骨桥蛋白RGD黏附序列多拷贝短肽的表达、纯化及生物学活性测定

目的:用大肠杆菌表达骨桥蛋白RGD黏附序列6拷贝短肽,经分离纯化后检测其生物学活性.方法:运用基因重组技术,将骨桥蛋白RGD黏附序列的核酸片段首尾相连,与携带GST编码序列的原核表达载体连接构建融合蛋白表达质粒pGEX-3X-RGD.将重组质粒转化宿主菌后,对诱导融合蛋白表达的条件进行优化.表达产物GST-RGD经谷胱甘肽-亲和层析纯化后,分别检测其对骨桥蛋白诱导的血管平滑肌细胞黏附和迁移的影响.结果:所构建的含有6个拷贝短肽的GST-RGD融合蛋白可在大肠杆菌中以包含体的形式进行表达.用十二烷基肌氨酸钠变性溶解包含体及透析复性后,经亲和层析可得到高纯度的GST-RGD(6)融合蛋白.GST-RGD(6)融合蛋白能特异性的抑制骨桥蛋白诱导的血管平滑肌细胞的黏附和迁移.结论:骨桥蛋白RGD黏附序列6拷贝短肽可在大肠杆菌中高效表达,纯化的GST-RGD融合蛋白具有抑制血管平滑肌细胞黏附和迁移的活性.     

包含体内重组蛋白质的复性

具有临床、工业生产、药用功能的真核生物蛋白质的供给常常受到其天然来源的限制。可喜的是基因工程技术的发展使许多真核生物蛋白质能在细菌细胞中进行表达[1] 。大肠杆菌由于培养和基因操作容易而成为最受欢迎的表达系统 ,但是重组蛋白质在大肠杆菌中的高水平表达常常导致以包含体形式存在的胞內聚集的变性蛋白质的形成。这种变性蛋白质的量可高达总的重组蛋白质量的95%。由于以包含体形式存在的聚集蛋白质分子不具有正确的三维结构 (天然结构 ) ,它们在水溶液中通常不溶解且没有活性 ,因此大肠杆菌中包含体的形成就意味着可溶性重组蛋白…     

包含体的体外复性研究进展

在大肠杆菌中大量表达的重组蛋白质常常形成无活性的、不溶性的包含体。包含体经过液固分离、洗涤、变性溶解后,经过一个合理的复性过程可重新折叠成有活性的蛋白质。本文概述了常用的包含体复性方法,并对近年来出现的色谱复性法和应用一些低分子量添加剂等来提高蛋白质复性的产率做了简述。     

从大肠杆菌包含体中提取有活性的人溶菌酶的研究

在医药和工来上,许多非常有应用前景的真核多肽,往往由于它们天我来源缺乏,不能充分提供产品,限制了它们的应用范围。通过基因克隆技术使基在大肠杆菌中表达,这就能为这些蛋白质提供丰富的来源。然而,在细菌中表达的重组蛋白擀在细胞内常以下溶性的没有生物活性的包含体形式累积,从这些包含体中恢复重组蛋白质的生物活性成为DNA重组技术广泛应用的一个重大课题。     

提高大肠杆菌分泌表达重组蛋白的研究进展

大肠杆菌是表达重组蛋白的常见宿主之一。重组蛋白分泌到周质空间或胞外培养基中较之在胞内以包含体形式表达有许多优势。主要讨论大肠杆菌Ⅰ、Ⅱ型分泌机制,并总结近年来在提高重组蛋白分泌表达的策略方面取得的进展。     

大肠杆菌表达的重组hIL-4的分离纯化

对大肠杆菌表达的重组人白细胞介素 4进行了分离纯化。人 IL- 4基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包含体形式存在 ,经过超声破菌、包含体抽提、洗涤处理 ,可使包含体纯度达 70 %以上 ,用 6mol/L盐酸胍变性溶解包含体沉淀后上清直接稀释复性 ,再经浓缩、透析、离子交换色谱一系列纯化步骤终产物纯度达 95 %以上 ,回收率 1 0 %以上 ,比活性达 2 .5× 1 0 6U/mg     

包含体的体外复性策略

外源基因在大肠杆菌中高水平表达时,通常会形成不溶性、无活性的蛋白聚集体即包含体。包含体富含表达的重组蛋白,经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠,才能够得到生物活性蛋白。近年来,发展了许多特异的策略和方法来从包含体中复性重组蛋白。介绍稀释法、透析及分子排阻、固定化金属离子亲和层析、疏水层析复性等策略和进展;物理化学因素、前导肽协助蛋白折叠;人工分子伴侣辅助蛋白折叠及反胶束、多聚物用于蛋白复性。     

