湘西地区蛇足石杉内生真菌的分离

采集不同生境的药用植物蛇足石杉,运用不同灭菌方法处理外植体,并用PDA平板培养基及孟加拉红培养基进行内生真菌的分离纯化.经过几种灭菌方法的摸索和比较研究,发现蛇足石杉外植体的灭菌十分困难(尤其是其茎部),难以在保持植物鲜活状态下达到一次彻底灭菌,有必要二次灭菌.通过二次灭菌分离得到的9株内生真菌中,来自蛇足石杉茎部的6株,来自叶片的3株.蛇足石杉的9株内生真菌在平板培养时生长极其缓慢,仅一株可在培养时产生孢子.     

蛇足石杉内生真菌g5的乙酰胆碱酯酶抑制活性初步研究

为了初步研究蛇足石杉内生真菌g5发酵产物的乙酰胆碱酯酶(ACHE)抑制动力学以及对该株真菌做初步形态学鉴定,采用DTNB显色法检测g5发酵液醇提物抑制AChE活性的效果,并采用玻片培养法进行真菌鉴定.结果发现g5菌株属于半知菌目丛梗孢科青霉属;其发酵液醇提物对AChE的抑制作用表现为混合竞争型可逆抑制,其对游离酶的抑制常数KI>与对酶底物络合物的抑制常数KIS>分别为0.0789mL和1.1352mL,因此g5菌株代谢产物可作为开发AChE抑制剂类药物的潜在资源.     

一株拮抗真菌的蛇足石杉内生细菌分离鉴定及培养条件优化

从蛇足石杉(Huperzia serrata)叶片中分离到一株对小麦赤霉(Fusarium graminearum)等多种植物病原真菌有强拮抗作用的内生细菌H-6。通过形态和培养特性观察、生理生化实验及16S rDNA序列分析, 初步鉴定该菌属于伯克霍尔德属, 命名为Burkholderia sp. H-6。同时还对该菌培养条件进行了优化, 得出马铃薯浸出液中添加2.5%的甘露醇和0.1% NaNO3有利于细胞生长和抑菌活性的产生, 最适培养温度为28℃, 最佳初始pH4.0。     

蛇足石杉产石杉碱甲内生真菌的分离鉴定

从9月份采集的野生药用植物蛇足石杉(Huperzia serrata)的茎、叶中分离纯化得到15株内生真菌,将上述内生真菌进行液体培养后,通过薄层层析法(TLC)和高效液相法(HPLC)对其代谢产物进行检测,结果表明菌株WX13产石杉碱甲(Huperzine A,HupA)。运用形态和培养特性观察,初步确定菌株WX13属于镰刀菌属(Fu-sarium sp.)。     

蛇足石杉内生真菌无柄盘菌Pezicula sp. JR14中抑制乙酰胆碱酯酶的次级代谢产物分离

采用形态学及ITS-rDNA序列分析法,对具有抑制乙酰胆碱酯酶活性的蛇足石杉内生菌株JR14进行鉴定,确定为无柄盘菌Pezicula sp.。开展了乙酰胆碱酯酶抑制活性化合物的分离,从Pezicula sp. JR14乙酸乙酯提取物中分离到4个化合物,利用核磁共振及质谱技术将其鉴定为behenic acid (1)、himeic acid B (2)、secalonic acid A (3)和palmitic acid (4)。采用改进的Ellman比色法对分离的化合物进行活性检测,结果表明,himeic acid B (2)具有较强的乙酰胆碱酯酶抑制活性,其IC₅₀为205μg/mL（0.64mmol/L）。     

7株蛇足石杉内生真菌拮抗4种致病菌的研究

目的:筛选具有拮抗致病菌的蛇足石杉内生真菌。方法:选择蛇足石杉为材料,经过表面消毒,分离得到菌株。随机选择7株内生菌通过改良菌块法进行4种致病菌的拮抗试验。结果:菌株F002对致病真菌Canidia Albicans表现中等强度的拮抗作用,而菌株F004对致病菌Canidia Albicans及Crytococcus Neofonmans均表现较强的抑制活性。经r DNA的ITS序列分析,菌株F004定为厚垣镰孢霉。结论:通过蛇足石杉内生菌的生物活性测定,可以筛选到较强的拮抗致病真菌的活性菌株,其抗菌活性物质有待我们进一步的跟踪分离。     

