EGF-SEA融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化

根据基因库中查到的金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因序列和人体表皮生长因子(EGF)基因序列进行密码子优化,以适于大肠杆菌表达.人工合成SEA基因与EGF基因.将两目的基因克隆至原核表达栽体pFT22b中,经测序验证表明成功构建了重组表达质粒pET22b-EGF-SEA.将构建好的pET22b-EGF-SEA质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导进行表达;SDS-PAGE分析表明融合基因EGF-SEA在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体的形式得到了高效表达,产物相对分子质量约为44kDa,与理论值大小一致.包涵体经洗涤,变性、复性后用His Bind Kit进行分离纯化,所得蛋白纯度≥95%.高纯度EGF-SEA融合蛋白的获得为进一步研究其生物学活性及肿瘤治疗奠定了基础.     

新型抗菌肽Perinerin在大肠杆菌中的融合表达

为了获得新型抗菌肽 perinerin在大肠杆菌中的高效和可溶表达,实验首先采用SOE 法(重叠 PCR 法)获得的 perinerin 基因序列,对目的基因密码子优化,然后将其连接到 pET32a 载体中获得重组表达载体 pET32a-PEN,通过改变诱导时间和温度、诱导剂 IPTG 浓度以及诱变工程菌株等条件和方法,观察重组蛋白的表达效果,并运用金属螯合层析对融合蛋白进行纯化.SDS-PAGE 显示重组菌诱导后表达的融合蛋白分子量约为 26kD,采用变异重组菌株 MUT 3诱导表达,在 2×YT 培养基培养条件下,30 ℃诱导4 h 可获得高效表达的 perinerin 融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的 50 % 左右,重组蛋白主要以可溶性表达形式存在,可溶性产物最高可达重组蛋白总表达量的 60 %.融合蛋白运用金属螯合层析一步纯化,纯度可达 90 % 以上.     

Scytovirin在大肠杆菌中的可溶性表达

目的:获得Scytovirin(SVN)蛋白及其多克隆抗体.方法:按照NCBI上公布的SVN基因序列设计合成引物,合成SVN基因,构建pET32c-SVN原核表达重组质粒,经限制性酶切分析、DNA序列测定插入片段正确;将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达;用离子交换层析法及金属亲合层析法纯化蛋白,采用Tris-Tricine系统分析;以经过纯化的蛋白为抗原免疫白兔,制备SVN多克隆抗体.结果:对表达产物进行了分离纯化,SVN纯度达到91%;用纯化的样品制备了多克隆抗体,抗血清效价为1∶102 400.结论:SVN在大肠杆菌表达系统中获得了高效可溶表达,并制备了其多克隆抗体,为进一步深入研究SVN提供了材料.     

PTD融和蛋白的原核表达及其抗体制备

目的:为制备凋亡素重组蛋白抗体,首先获得凋亡素重组蛋白融合基因LTA,而且通过原核表达系统表达重组蛋白并制备其抗体,为进一步利用凋亡素重组蛋白导向治疗肿瘤的检测奠定基础.方法:应用重叠延伸的基因融合技术将LHRH(黄体生成激素释放激素)基因、TAT(HIV-1反式转录激活因子)基因和凋亡素基因重组,构建成凋亡素重组蛋白原核表达载体pET-28a-LTA,随后将表达质粒转入BL21菌株,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,将已表达的重组蛋白通过Ni-NTA亲和色谱柱进行纯化,并制备LTA凋亡素重组蛋白抗体.结果:表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,LTA蛋白融合基因获得高效表达,凝胶薄层扫描分析表明表达蛋白占菌体蛋白12.6%.LTA蛋白经Ni-NTA亲和色谱柱柱纯化,以纯化蛋白为抗原免疫獭兔制备凋亡素重组蛋白抗血清.结果表明抗体的效价为1: 12800.结论:应用重叠延伸的基因融合技术获得凋亡素重组蛋白融合基因LTA,通过原核表达系统表达重组蛋白并制备其抗体.     

猪瘟病毒NS2-3抗原集中区基因的原核表达及鉴定

为获得猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV) NS2-3抗原集中区蛋白,并建立CSFV抗体快速检测方法.本研究以CSFV全长基因组质粒为模板,PCR扩增NS2-3抗原表位集中区,利用扩增片段和克隆载体,构建重组表达质粒,命名为pET32a-NS2-3-1.重组表达质粒转化Rosetta (DE3)细胞,利用IPTG诱导表达, SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定重组表达产物.结果表明,重组质粒pET32a-NS2-3-1在28℃诱导5 h得到高效表达,重组蛋白能够与兔抗CSFV阳性血清发生反应.获得CSFV NS2-3抗原集中区蛋白,并且获得的重组蛋白具有抗原性,能够作为CSFV抗体检测的抗原.     

