去卵巢大鼠血浆组织型纤溶酶原激活物（t—PA）与其抑制物 …

目的：了解性激素对血栓形成的影响,方法：用发色底物方法测定去卵巢大白鼠及对照组血浆组织型纤溶酶原激活物（ｔ－ＰＡ）与其抑制物（ＰＡｌ）活性,结果：去卵巢组大白鼠血浆ｔ－ＰＡ与对照组比较无显著性差异（Ｐ〉０．０５）。而去卵巢组大白鼠血浆ＰＡＩ比对照组明显降低,两组比较有显著性差异（Ｐ〈０．０５）,结论：去卵巢组血浆中ＰＡＩ降低,可能与卵巢激素的减少有关。卵巢激素会促使 ＰＡＩ合成释放增加,这可能是服     

纤溶酶原激活物抑制因子—1蛋白分子的结构与功能

纤溶酶原激活物抑制因子－１（ＰＡＩ－１）是组织型纤溶酶原激活物（ｔ－ＰＡ）和尿型纤溶酶原激活物（ｕ－ＰＡ）的特异性抑制剂。对ＰＡＩ－１分子的结构与功能的认识,有助于了解ＰＡＩ－１作用的机理。本综述了近年来对ＰＡＩ－１蛋白分子结构与功能研究的进展,介绍了ＰＡＩ－１分子中一些区域的作用以及影响ＰＡＩ－１抑制活性的一些因子。     

蚯蚓体内一种纤溶酶原激活剂(e-PA)对ATEE的降解

赤子爱胜蚓（Ｅｉｓｅｎｉａｆｅｔｉｄａ）体内的一种纤溶酶原激活剂（ｅ－ＰＡ）能够降解人工合成底物Ｎ－乙酰－Ｌ－酪氨酸乙酯（ＡＴＥＥ）,该降解反应的最适ｐＨ为８．５,而且在０．２ｍｏｌ／ＬＮａ２ＨＰＯ４中的活性要强于在０．０５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中．分别测定了ｅ－ＰＡ的大小亚基及全酶在０．２ｍｏｌ／ＬＮａ２ＨＰＯ４与０．０５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）两种体系中的Ｋｍ和Ｋｃａｔ．结果表明,在０．２ｍｏｌ／ＬＮａ２ＨＰＯ４中,全酶的ＡＴＥＥ活性远远高于大小亚基单独的ＡＴＥＥ活性,而在０．０５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中则没有这种现象．从蛋白质结构的角度对这一结果作了解释．用不同抑制剂和ｅ－ＰＡ作用,结果表明,ｐｅｐｓｔａｔｉｎ,Ｅ－６４和ＥＤＴＡ对ｅ－ＰＡ的ＡＴＥＥ活性都有不同程度的抑制,这一点与ｅ－ＰＡ的ＢＡＥＥ活性不同．     

人胎肺细胞的条件化培养液中两种类型纤溶酶原活化物的分离

用正常人胎肺细胞体外培养,从其培养液中分离纤溶酶原活化物（ＰＡ）,通过ＣＭ－ＳｅｐｈａｄｅｘＣ－５０层析,硫酸铵沉淀和Ｆｉｂｒｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ,Ｌｙｓｉｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析及ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０凝胶过滤等步骤,从１０．５ｌ条件培养液中分离纯化得到两种类型的纤溶酶原活化物,ｔ－ＰＡ９０μｇ,ｕ－ＰＡ８００μｇ．在还原条件下ＳＤＳ－ＰＡＧＥ均显示单带,分子量ｔ－ＰＡ为７２ｋＤ,ｕ－ＰＡ为５４ｋＤ,纤溶比活分别为１５６０００ＩＵ／ｍｇ蛋白和１０６０００ＩＵ／ｍｇ蛋白．     

