重组人载脂蛋白ApoA-I表达条件的优化

对大肠杆菌DH5α发酵培养表达人载脂蛋白ApoA-Ⅰ的发酵条件进行了优化研究.结果表明将重组质粒pBV220-ApoA-Ⅰ转化不同的大肠杆菌宿主菌,筛选得高表达水平的E.coli DH5α/pBV220-ApoA-Ⅰ表达系统,摇瓶发酵表达率为22.2%,BL21(DE3)的表达水平与其相当,而TG1的表达率只有11%.在FMG-5L发酵罐进行发酵条件优化,认为细胞生长培养的最适pH为7.0,重组ApoA-Ⅰ表达时的最适pH为7.4.分批发酵的初始糖浓度为3.0 g·L-1,且碳氮源的最佳比例为21,使重组ApoA-Ⅰ表达率达总蛋白的40%,浓度达2.86g·L-1.     

重组人载脂蛋白ApoA-Ⅰ表达条件的优化

对大肠杆菌DH5α发酵培养表达人载脂蛋白ApoA-Ⅰ的发酵条件进行了优化研究.结果表明:将重组质粒pBV220-ApoA-Ⅰ转化不同的大肠杆菌宿主菌,筛选得高表达水平的E.coli DH5α/pBV220-ApoA-Ⅰ表达系统,摇瓶发酵表达率为22.2%,BL21(DE3)的表达水平与其相当,而TG1的表达率只有11%.在FMG-5L发酵罐进行发酵条件优化,认为细胞生长培养的最适pH为7.0,重组ApoA-Ⅰ表达时的最适pH为7.4.分批发酵的初始糖浓度为3.0 g·L-1,且碳氮源的最佳比例为2:1,使重组ApoA-Ⅰ表达率达总蛋白的40%,浓度达2.86g·L-1.     

重组鼠干细胞因子的原核表达、纯化及生物活性初步分析

目的：研制重组鼠干细胞因子（rmSCF）,并检测其体外生物学活性。方法：提取BALB/c孕龄鼠总RNA,通过RT-PCR扩增mSCF的编码基因,将其克隆至原核表达载体pBV220,转化大肠杆菌DH5α,将重组菌株接种至氨苄青霉素抗性的LB培养基中,扩大培养至5L发酵罐中,42℃诱导表达,经包涵体复性、DEAE-SepharoseFF和Phenyle-SepharoseHP层析纯化,制备rmSCF。结果：构建了pBV220-mSCF原核表达载体,在大肠杆菌中表达了rmSCF,纯化后的rmSCF对类原巨核细胞白血病细胞系的UT-7细胞有明显的刺激作用,比活为1.0×106U/mg。结论：获得了纯度大于95%的rmSCF,将进一步展开其在小鼠体内的药效学研究。     

5′端非翻译区对LT-B基因表达的影响

mRNA5＇端非翻译区的不同结构可影响基因表达,为了改善编码人毒素源性大肠杆菌热敏感肠毒素B亚单位的LT-B基因的表达水平,我们把该基因置于pBV220载体的P_RP_L串联启动子下游,构建了带有不同核苷酸组成的5＇端非翻译区的重组体。这些重组体分别在大肠杆菌HB101和DH5α中表达。结果表明,起始密码前有两个连续串联SD序列的LT-B基因的表达水平低于只有单个SD序列下的表达水平,而翻译偶联可使表达改善;用不同的SD序列LT-B基因的表达水平也有所不同,用基因本身SD序列可能要比用pBV220P_L启动子下游的SD序列好;在只含单个LT-B基因SD序列的重组体中,5＇端非翻译区序列的长短对LT-B基因表达没有什么影响;重组体在HB101中的表达水平高于在DH5α中的表达水平。     

重组人粒细胞集落刺激因子发酵工艺研究

通过对大肠杆菌（E.coli）表达重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）工程菌DH5a的发酵工艺的研究,对影响工程菌生长和目标蛋白表达条件如：发酵培养基配方,pH值,诱导时间,分批补加营养物质等进行了优化。结果表明,采用优化的条件发酵后,工程菌得率达30g/L以上;目标蛋白表达量为30%以上。     