人vasorin蛋白的基因克隆、表达及纯化简

目的：克隆、表达人vasorin（VASN）蛋白。方法：利用PCR方法从HepG2细胞的cDNA中扩增获得目的基因,并插入带有6xHis标签的原核高效可溶性表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-VASN,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后目的基因获得表达,对融合目的蛋白进行Ni^2＋金属螯合柱纯化。结果：内切酶鉴定及基因序列测定证实重组表达质粒构建成功;对目的蛋白进行了原核表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为61x10^3的特异表达条带;Western印迹证实目的蛋白为VASN,且主要以包涵体形式存在;对经尿素变性的表达产物进行了亲和层析纯化,有利于以后的变性、复性过程。结论：获得了人VASN融合蛋白,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。     

GST-HRB融合蛋白的表达与纯化

构建GST-HRB重组质粒,进行融合蛋白的表达、纯化及鉴定.利用PCR扩增及基因重组技术,以pcDNA-3.1-HRB为模板扩增出HRB全基因序列,并将其插入带有GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签的原核表达载体pGEX-6P-1中,构建GST-HRB融合蛋白表达质粒.然后,将重组质粒GST-HRB转化至大肠杆菌Rosseta进行融合蛋白的表达.利用GST琼脂糖珠进行融合蛋白的纯化,最后应用SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定纯化的融合蛋白.结果表明,成功构建pGEX-6P-1-HRB原核表达载体,表达及纯化了GST-HRB融合蛋白.     

GST-Exendin-4在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化

为了制备GST-Exendin-4融合蛋白,以本实验室构建好的pET22b-Exendin-4为模板,通过PCR扩增出Exendin-4基因,酶切克隆入pGEX-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Exendin-4.经DNA测序证实插入序列与设计完全一致后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在不同浓度的IPTG和不同温度诱导下,经SDS-PAGE分析鉴定,表达出Mr约为30 kD的目的蛋白,灰度扫描显示目的蛋白占菌体总蛋白的29.9%,超声裂解后的上清通过Sepharose 4B亲和层析纯化、透析、除盐及冷冻干燥得到高纯度的目的蛋白.本研究成功制备了高纯度的GST-Exendin-4融合蛋白,为下一步进行目的蛋白大规模的生产打下了良好的基础.     

Angioarrestin(hARPl)C端FD区的克隆、表达及其免疫活性鉴定

 Angioarrestin是一种具有潜在应用价值的肿瘤血管形成抑制因子.利用DNA重组法构建了angioarrestin C端 hFD cDNA 和麦芽糖结合蛋白(MBP)重组原核表达质粒 pMAL-C2-hFD.将重组质粒转入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）,经0.3 mmol/LIPTG 在37℃条件下诱导表达4h,SDS-PAGE 检测,融合蛋白表达量约占细菌总蛋白的20%.Western印迹证实,目的蛋白N端带有MBP标签.取表达上清纯化、透析、浓缩并冻干,以此为抗原免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体.此多抗可以与pET 22b（+）表达系统获得的 hFD重组蛋白发生良好的抗原抗体反应,ELISA检测多抗效价达1∶10240.实验证明：通过基因重组可获得angioarrestin C端hFD在大肠杆菌中的高效表达蛋白,且该蛋白具有较高的免疫活性.以此为抗原制备的抗angioarrestin多克隆抗体为深入研究angioarrestin提供了材料.     

分选酶A在pET32a(+)原核表达载体中的表达和鉴定

旨在pET32a(+)原核表达载体中表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中的转肽酶分选酶(SrtA)并进行鉴定.以含有pET22-srtA质粒为模板,设计并合成引物,PCR扩增得到SrtA△N24和SrtA△N59基因,经过BamH Ⅰ、Xho Ⅰ酶切,克隆入表达载体pET32a(+)中,构建重组载体pET32a-SrtA△N24及pET32a-SrtA△N59,并转化入大肠杆菌BL21(DE3).经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物分别进行分析和鉴定.然后对重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达条件进行了优化.结果显示重组载体pET32a-SrtA△N24和pET32a-SrtA△N59分别表达出相对分子量为约42 kD和37 kD的融合蛋白,经SDS-PAGE和Westem blotting检测显示其分子量与预期的大小相符合.成功构建了重组质粒pET32a-SrtA△N24和pET32a-SrtA△N59,并且在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效融合表达.