外源蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的新策略

大肠杆菌是最常用的遗传工程宿主 ,但是 ,外源蛋白在大肠杆菌中表达 ,往往形成包含体。包含体的形成 ,在一定程度上限制了原核载体 宿主系统的应用 ,为了克服包含体的形成 ,目前常用的策略是分子伴侣 (如ＧｒｏＥＬ ＥＳ、ＤｎａＫ)、折叠酶系 (如ＤｓｂＡＢＣ、ＰＰＩ)、“分子内伴侣”(如Ｔｈｒｘ、ＧＳＴ、ＳＰＡ等 )甚至一些短肽的共表达或融合表达 ,上述策略虽然可以减少甚至完全避免包含体的形成 ,但都存在一定的缺点 ,如分子伴侣的作用存在明显的蛋白特异性 ,对不同蛋白辅助折叠效率不一样 ,对有的蛋白 ,甚至根本就不起作用 ,表现出…     

相容性溶质支持下重组免疫毒素的周质腔可溶表达及葡萄糖对其表达的影响

在基因工程的实践中,包含体的形成是人们利用大肠杆菌表达外源蛋白的一大难题。本文报道了利用山梨醇、甜菜碱等相容性溶质,在高盐胁迫下,实现了重组免疫毒素在大肠杆菌周质腔中的可溶性表达。同时发现葡萄糖的加入时机对重组免疫毒素的表达量有重要的影响。     

α－天冬氨酰二肽酶基因的高表达和产物回收

建了α－天冬氨酰二肽酶基因(pepE)与载体pBV220连接的高表达重组质粒(pBVPEP,4337bp)。转化大肠杆菌后,目的基因表达为两种形式的产物,即细胞质中可溶性蛋白(～75％)和包含体蛋白,共占细菌总蛋白的30％左右。SDS－PAGE分析温敏诱导的表达蛋白,可以观察到约27kDa的高表达蛋白条带,与提纯的酶带一致。用不同于以往的萃取包含体蛋白的方法,回收了包含体中95％以上的表达蛋白。     

视黄酸促进限定性内胚层细胞向胰腺前体细胞分化

研究视黄酸（RA）在限定性内胚层细胞向胰腺前体细胞诱导过程中的最佳作用方式。在无饲养层培养体系下联合多因子分阶段诱导经历10天时间获得胰腺前体细胞。获得的细胞不仅表达胰腺前体细胞的标记pdx1,但是也同时表达肝脏前体细胞的标记afp。有研究表明在胰腺特化过程中RA能起到抑制afp的作用,因此在不同的时间点添加RA并持续不同的作用时间来调节内胚层细胞向肝胰分化的命运。收集d7到d10的细胞用免疫组化和RT—PCR检测pdx1和afp的表达情况。结果显示RA从d3开始持续作用到d10可以获得更高的pdx1阳性细胞同时能有效的抑制afp的表达,并且在d9可以获得最高比率的pdxl阳性细胞,提示RA持续作用促进限定性内胚层细胞向胰腺前体细胞分化。     

蛋白质复性研究进展

许多蛋白在大肠杆菌中高效表达时,其产物常以无活性的包含体形式存在,包含体蛋白的复性往往是制备这些蛋白的关键步骤之一,蛋白复性包括肽链折叠和分子内二硫键的氧化这两个互相影响的过程,本文综述了蛋白折叠过程的研究进展,及促进蛋白折叠和二硫键氧化的方法。     

玉米叶绿体偶联因子ε亚基基因在E.coli中的表达

玉米叶绿体偶联因子ε亚基基因（ａｔｐＥ）被克隆到载体ｐＪＬＡ５０５和ｐＷＡ的多聚接头处,形成重组质粒ｐＪＬＡ５０５－ａｔｐＥ和ｐＷＡ－ａｔｐＥ,转化Ｅ．ｃｏｌｉ,并进行温敏诱导表达研究。在大肠杆菌中温敏诱导的基因表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定,表达量达全菌蛋白质的３０％以上．Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析结果表明温敏诱导的表达产物可特异性地与ε亚基抗体反应,在免疫双扩散中也观察到沉淀线。大肠杆菌表达的玉米叶绿体ａｔｐＥ基因产物以包含体形式存在于细菌中。经对包含体处理后;获得的粗产物可达８０％以上纯度,并具有天然ε亚基蛋白质的生物功能．     

α－天冬氨酰二肽酶基因的高表达和产物回收

构建了α天冬氨酰二肽酶基因（ｐｅｐＥ）与载体ｐＢＶ２２０连接的高表达重组质粒（ｐＢＶＰＥＰ,４３３７ｂｐ）。转化大肠杆菌后,目的基因表达为两种形式的产物,即细胞质中可溶性蛋白（～７５％）和包含体蛋白,共占细菌总蛋白的３０％左右。ＳＤＳＰＡＧＥ分析温敏诱导的表达蛋白,可以观察到约２７ｋＤａ的高表达蛋白条带,与提纯的酶带一致。用不同于以往的萃取包含体蛋白的方法,回收了包含体中９５％以上的表达蛋白。     