蛇足石杉内生细菌多样性北大核心CSCD

【目的】探索国家二级保护野生药用植物蛇足石杉内生细菌的物种和生理活性多样性,发现并收集药用植物内生菌资源。【方法】分别从四川和福建等不同生态环境采集蛇足石杉植株,运用纯培养手段,对经过表面消毒处理的蛇足石杉样品进行内生菌的分离、培养;根据菌株16S r RNA基因信息,计算从蛇足石杉不同区系分离获得的内生细菌间的Jaccard指数、多样性指数、优势度指数与均匀度指数等,分析内生菌物种多样性;应用6种筛选模型对分离得到的内生菌进行生理活性测定,初步评价蛇足石杉内生细菌的生理活性多样性和药用价值。【结果】从12份蛇足石杉植物样品中分离获得356株内生菌菌株,菌株16S r RNA基因序列信息显示,分离得到的蛇足石杉内生细菌隶属于放线菌门、厚壁菌门和变形菌门等3个门的26个科、41个属,来源于蛇足石杉地上和地下部位的菌株数目、多样性指数等无明显差异。从中发现了分属于拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)、Angustibacter、节杆菌属(Arthrobacter)、短小杆菌属(Curtobacterium)、Frondihabitans、Glaciihabitans、Jatrophihabitans、Luteimicrobium、Massilia、Naumannella和Tardiphaga等11个属的11个潜在新物种,以及皮生球菌科(Dermacoccaceae)的1个新属。在抗菌活性筛选中,356株纯培养物抗粪肠球菌、抗肺炎克雷伯菌、抗耻垢分枝杆菌以及抗水稻白叶枯病菌的阳性率分别是9.0%、1.4%、2.2%、0.8%;抑制SS04生长的降血脂药物筛选模型上的阳性率是8.1%;抗HIV-1的初筛阳性率为4.5%。共计74株菌在一个或多个筛选模型中显示出活性,初筛总阳性率为20.8%。【结论】蛇足石杉内生细菌具有丰富的物种多样性和生理活性多样性,是进一步发掘新型天然产物的理想菌种资源。     

蛇足石杉内生真菌Shiraia sp. Slf14中赖氨酸脱羧酶基因的克隆、表达及功能

【目的】阿尔茨海默症治疗药物石杉碱甲(Huperzine A,Hup A)的生物合成途径起始于赖氨酸脱羧酶(Lysine decarboxylase,LDC)。本研究克隆及表达了来源于产Hup A的植物内生真菌的LDC基因,并研究了其功能。【方法】采用RT-PCR扩增法,从一株产Hup A的蛇足石杉内生真菌Shiraia sp.Slf14获得LDC基因,构建表达质粒p ET-22b-LDC与p ET-32a-LDC,转化感受态细胞E.coli BL21,加入IPTG至终浓度为1×10~(–3) mol/L,于24°C、200 r/min培养8 h,诱导表达LDC蛋白质;通过Ni~(2+)金属亲和层析纯化重组LDC并建立酶促反应体系,利用TLC检测了LDC催化活性。利用生物信息学软件分析了LDC的理化性质及蛋白质的空间结构。【结果】成功克隆并异源表达出重组蛋白LDC与Trx-LDC,经SDS-PAGE电泳鉴定分子量分别为24.4 k Da和42.7 k Da,与预计大小相符。TLC结果表明LDC与Trx-LDC均具有赖氨酸脱羧酶活性。【结论】本研究从产Hup A的蛇足石杉内生真菌Shiraia sp.Slf14中成功克隆到LDC基因并进行了异源表达,检测到了其催化活性,为丰富LDC分子信息及阐明内生真菌中Hup A生物合成机制提供参考数据。     