蚯蚓体内一种纤溶酶原激活剂(e-PA)的部分性质研究

从赤子爱胜蚓（Ｅｉｓｅｎｉａｆａｅｔｉｄａ）中纯化出的一种纤溶酶原激活剂（ｅ－ＰＡ）在纤维蛋白平板上可表现出三种活性,分别记为：ＣＦＰｇ,ｕＣＦＰｇ和ｕＣＦ．为更好了解各种活性与ｅ－ＰＡ的纤溶能力的关系,考察了在ＳＤＳ和不同抑制剂存在下各种活性的变化．结果表明,ＳＤＳ可以增强ＣＦＰｇ活性且使得ｅ－ＰＡ变得对一些抑制剂更敏感;ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ,ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ,ｐｅｐｓｔａｔｉｎ,ａｐｒｏ－ｔｉｎｉｎ,ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）和ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）对ｕＣＦ没有影响;ｐｅｐ－ｓｔａｔｉｎ能增强ＣＦＰｇ和ｕＣＦＰｇ活性,Ｅ－６４（一种巯基抑制剂）能增强ｕＣＦＰｇ和ｕＣＦ活性．这些现象说明不能简单将ｅ－ＰＡ归结为丝氨酸蛋白酶或巯基蛋白酶．此外又以纤溶酶原为底物,分析了ｅ－ＰＡ在体外降解天然蛋白质的肽键特异性,结果表明：ｅ－ＰＡ可以切割碱性氨基酸,小的中性氨基酸及Ｍｅｔ的羧基端,同时ｅ－ＰＡ确能将纤溶酶原切割为纤溶酶;这一结论为ｅ－ＰＡ有可能成为新型溶栓药物提供了生化基础．     

纤溶酶原激活物抑制因子—1突变体E350G,E351K的构建及性质研究

利用ＰＣＲ扩增和合成突变引物的方法,将ＰＡＩ－１的Ｇｌｕ３５０和Ｇｌｕ３５１分别突变为Ｇｌｙ和Ｌｙｓ在大肠杆菌中表达并分离纯化突变体ＰＡＩ－１（Ｅ３５０Ｇ,Ｅ３５１Ｋ）有 酸胍激活并以ＥＬＩＳＡ法确定它与野生型ｒＰＡＩ－１的相对含量,通过对ｕ－ＰＡ抑制的动力学研究表明,突变体与野生型ｒＰＡＩ－１相比,对ｕ－ＰＡ和ｔ－ＰＡ的抑制活性都有明显下降,由活性态向潜伏态转变的半寿期也由０．８３ｈ缩短为０．５     

t—PA cDNA基因转移与基因治疗

组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）能够特异、高效地溶解血栓,在纤溶系统中起着重要作用,ｔ－ＰＡ与其抑制物（ＰＡＩ）平衡失调,可导致多种疾病的发生。基因转移技术使外源ｔ－ＰＡ ｃＤＮＡ成功地在血管内皮细胞中得以表达,为防治以血栓形成为主要病理变化的血管性疾病开辟了广阔的前景。     

蝮蛇抗栓酶对不稳定性心绞痛患者血中部分凝血及纤溶指标的影响

测定３８例不稳定性心绞痛（ＵＡＰ）患者血中纤维蛋白原（Ｆｇ）含量、组织型纤溶酶原激活物（ｔ－ＰＡ）活性、血管性假血友病因子（ｖＷＦ）活性和血小板聚集率水平（ＰＡｇＴ）并与２１名正常人对比。患者中１８例用蝮蛇抗栓酶治疗,２０例行常规治疗。结果显示：ＵＡＰ患者血中ＰＡＩ－１、ｖＷＦ以及ＰＡｇＴ水平明显增高,ｔ－ＰＡ水平明显降低;蝮蛇抗栓酶组治疗后血中Ｆｇ、ＰＡＩ－１、ＰＡｇＴ水平均明显下降,使ｔ－ＰＡ水平明显升高;常规治疗组治疗前后各项指标无明显变化。认为蝮蛇抗栓酶对ＵＡＰ有可靠疗效     

人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)在Pichia pastoris中的表达

用ＰＣＲ方法从ｐＰＡＩＪ．７中扩增人纤溶酶原激活剂抑制物２型（ＰＡＩ－２）基因,与ｐＰＵＣ１８重组,经限制性内切酶片段分析与核苷酸序列分析,获得全长人ＰＡＩ－２基因．ＰＡＩ－２基因与表达载体ｐＰＩＣ９重组,构建受乙醇氧化酶１基因（ＡＯＸ１）启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,转化ＧＳ１１５宿主菌,经表型筛选和ＰＣＲ扩增筛选阳性克隆,用甲醇诱导表达,重组ＰＡＩ－２以分泌型表达,占分泌总蛋白的３０％,具ＰＡＩ－２抗原性,与低分子量尿激酶形成了抗ＳＤＳ复合物,具抑制纤溶的活性（９１．４ＡＩＵ／ｍｌ）．对培养条件也进行了探讨．     