水稻花药绒毡层特异表达基因RA39的克隆与表达特性分析

利用cDNA减法杂交,差异杂交筛选和RACE等技术。从水稻（Orza sativaL.ssp.japonica)中克隆了一个新的绒毡层特异性cDNA,其编码基因被命名为RA39。该cDNA长1013bp。编码由298个氨基酸残基组成的多肽RA39是一个单拷贝基因。在绒毡层细胞中特异性表达。在小孢子母细胞减数分裂期的绒毡层细胞中有较高的表达活性。用PSORT和PPSEARCH软件进行的结构分析揭示出RA39蛋白的N端是一个由17个氨基酸残基组成的信号肽,该蛋白包含一个跨膜区和一个胞质尾区两个主要结构域以及多个蛋白激酶的磷酸化位点。     

蓝细菌Synechococcus sp.PCC7002petH基因的高效表达及其产物的纯化

铁氧还原白－ＮＡＤＰ＾＋氧还酶（ＦＮＲ）是光合电子传递中的关键酶之一。蓝细菌Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ７００２中编码ＦＮＲ的ｐｅｔＨ基因被克隆到表达载体ｐＥＴ－３ｄ上,在大肠杆菌中得到了高效表达,其表达量占大肠杆菌总蛋白的５０５％以上。高效表达的产物以可溶性和包含体两种形式存在。可溶性部分具有ＦＮＲ的酶活性,在经过离子交换和凝胶层析后产生了电泳纯的ＦＮＲ。包含体形式的部分经６．７ｍｏ     

蛋白质聚集的形成与调控机制

大肠杆菌是外源蛋白质的首选表达系统,但蛋白质易被宿主细胞蛋白酶降解或聚集形成包含体。包含体与淀粉样蛋白纤维的形成过程相似,都依赖于特异性氨基酸序列的分子间相互作用。因此,淀粉样蛋白质抗聚集的方法也可用于防止细菌表达蛋白质的聚集。另外,基于序列的新型方法也能调节蛋白质聚集。     

水稻花药绒毡层特异表达基因RA39的克隆与表达特性分析

利用cDNA减法杂交、差异杂交筛选和RACE等技术,从水稻(Oryza sativa L. ssp. japonica)中克隆了一个新的绒毡层特异性cDNA,其编码基因被命名为RA39.该cDNA长1 013 bp, 编码由298个氨基酸残基组成的多肽.RA39是一个单拷贝基因,在绒毡层细胞中特异性表达,在小孢子母细胞减数分裂期的绒毡层细胞中有较高的表达活性.用PSORT和PPSEARCH软件进行的结构分析揭示出RA39蛋白的N端是一个由17个氨基酸残基组成的信号肽,该蛋白包含一个跨膜区和一个胞质尾区两个主要结构域以及多个蛋白激酶的磷酸化位点.     

尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶A2泊表达及其生化特征

将尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶Ａ２Ｉ（Ａ．ａＡＰＬＡ２Ｉ）的基因克隆至表达载体ｐＢＬＭＶＬ２,在大肠杆菌ＲＲ１中成功表达,表达产物Ａ．ａＡＰＬＡ２Ｉ约占细菌蛋白质总量的３０％,以包含体的形式存在。纯化包含体后,将产物变性,复性,然后用ＦＰＬＣ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＾ＴＭ１２纯化,产物经过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测只有单一条带。     

尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶A_2I的表达及其生化特征

将尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶 Ａ２ Ｉ（ Ａ．ａ Ａ Ｐ Ｌ Ａ２ Ｉ） 的基因克隆至表达载体ｐ Ｂ Ｌ Ｍ Ｖ Ｌ２ , 在大肠杆菌 Ｒ Ｒ１ 中成功表达。表达产物 Ａ．ａ Ａ Ｐ Ｌ Ａ２ Ｉ约占细菌蛋白质总量的３０ ％ , 以包含体的形式存在。纯化包含体后, 将产物变性、复性, 然后用 Ｆ Ｐ Ｌ Ｃ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ Ｔ Ｍ１２ 纯化, 产物经过 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 检测只有单一条带。对表达的 Ａ．ａ Ａ Ｐ Ｌ Ａ２ Ｉ进行了酶活性、抑制血小板聚集活性和溶血活性的测定。结果显示, 表达的 Ａ．ａ Ａ Ｐ Ｌ Ａ２ Ｉ的酶活性同变性后复性江浙蝮蛇酸性磷脂酶 Ａ２（ Ａ Ｐ Ｌ Ａ２） 的酶活性相近, 既具有抑制血小板聚集活性也具有溶血活性。最后对磷脂酶 Ａ２（ Ｐ Ｌ Ａ２） 的结构与这些活性的关系进行了讨论