蛇足石杉内生真菌Cladosporium tenuissimum MT-35的代谢产物研究

为研究蛇足石杉内生真菌极细枝孢菌(Cladosporium tenuissimum MT-35)的代谢产物,本实验采用硅胶柱色谱及半制备液相色谱等方法从蛇足石杉极细枝孢菌C.tenuissimum MT-35的糙米发酵物中分离出10个化合物,根据化合物的理化性质及MS、NMR数据分别鉴定为4-hydroxy-3-methoxy-2(1H)-quinolinone(1)、acropyrone(2)、lumichrome(3)、(1H-indol-3-yl) oxoacetamide(4)、1,6-dihydro-1-methyl-6-oxo-3-pyridinecarboxylic acid(5)、尿嘧啶(6)、过氧化麦角甾醇(7)、麦角固醇(8)、9(Z),12(Z)-十八碳二烯酰胺(9)、8-O-4-dehydrodiferulic acid(10)。除化合物7和8外,其他化合物均为首次从C.tenuissimum中分离得到。对分离鉴定的化合物进行体外抗炎和抗乙酰胆碱酯酶活性筛选,结果表明化合物3、7、8、9对脂多糖诱导的小鼠单核巨噬细胞释放一氧化氮具有抑制活性,IC_50<...     

蛇足石杉内生真菌产黄青霉菌MT-40中xanthocillin类似物生物合成基因簇的挖掘及鉴定

Xanthocillin具有显著的抗菌活性,结构中含有独特的异腈基。本文通过对蛇足石杉(Huperzia serrata)内生真菌产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)MT-40基因组的测序分析,利用本地BLAST等生物信息学分析工具挖掘具有合成xanthocillin类似物潜力的基因簇,结合米曲霉(Aspergillus oryzae)NSAR1异源表达技术实现基因簇中关键基因的功能鉴定。结果成功从内生真菌P.chrysogenum MT-40中发现一个合成xanthocillin类似物的生物合成基因簇(命名为for),for基因簇中的关键生物合成基因forB编码的异腈基合成酶可以催化合成2-formamido-3-(4-hydroxyphenyl)acrylic acid,基因forG编码的P450酶可以催化2-formamido-3-(4-hydroxyphenyl)acrylic acid的二聚化生成xanthocillin类似物N,N′-(1,4-bis(4-hydroxyphenyl)buta-1,3-diene-2,3-diyl)diformamide。本文研究结果为进一步从真菌中发现xanthocillin类似物提供参考。     

长序虎皮楠内生真菌Penicilliumsp.DCS82的化学成分

采用色谱技术从长序虎皮楠内生真菌Penicillium sp. DCS82菌株的PDA平板发酵物中分离纯化得到5个化合物。通过波谱数据分析及与文献对照进行结构解析,分别鉴定为:verrucosidinol acetate(1),verrucosidinol(2),viridicatin(3),fructigenine A(4),3-(dimethylaminomethyl)-1-(1,1-dimethyl-2-propenyl)indole(5)。所有化合物都是首次从该菌中分离里得到。     

云南红豆杉内生真菌Talarom yces sp.T1BF的化学成分研究

采用色谱技术从云南红豆杉内生真菌Talaromyces sp.T1BF的PDA平板发酵物中分离得到4个化合物.经波谱数据分析及与文献对照,分别鉴定为5α,6α-环氧-24( R)-甲基胆甾-7,22-二烯-3β-醇(1)、醌茜素(2)、苔色酸(3)和间甲基苯酚(4).化合物1为首次从该属真菌中分离获得.     

海南蛇足石杉株龄及年生长量研究

蛇足石杉因含有丰富的石杉碱甲而引起广泛关注,需求巨增,但该植物生长缓慢,野生资源濒临灭绝,且人工培植相关技术尚未成熟.为保护野生资源及今后开展繁育研究工作,需进一步了解蛇足石杉的生物学特性.据此开展了对海南蛇足石杉天然群体的调查,调查内容主要涵盖芽胞层数、层间距、株高及环境条件等.结果表明,芽胞逐年产生,集中分布于分枝...     