基因工程菌生产rhG-CSF发酵培养基的研究

在摇瓶中对工程菌DH5αpBV220生产rhGCSF的发酵培养基进行了研究,从几种常用的细菌培养基中筛选适合工程菌表达rhGCSF的M9培养基。利用正交试验优化出生产重组人rhGCSF的优化培养基配方,其中优化碳源含量为2%的葡萄糖,氮源为25%的酵母粉、3%的蛋白胨和01%的(NH4)2SO4以及少量的无机盐。使用优化培养基可使rhGCSF的表达量达到338%,比优化前提高了489%。     

Epstein-Barr病毒胸苷激酶在大肠杆菌表达的研究

研究重组EB病毒胸苷激酶(thymidine kinase of Epstein-Barr virus,EBVTK)在大肠杆菌中的表达,将EB病毒的tk基因与原核表达载体pBV220进行重组,构成质粒pBV220/tk,并在大肠杆菌DH5α中获得表达;采用限制性内切酶分析进行重组质粒的鉴定,SDS-PAEG电泳和Western blot反应检测蛋白的表达。结果显示成功地构建了pBV220/tk质粒,并有重组蛋白的表达,该重组蛋白可与鼻咽癌病人血清发生特异性反应。结果表明该重组蛋白可作为抗原应用于鼻咽癌病人血清TKIgA抗体的检测,为重组TK的生产,临床应用提供了实验依据。     

短双歧杆菌α-D-半乳糖苷酶基因aga1在大肠杆菌中的高效表达

短双歧杆菌（Bifidobacterium breve 203）α_D_半乳糖苷酶基因(aga1)被克隆到大肠杆菌温度诱导表达质粒pBV220中,构建重组质粒pBVaga1,转入大肠杆菌进行温度诱导表达,得到的重组酶Aga1在大肠杆菌DH5α、DH10B和BL21中的比活分别为28.08、19.44和13.85U/mg, 均高于短双歧杆菌α_D_半乳糖苷酶的比活1.76U/mg。重组质粒pBVaga1在E. coli BL21中稳定性较好。重组酶Aga1蛋白亚基分子量约67kD,最适反应温度为45℃,酶在40℃以下稳定,60℃仅剩余约5%的酶活性,70℃时酶全部失活;最适反应pH为4.0～4.4,酶在pH 3.6～6.0范围内稳定;酶对p_硝基苯酚_α_半乳糖苷的Km＝1.43mmol/L,Vmax＝35.71μmol/(L·min),对蜜二糖的Km＝261mmol/L,Vmax＝63.69μmol/(L·min);酶在蜜二糖、棉子糖水解体系中不显示转糖基活性。结果说明Aga1与已经报道的一种短双歧杆菌的α_D_半乳糖苷酶不同,是新发现的一种短双歧杆菌的α_D_半乳糖苷酶。     

5’端非翻译区对LT—B基因表达的影响

RNA 5’端非翻译区的不同结构可影响基因表达,为了改善编码人毒素源性大肠杆菌热敏感肠毒素B亚单位的LT—B基因的表达水平,我们把该基因置于pBV220载体的PRPL串联启动子下游,构建了带有不同核苷酸组成的5’端非翻译区的重组体。这些重组体分别在大肠杆菌Hblol和DH5a中表达。结果表明,起始密码前有两个连续串联SD序列的LT—B基因的表达水平低于只有单个SD序列下的表达水平,而翻译偶联可使表达改善;用不同的SD序列LT—B基因的表达水平也有所不同,用基因本身sD序列可能要比用pBV220 PL启动于下游的SD序列好;在只含单个LT－B基因SD序列的重组体中,5’端非翻译区序列的长短对LT—B基因表达没有什么影响;重组体在HB101中的表达水平高于在DH5α中的表达水平。     

高温α-淀粉酶基因突变体在大肠杆菌、毕赤酵母中的表达

对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)高温α-淀粉酶(amyE)基因进行改造获得的基因突变体(amyEM),通过PCR扩增,将此基因分别克隆至大肠杆菌表达载体pBV220和毕赤酵母表达载体pPIC9K上,并分别转化大肠杆菌DH5α和毕赤酵母GS115感受态细胞,获得重组大肠杆菌和重组毕赤酵母。通过表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE分析,证明突变α-淀粉酶(AmyEM)在大肠杆菌、毕赤酵母中获得有效表达。对重组大肠杆菌产生的α-淀粉酶的粗酶性质分析表明,此酶分子量约为55kDa。其最适反应温度为80℃~90℃,与野生型基因相比,其最适pH均为6.0,但不同的是突变体在pH 5.0~5.5时表现出较高的酶活力;在毕赤酵母细胞的表达产物可分泌至胞外。由于酵母可对蛋白进行糖基化,酶分子量增加到60kDa,最适pH也改变为5.5。此高温α-淀粉酶突变体所具有的在微酸性环境具有较高酶活力的性质,具有重要的潜在工业应用价值。     