人组织型纤溶酶原激活剂（t－PA）突变体FrGGI的构建、表达及特性分析

为了获得半衰期延长,特异活性提高及具有ＰＡＬ－１抗性的新型ｔ－ＰＡ溶栓剂,利用基因重组及定位突变技术构建了ｔ－ＰＡ的Ｋ１、Ｋ２区糖基化位点消除,ＰＡＩ－１结合位点缺失,Ｆ与Ｅ区连接序列Ｈｉｓ４４～Ｓｅｒ５０置换为纤粘蛋白Ⅰ型Ｆ区间连接序列ＧｌｕＳｅｒＬｙｓＰｒｏＧｌｕＡｌａＧｌｕＧｌｕ的ｔ－ＰＡ组合突变体ＦｒＧＧＩ,并在中国仓鼠卵巢细胞中获得了高效表达。对表达产物的生物学特性分析表明,ＦｒＧＧＩ在大鼠血浆中的半衰期延长了１５倍,并获得了ＰＡＩ－１抗性,是一株很有希望的新型溶栓剂候选株。     

组织型纤溶酶原激活剂A链与尿激酶原B链嵌合分子的构建与表达

利用 Ｄ Ｎ Ａ 重组技术和定位删除技术,将组织型纤溶酶原激活剂（ｔ Ｐ Ａ）的 Ａ 链（ Ｓｅｒｌ Ｔｈｒ２６３）基因与尿激酶原（ｐｒｏ Ｕ Ｋ）的 Ｂ链（ Ｓｅｒ１３８ Ｌｅｕ４１１）基因相连,得到嵌合分子基因ｔｕ ｐａ,并在昆虫杆状病毒系统中进行表达,表达量可达 ５００ Ｉ Ｕ／ｍ ｌ．经单克隆抗体免疫亲和层析纯化细胞表达上清液,得到ｔｕ Ｐ Ａ 嵌合分子,其比活为 ２００ ０００ Ｉ Ｕ／ｍ ｇ 蛋白． Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 及 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 鉴定证明此表达产物分子量约为 ６０ ｋ Ｄ,与预期值相符．纤维蛋白平板测活及纤维蛋白亲和性分析初步证明,此嵌合分子的溶纤活性与ｐｒｏ Ｕ Ｋ 相近,而纤维蛋白亲和性高于 ｐｒｏ Ｕ Ｋ．     

纤溶酶原激活剂抑制物2型抑制细胞凋亡的研究进展

纤溶酶原激活剂抑制物２型（ＰＡＩ－２）是一种多功能蛋白质,除了能有效抑制尿激酶（ｕＰＡ）和双链组织型纤溶酶原激活物（ｔＰＡ）而调节纤溶活性外,还参与了很多其它的生理病理过程,例如组织重建、胚胎发育、感染、免疫系统发育、肿瘤浸润和迁移等。更有研究表明胞内型ＰＡＩ－２在抑制细胞凋亡方面也发挥着重要作用。本文就近年来ＰＡＩ－２抑制细胞凋亡的研究进展作一综述。     

