNA-ARC与腺病毒辅助质粒pHelper组成三质粒转染系统,用磷酸钙沉淀法共转染AAV-293细胞,获得了表达GFP的rAAAV.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,纯化病毒出现分子量正确的VP1、VP2、VP3结构蛋白;经PCR检测证明,重组病毒中含有GFP报告基因;用重组病毒分别感染鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚肝CEL细胞,可以观察到GFP报告基因的表达,表达时间持续两周以上.这些试验结果表明,成功建立了辅助病毒非依赖性rAAAV体外包装体系,为禽源细胞的基因转移研究和禽重组活载体疫苗的研制打下了基础.     

串联表达马立克氏病病毒糖蛋白B主要抗原决定簇基因的重组鸡痘病毒的构建

马立克氏病(Marek's disease,MD)是由马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)引起的一种具有高度传染性、淋巴组织增生性疾病,病理上以外周神经、性腺、虹膜、各种脏器和皮肤发生单核细胞浸润为特征[1].MD是世界上最重要的家禽传染病之一,是造成世界养禽业重大经济损失的一个主要原因.20世纪70年代早期MD疫苗的发现才使MD得到控制[2].     

含组氨酸纯化标签的假病毒表达载体的构建与应用

为了RNA类病毒进行核酸检测提供一种更稳定、更方便的全程监控技术,本文研究了含组氨酸纯化标签的假病毒监控内标和阳性对照的制备方法．通过基因工程手段将6个组氨酸插入MS2噬菌体包膜蛋白的β-发夹环结构中,成功构建带组氨酸纯化标签假病毒的通用表达载体．外源基因序列插入载体后,经诱导表达与镍离子亲和层析纯化后,可获得高浓度、高纯度的假病毒,在4 ℃和-20 ℃条件下,可用SM缓冲液稳定保存1年以上．     

表达LacZ基因的重组CVI988病毒的构建及特性研究

马立克氏病（MD）是一种鸡的淋巴增生性肿瘤疾病,是由马立克氏病病毒血清1型（Marek＇s disease virus serotype 1,MDV1）引起的,但是,可以由致弱的或天然不致病的疫苗株进行防制。疫苗株分为三种类型：致弱的血清1型,天然不致瘤的血清2型（MDV2）和天然不致病的火鸡疱疹病毒（HVT）。     

表达流行性感冒病毒HA基因非复制型重组腺病毒的构建及免疫效果的研究

通过RT-PCR扩增流行性感冒(流感)病毒HA基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAd Track-MV,该重组质粒与腺病毒DNA共转化E．coli BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒DNA,将其转染293细胞获得重组腺病毒。PCR证实HA基因已整合至腺病毒基因组中,Western blot结果检测到重组病毒感染293细胞中HA的表达。重组病毒经滴鼻和灌胃两种途径免疫小鼠,结果2次免疫后滴鼻组和灌胃组均产生明显的免疫应答,血清IgG抗体滴度分别为1：10000和1：1000。除血清IgG外,还在肺灌洗液中检测到分泌型IgA。滴鼻组的免疫效果强于灌胃组。经小剂量攻毒实验显示,重组腺病毒保护率为100％。该文成功构建了表达流感病毒HA基因的非复制型重组腺病毒,重组病毒免疫小鼠可产生较好的免疫效果。     

适用于疫苗株筛选的痘苗病毒载体的构建

为构建适用于疫苗株筛选的痘苗病毒载体,利用标记瞬时稳定的原理,在痘苗病毒单选择标记载体psc65的基础上,构建成带有neo和LacZ双选择标记的痘苗病毒载体pVI75.为检验载体pVI75的有效性,将HIV-1合成基因syngpnef插入到载体pVI75上,构建成转移质粒pVI75-syngpnef,并与天坛株752-1痘苗病毒共转染CEF细胞.筛选得到的重组病毒经PCR和Dot blot检验表明,标记基因已被删除,而目的基因被整合到痘苗病毒基因组上.Westem blot检测结果表明,目的基因的表达正确.痘苗病毒载体pVI75的构建使得疫苗株筛选的工作量大为降低,时间大大缩短,为利用痘苗病毒载体构建重组病毒疫苗株的研究提供了参考.     

表达猴免疫缺陷病毒Env蛋白的重组鸡痘病毒的构建和筛选

目的:构建并筛选表达猴免疫缺陷病毒(SIV)Env蛋白的重组鸡痘病毒(FPV),并对其进行鉴定。方法:设计引物,通过PCR技术扩增SIV env基因,将其连接到pMD18-T载体上,测序正确后将其克隆入本实验室自行构建的FPV穿梭载体pTKET中,获得重组质粒pTKET-SIV env,然后将其与FPV282E4株共转染原代鸡胚成纤维细胞进行同源重组,以增强型绿色荧光蛋白为筛选标记,通过噬斑筛选获得重组病毒,应用PCR、RT-PCR、Western印迹对重组病毒进行鉴定和遗传稳定性分析。结果:通过10次噬斑筛选,PCR检测表明目的基因已整合到重组FPV基因组中,RT-PCR、Western印迹结果表明SIV Env蛋白在感染细胞内表达且具有抗原性;连续传代20次,PCR、RT-PCR、Western印迹均能检测到外源基因的整合、转录和表达,且未能扩增出FPV-TK基因,表明重组病毒遗传稳定性良好,且病毒已经纯化。结论:获得表达SIV Env蛋白的重组FPV,为进一步免疫试验研究奠定了基础。