稀有密码子对hIL-5 cDNA在大肠杆菌中表达及细菌生长影响的研究

我们通过重组PCR技术将hIL-5 cDNA中部及3′端的稀有密码子改为大肠杆菌偏性密码子,包括编码88位Gly的GGA、91～93位3个Arg的AGACGGAGA和113～114位2个Ile的(ATA)。将测序后的hIL-5片段插入pBV220,转化大肠杆菌DH5α获得重组菌株pBVhIL5-H/DH5α。经热诱导在大肠杆菌获得高效表达,表达量占菌体总蛋白的16.5％,达到国外全合成基因在大肠杆菌表达的高限水平,表达的hIL-5重组蛋白在菌体中以包含体形式     

重组大肠杆菌共表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶发酵条件优化

在摇瓶中对共表达亮氨酸脱氢酶(Leu DH)和甲酸脱氢酶(FDH)的重组大肠杆菌(E.coli)的发酵条件进行优化。首先考察基础培养基中碳、氮源种类和浓度及初始p H等因素对重组大肠杆菌生长和产酶的影响,实验结果表明甘油和酵母膏为最佳碳源和氮源,最适质量浓度均为10 g/L,培养基最适初始p H为8.0。然后对诱导条件进行优化,确定最适的诱导时机为菌体密度(OD600)达到0.6时,最适的诱导温度、诱导剂IPTG浓度和诱导时间分别为25℃、0.2 mmol/L和20 h。在优化后的培养条件下,菌体密度(OD600)可达8.6,Leu DH和FDH酶比酶活分别达1 543.3和2 572.4 U/L,是优化前的2.0和3.1倍。     

毕赤酵母表达Q8008发酵条件的优化研究

目的对表达巴斯德毕赤酵母的发酵条件进行优化,确定最佳的发酵控制条件,以获得重组textilinin-1(Q8008)最高表达量。方法通过多因素正交实验确定Q8008发酵培养的最适发酵条件。结果表达温度在22℃,pH值为7.0,加入甲醇量为5g/L时为最优发酵条件,诱导表达时间为84~108h。结论优化巴斯德毕赤酵母的发酵条件,可提高Q8008表达量,为开发抗纤溶酶止血药应用于临床具有重要意义。     

重组人白细胞介素-11工程菌的发酵条件研究

为了探讨发酵条件对大肠杆菌表达人白细胞介素-11融合蛋白的影响,利用正交实验设计,对工程菌的生长条件和人白细胞介素-11融合蛋白表达进行优化。在摇瓶中研究了培养基中的葡萄糖、蛋白胨、酵母抽提物的浓度、pH及摇床转速、装液量、接种量等。确定了工程菌生长及表达的培养基和培养条件:葡萄糖10g/L,蛋白胨20g/L,酵母抽提物10g/L,pH7.5,接种量10%,装液量10%,摇床转速220r/min及诱导时间为4~5h。然后在BiofloⅢ-5L发酵罐中以优化的发酵条件进行了3批实验,结果表明:工程菌量达到55g/L(DCW),重组人白细胞介素-11融合蛋白表达量为33%左右,为进行中试研究奠定了理论基础。     

抗克伦特罗单链抗体表达载体的构建与鉴定

为构建克伦特罗(Clenbuterol, CBL)单链抗体(scFv)表达载体, 实现其在大肠杆菌中的表达。以pCANTAB5E- CBL质粒为模板, 扩增CBL的scFv基因, 与pPICZaA载体重组, 然后以重组质粒pPICZaA-scFv为模板扩增scFv及其相连的6 个组氨酸(6×His)片段, 再与载体pBV220连接, 转化大肠杆菌DH5a, 阳性克隆质粒经酶切和PCR鉴定后进行目的片断的序列测定。重组菌经温度诱导表达重组单链抗体, 并通过SDS-PAGE和Western blotting对其鉴定。采用竞争ELISA检测重组单链抗体的抗原结合活性。结果表明重组质粒pBV220-scFv含有插入片段, 与原序列的同源性达99.8%。重组蛋白的分子量接近37 kD, 能够被抗His标签单克隆抗体特异性识别且可被游离的CBL竞争性抑制, IC50值为4.55 ng/mL。这说明我们成功构建了重组质粒pBV220-scFv并实现了其在大肠杆菌中的表达, 为进一步进行CBL免疫法快速检测奠定了一定的基础。     