蚯蚓体内一种纤溶酶原激活剂(e-PA)对BAEE的降解

以苯甲酰－Ｌ－精氨酸乙酯（ｂｅｎｚｏｙｌ－Ｌ－ａｒｇｉｎｉｎｅｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ,ＢＡＥＥ）为底物,研究了蚯蚓体内纤溶酶原激活剂（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒｆｒｏｍＥｉｓｅｎｉａｆｅｔｉｄａ,ｅ－ＰＡ）的酶学性质．酶促反应的最适ｐＨ为８．４,ｅ－ＰＡ降解ＢＡＥＥ的Ｋｍ为１．２４±０．１６×１０－５ｍｏｌ／Ｌ,Ｋｃａｔ为１３．８０±４．０２ｓ－１．测定了构成ｅ－ＰＡ的大,小亚基分别降解ＢＡＥＥ的Ｋｍ和Ｋｃａｔ．结果表明,大亚基的Ｋｍ与全酶的Ｋｍ相差不多,但比小亚基小约１０倍,即对底物的亲和力比小亚基强约一个数量级．大小亚基的Ｋｃａｔ比较接近,分别是全酶的１／６和１／３．研究了８种抑制剂对ｅ－ＰＡ降解ＢＡＥＥ活性的影响,其中ｐｅｐｓｔａｔｉｎ和Ｅ－６４（一种巯基抑制剂）对酶促反应有激活作用,ＴＰＣＫ,ＴＬ－ＣＫ,ＰＭＳＦ,ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ和ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ对其有不同程度的抑制作用,ＥＤＴＡ对ｅ－ＰＡ的活性没有影响．对ｅ－ＰＡ的ＢＡＥＥ活性和ｅ－ＰＡ的纤溶活性之间作了比较．     

人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)在大肠杆菌中的表达和分离纯化

用ＰＣＲ方法从ｐＰＡＩＪ．７中扩增人纤溶酶原激活剂抑制物２型（ＰＡＩ－２）ｃＤＮＡ,与ｐＵＣ１８重组,经限制性内切酶片段分析与核苷酸序列分析,获得全长人ＰＡＩ－２ｃＤＮＡ．ＰＡＩ－２ｃＤＮＡ与原核表达载体重组,构建原核表达质粒并转化大肠杆菌．经温度诱导表达,重组ＰＡＩ－２占全菌总蛋白的１４％,以可溶性形式存在,具纤溶抑制活性．工程菌发酵、压榨后,用硫酸铵分级沉淀,沉淀物经分子筛、离子交换和疏水性色谱的分离,每升菌液可获得约３０ｍｇ纯度达９０％的蛋白质,比活性为１１８６６ＡＩＵ／ｍｇ蛋白质,得率为１９．２％．     

平原入进驻高原后凝血和纤溶功能的改变及其意义

目的：探讨高原低氧环境下凝血及纤溶功能的变化。方法：对从平原（海拔1400m）进驻3700m和5380m高原第7d及半年的40名健康青年血浆抗凝血酶Ⅲ（AT－M）、纤溶酶原含量（PLG）、D－二聚体含量（DD）、组织纤溶酶原激活物活性（t-PA）、纤溶酶原激活抑制物活性（PAI）、纤溶蛋白原（Fg）、α2－抗纤溶酶抑制物活性（α2－PI）进行检测,并与20名平原健康青年作对照。结果：高原低氧环境AT－Ⅲ、t-PA明显低于平原（P＜0.05或P＜0.01）,且随海拔高度的升高而降低（P＜0.01）,随居住时间的延长而升高（P＜0.05或P＜0.01）。PLG、DD、PAI、α2－PI及Fg在海拔3700m第7d和海拔5380m第7d及半年均较平原增高显著（（P＜0.05或P＜0.01）,且随海拔高度的升高而增高,居住时间的延长而降低（P＜0.05或P＜0.01）;3700m居住半年时较平原无显著性差异（P＞0.05）。结论：高原低氧存在凝血功能紊乱,表现为凝血与纤溶被激活的同时伴有纤溶受抑,凝血及纤溶的平衡被破坏而使血液呈高凝和低纤溶状态。     

三七皂苷Rg1对tPA和PAI-1活性的调节作用

探讨三七皂苷Rg1对组织型纤溶酶原激活物(tPA)和纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)活性的调节作用。运用发色底物方法测定三七皂苷Rg1在体外和静脉注射对家兔血浆纤溶酶原激活物(tPA)和血浆或血小板释放的纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)水平的影响。结果表明,三七皂苷Rg1在体外呈浓度依赖性明显抑制血浆PAI-1活性,同时提高血浆tPA活性;30和60 mg/kg的三七皂苷Rg1静脉注射显著抑制血浆PAI-1活性,提高血浆tPA活性,同时降低凝血酶激活的血小板所释放的PAI-1水平。本实验提示三七皂苷Rg1能抑制PAI-1活性,同时升高tPA活性可能是其抗血栓作用的分子机制之一。     