Biotransformation of Huperzine B by a Fungal Endophyte of Huperzia serrata

The biotransformation of huperzine B (hupB), one of the characteristic bioactive constituents of the medicinal plant Huperzia serrata, by a fungal endophyte of the host plant was studied. One new compound, 8α,15α‐epoxyhuperzine B ( 1 ), along with two known oxygenated hupB analogs, 16‐hydroxyhuperzine B ( 2 ) and carinatumin B ( 3 ), was isolated and identified. The structures of all the isolates were deduced by spectroscopic methods including NMR, MS, IR, and UV spectra. The known compounds 2 and 3 were obtained from a microbial source for the first time. To the best of our knowledge, it is the first report on the microbial transformation of hupB and would facilitate further structural modification of hupB by chemo‐enzymatic method. In the LPS‐induced neuro‐inflammation injury assay, 8α,15α‐epoxyhuperzine B ( 1 ) exhibited moderate neuroprotective activity by increasing the viability of U251 cell lines with an EC₅₀ of 40.1 nm .     

A novel endophytic Huperzine A–producing fungus,Shiraia sp. Slf14, isolated from Huperzia serrata

Aims: To characterize and identify a novel Huperzine A (HupA)‐producing fungal strain Slf14 isolated from Huperzia serrata (Thunb. ex Murray) Trev. in China. Methods and Results: The isolation, identification and characterization of a novel endophytic fungus producing HupA specifically and consistently from the leaves of H. serrata were investigated. The fungus was identified as Shiraia sp. Slf14 by molecular and morphological methods. The HupA produced by this endophytic fungus was shown to be identical to authentic HupA analysed by thin layer chromatographic, High‐performance liquid chromatography (HPLC), LC‐MS, ¹H NMR and acetylcholinesterase (AChE) inhibition activity in vitro. The amount of HupA produced by Shiraia sp. Slf14 was quantified to be 327·8 μg l^?1 by HPLC, which was far higher than that of the reported endophytic fungi, Acremonium sp., Blastomyces sp. and Botrytis sp. Conclusions: The production of HupA by endophyte Shiraia sp. Slf14 is an enigmatic observation. It would be interesting to further study the HupA production and regulation by the cultured endophyte in H. serrata and in axenic cultures. Significance and Impact of the Study: Although the current accumulation of HupA by the endophyte is not very high, it could provide a promising alterative approach for large‐scale production of HupA. However, further strain improvement and the fermentation process optimization are required to result in the consistent and dependable production.     

紫苏内生真菌Aspergillus sp.12Y03化学成分研究

采用硅胶柱层析和Sephadex LH-20凝胶柱层析等分离方法,从紫苏内生真菌Aspergillus sp.12Y03发酵产物中分离鉴定了10个化合物,经现代光谱学技术鉴定为:环-(脯氨酸-甘氨酸)(1)、环-(脯氨酸-丝氨酸)(2)、环-(丝氨酸-4-OH-脯氨酸)(3)、环-(丙氨酸-4-OH-脯氨酸)(4)、环-(苯丙氨酸-甘氨酸)(5)、环-(丙氨酸-甘氨酸)(6)、亚油酸(7)、α-亚麻酸(8)、cerevisterol(9)和22E,24R-5α,6α-环氧麦角甾-8(14),22-二烯-3β,7α-二醇(10),均为首次从该菌种中分离得到,化合物3和4具有中等强度的海虾致死活性。     

潞西山龙眼的化学成分研究

从山龙眼属植物潞西山龙眼的叶子中分离了6个化合物,利用核磁共振等方法,鉴定为熊果苷(1)、ro-bustaside B(2)、robustaside D(3)、β-谷甾醇(4)、helicide(5)和(E)-(4-羟基苯基)-丙烯酸甲酯(6)。这6个化合物均为首次从该植物中分离得到。     

毛果巴豆根的化学成分研究

对大戟科巴豆属植物毛果巴豆的根进行化学成分研究,并利用多种色谱方法分离得到11个化合物,根据理化性质和波谱学手段鉴定了结构。它们分别是3-乙酰高根二醇(1),3-乙酰齐墩果酸(2),ilexgenin A (3),(24S)-24-ethylcholesta-3β,5α,6β-triol(4),邻苯二甲酸二丁酯(5),邻苯二甲酸二异丁酯(6),邻苯二甲酸正丁异丁酯(7),Aralia cerebroside(8),熊果酸(9),β-谷甾醇(10),胡萝卜苷(11)。所有化合物均为首次从该植物中分离得到。