γ-谷氨酰基转肽酶（GGT）基因工程菌的构建及其发酵条件的初步研究

利用PCR技术以Bacillus subtilis SYU 20016基因组DNA为模板,扩增出1.8kb编码γ-谷氨酰基转肽酶的基因ggt,将其连接到温控表达载体pBV220,得到重组载体pBV220-ggt,重组载体在大肠杆菌JM109中得到表达。SDS-PAGE分析显示融合表达产物的分子量大小为65kD,同核酸序列测定所推导的值相符。对含有ggt的基因工程菌进行表达研究表明：发酵的培养温度为30℃,pH为7.2,装液量为20mL(在250mL的锥形瓶中)的条件下42℃诱导4h后,重组菌的γ-谷氨酰基转肽酶酶活力达到6U/mL,目前报道的非基因工程菌（枯草芽孢杆菌NX-2）酶活力最高仅为3.2U/mL。     

高效表达重组人粒细胞集落刺激因子工程菌的发酵参数优化

运用正交试验对影响重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)在大肠杆菌DH5α中表达水平的因素进行了研究。结果表明,在培养阶段,培养温度是影响rhG-CSF表达的显著性因素;在诱导阶段,诱导pH是影响rhG-CSF表达的显著性因素。将实验得到的优化参数运用到NBS MPP-40发酵罐进行工程菌株的发酵培养,结果表明rhG-CSF表达量可占细菌总蛋白量的25.83％。     

毕赤酵母表达巴曲酶发酵条件的优化研究

目的对表达重组巴曲酶的巴斯德毕赤酵母的发酵条件进行优化,确定最佳的发酵控制条件以获得重组巴曲酶的最高表达量。方法通过多因素正交实验确定巴曲酶发酵培养的最适培养条件。结果表达温度在25℃,pH值为7．0,加入甲醇的量为10g／L时为最优发酵条件,诱导表达时间为84-96h。结论重组巴曲酶可以开发为止血药,代替临床应用的从蛇毒中提取的巴曲酶。     

肿瘤坏死因子相关凋亡受体(TRAIL)cDNA的克隆及高效表达

为了得到人TRAILcDNA并克隆到pGEM-Tvector。利用PCR技术获得目的基因片段 ,通过原核表载体pBV220构建人TRAIL表达质粒。将所得表达质粒转化宿主菌DH5α ,培养至OD60 0 值到达 0 6时 42℃诱导表达 ,并通过SDS PAGE分析表达结果。经凝胶薄层扫描 ,对pBV TRAILD DH5α工程菌热诱导 5h ,TRAIL衍生物蛋白的表达量最高约占菌体可溶性总蛋白的 31 %。人TRAIL基因 ,通过pBV2 2 0原核表达载体可在大肠杆菌中获得高效表达。     

过量表达自身hemA基因的重组大肠杆菌发酵生产5-氨基乙酰丙酸的研究

研究了优化重组大肠杆菌产5-氨基乙酰丙酸（ALA）的条件,提高大肠杆菌发酵生产AL气的产量。在测定重组大肠杆菌GT48的生长曲线的基础上,确定诱导时间,优化摇瓶发酵条件。然后,进一步在5L发酵罐上进行间歇和流加发酵研究。摇瓶实验表明,细胞培养最佳初始pH为6．5,最佳诱导时间为稳定期前期,最佳接种量为2％,过高的葡萄糖浓度对细胞生长和产物合成均有一定的抑制作用。在5L发酵罐间歇发酵中,重组菌产ALA能力达到47．8mg／L。采用流加发酵可以进一步将产物产量提高到63．8mg／L。构建的过量表达自身的hemA基因的大肠杆菌具有较高的产ALA能力,通过发酵条件优化和采用流加发酵可以提高AL气产量。