重组组织型纤溶酶原激活剂大规模纯化及部分性质的研究

收集产重组组织型纤溶酶原激活剂（ｒｔ－ＰＡ）的ＣＨＯ工程细胞灌流培养上清,经过Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ扩张柱床和赖氨酸－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ柱亲和吸附色谱纯化后,最后产品的比性达到６０００００ＩＵ／ｍｇ蛋白,ｒｔ－ＰＡ总活性回收率在９８％左右,经还原ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析主要为高相对分了质量ｒｔ－ＰＡ蛋白,ＨＰＬＣ分析达到色谱纯,Ｎ端１５个氨基酸序列和ｐＩ与献报道的一致。蛋白质印迹实验证实具有ｔ－Ｐ     

人组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）突变体FrGGI的构建,表达及特性…

为了获得半衰期延长,特异活性提高及具有ＰＡＩ－１抗性的新型ｔ－ＰＡ溶性剂,利用基因重组及定位突变技术构建了ｔ－ＰＡ的Ｋ１、Ｋ２区糖基化位点消除,ＰＡＩ－１结合位点缺失,Ｆ与Ｅ区连接序列Ｈｉｓ４４￣Ｓｅｒ５０置换为纤粘蛋白Ｉ型Ｆ区间连接序列Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｕ的ｔ－ＰＡ组合突变体ＦｒＧＧＩ,并在中国仓鼠卵巢细胞中获得了高效表达,对表达产物的生物学特性分析表明     

凝血酶激活的单链尿激酶型纤溶酶原激活剂的构建、表达、纯化和性质研究

用Ｋｕｎｋｅｌ突变法,将单链尿激酶型纤溶酶原激活剂（ｓｃｕ－ＰＡ）ｃＤＮＡ基因中编码Ｐｒｏ１５５—Ｌｙｓ１５８的片段定点突变,并将此突变的ｓｃｕ－ＰＡ（ｔｓｃｕ－ＰＡ）的ｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＣＭ－β－ｎｅｏ中,与ｐＣＭ－ｄｈｆｒ共转染ＣＨＯ／ＤＨＦＲ－细胞．获得的稳定表达株在无血清培养基中２４ｈ的表达量为６２０ＩＵ／１０６细胞．经锌离子螯合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析得到ｔｓｃｕ－ＰＡ纯品．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示ｔｓｃｕ－ＰＡ分子量为５３ｋＤ左右,与预期的结果相符．ｔｓｃｕ－ＰＡ是由凝血酶激活而不是由纤溶酶激活,但激活后也能转变为双链分子（ｔｃｕ－ＰＡ）．ｔｓｃｕ－ＰＡ仍保持了ｓｃｕ－ＰＡ的血纤维蛋白亲和性．酶动力学研究表明,激活后的ｔｓｃｕ－ＰＡ水解Ｓ２４４４的Ｋｍ和Ｋｃａｔ值与高分子量尿激酶（ＨＵＫ）相似．体外溶栓实验结果表明,ｔｓｃｕ－ＰＡ可以选择性地溶解富含凝血酶的血凝块,对贫凝血酶的血凝块作用不大     

蚯蚓体内一种纤溶酶原激活剂(e-PA)的分离纯化

为获得一种高效,低廉的溶栓药物,从赤子爱胜蚓（Ｅｉｓｅｎｉａｆａｅｔｉｄａ）体内分离纯化出一种可体外激活纤溶酶原从而间接降解纤维蛋白的酶（ｅ－ＰＡ）．纯化过程包括：粗品的盐析,离子交换层析,凝胶过滤层析及疏水相互作用层析．该组份是由二个亚基通过疏水相互作用维系在一起的．通过凝胶过滤层析,可测得全酶的分子量为４５０００;ＳＤＳ电泳显示大、小亚基的分子量分别是２６０００与１８０００;而质谱法测得的大、小亚基的分子量分别为２４５５６．７与１５５４６．６．对大小亚基进行了氨基酸组成分析,结果显示大亚基不含Ｌｙｓ而小亚基不含Ｃｙｓ．测定了大亚基Ｎ端２５个氨基酸序列：ＶＩＧＧＴＮＡＳＰＧＥＩＰＷＱＬＳＱＱＲＱＳＧＳＷ．并与部分已知蛋白质序列进行了比较．ｅ－ＰＡ在纤维蛋白平板上表现有三种不同的纤溶活性