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1.水生栖热菌中耐热海藻糖合酶的提 纯和特性 海藻糖是一种非还原二糖,自然界分布普遍。海藻糖通常是从酵母细胞提取的。在前报中(Nishi-moto T et al., Biosci Biotech Biochem, 1995,59: 2189-90)报道了脂肪杆菌(Pimelobacter sp.)R48,恶臭假单胞菌 H262,和栖热菌(Thermus)一些菌株中的一种新酶,可以将麦芽糖转化成海藻糖。本文主要报道水生栖热菌(Thermus aquaticus)ATCC33923耐热海藻糖合酶的提纯和特性,并和     

提高源自Bacillus circulans 251的β-CGTase对麦芽糖亲和性及其在生产海藻糖中的应用

将B. circulans 251β-CGTase应用于海藻糖制备,海藻糖转化率从50. 4%提高至71. 9%。为进一步提高底物的转化率,运用易错PCR-高通量筛选技术筛选对以麦芽糖为歧化反应受体的亲和性提高的B. circulans 251β-CGTase突变体。利用低底物浓度的96孔板4,6-亚乙基-对硝基苯-α-D-麦芽七糖苷(EPS)显色法,最终筛选得到了一株对麦芽糖亲和性提高的突变体M234I。将野生型β-CGTase和突变体酶M234I进行蛋白质纯化,测定其酶学性质。结果表明,突变体的比活为345. 25U/mg,野生型则为357. 63U/mg;突变体M234I对麦芽糖的K_m为0. 258 2mmol/L,仅为野生型(0. 474 9mmol/L)的54. 4%,对麦芽糖的亲和性显著提高;突变体的最适温度、最适p H较野生型未发生较大变化。以麦芽糊精(DE值16)为底物,将突变体M234I用于多酶复配体系生产海藻糖,酶反应结果表明海藻糖的转化率最高达74. 9%,较野生型β-CGTase提高约3%。     

以CotC为分子载体在枯草芽孢杆菌表面展示海藻糖合酶

海藻糖是自然界中普遍存在的一种非还原性双糖,是一种极好的天然干燥剂和保鲜剂。海藻糖合酶能够催化α,α-1,4-糖苷键连接的麦芽糖直接转化为α,α-1,1-糖苷键连接的海藻糖,是生产海藻糖的首选。为获得具有良好展示效果的海藻糖合酶,将其高效稳定的展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面,实验同时分别选取增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和海藻糖合酶(Tres)作为模型蛋白,以来自枯草芽孢杆菌的芽孢衣壳蛋白Cot C作为枯草芽杆菌表面展示的锚定蛋白进行表面展示研究。利用流式细胞仪分析EGFP在芽孢表面展示的情况,结果表明芽孢衣壳蛋白Cot C可以将EGFP固定在芽孢的表面。然后将荧光蛋白基因egfp通过酶切替换为海藻糖合酶基因tres,将重组菌株使用p H7.5的缓冲液清洗并重悬,与底物浓度为30%的麦芽糖在50℃水浴条件下作用2h,反应产物利用HPLC检测,能够检测到海藻糖峰,通过计算得到的酶活为252U/ml。说明海藻糖合酶基因通过与芽孢衣壳蛋白Cot C融合后可被展示在芽孢的表面。     

麦芽糖诱导海藻糖合成酶基因在B.subtilis WB800n中的表达

运用枯草芽孢杆菌中的麦芽糖诱导型启动子调控元件,构建得到麦芽糖诱导海藻糖合成酶的安全表达系统,使其制备的海藻糖能够广泛应用于食品医疗行业。以来源于恶臭假单胞杆菌KT2440(Pseudomonas putida KT2440)的海藻糖合成酶基因Tre S为报告基因,以cre序列定点突变(CG碱基突变为AT碱基)优化后的麦芽糖诱导型的枯草芽孢杆菌操纵元启动子Pglv为调控元件、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒PHT01为载体骨架,通过Bam H I和Aat II限制酶酶切替换,构建得到高效表达载体Pglv-PHT01-Tre S,将质粒电转化到B.subtilis WB800n并验证其表达效果。成功构建了海藻糖合成酶高效表达质粒Pglv-PHT01-Tre S,并实现了该重组质粒在B.subtilis WB800n中的表达。利用基础发酵培养基优化发酵条件验证结果表明,菌体生长到发酵液吸光值OD600达到1.2时加入终质量分数4.5%的麦芽糖,37℃诱导18 h后胞内的海藻糖合成酶的粗酶活力达到18.9 U/m L。为了提高海藻糖合成酶的表达量,还构建了通过单交叉互换方法敲除了α-淀粉酶基因amy E的重组菌株B.subtilis WB800n(Δamy E),减少了胞外α-淀粉酶对麦芽糖的降解成葡萄糖,提高了麦芽糖的诱导表达效果以及减少葡萄糖的反馈抑制,表达质粒在麦芽糖诱导条件下在该重组菌中海藻糖合成酶酶活提高到了29.2 U/m L。首次成功实现了麦芽糖诱导海藻糖合酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达,为获得制备安全高效的海藻糖合成酶表达系统奠定了基础。     

提高源自Bacillus circulans 251的β-CGTase对麦芽糖亲和性及其在生产海藻糖中的应用 *

将B. circulans 251 β-CGTase应用于海藻糖制备,海藻糖转化率从50.4%提高至71.9%。为进一步提高底物的转化率,运用易错PCR-高通量筛选技术筛选对以麦芽糖为歧化反应受体的亲和性提高的B. circulans 251 β-CGTase突变体。利用低底物浓度的96孔板4,6-亚乙基-对硝基苯-α-D-麦芽七糖苷(EPS)显色法,最终筛选得到了一株对麦芽糖亲和性提高的突变体M234I。将野生型β-CGTase和突变体酶M234I进行蛋白质纯化,测定其酶学性质。结果表明,突变体的比活为345.25U/mg,野生型则为357.63U/mg;突变体M234I对麦芽糖的K_m为0.258 2mmol/L,仅为野生型(0.474 9mmol/L)的54.4%,对麦芽糖的亲和性显著提高;突变体的最适温度、最适pH较野生型未发生较大变化。以麦芽糊精(DE值16)为底物,将突变体M234I用于多酶复配体系生产海藻糖,酶反应结果表明海藻糖的转化率最高达74.9%,较野生型β-CGTase提高约3%。     

耐放射异常球菌海藻糖合成酶基因的克隆及功能鉴定

利用生物信息学手段,在GenBank中进行氨基酸序列的同源性比较分析,检索到来自于耐放射异常球菌（Deinococcus radiodurans）基因组序列中一功能未确定的开放阅读框（ORF）,其氨基酸序列和已报道的海藻糖合成酶的氨基酸序列有约60％的同源性.将这段ORF克隆到大肠杆菌进行表达,并进行功能鉴定.实验表明这段ORF序列所编码的是一种海藻糖合成酶,它能将麦芽糖分子转化成海藻糖分子,以30％的麦芽糖为底物时能将约65％的麦芽糖转化成海藻糖.重组酶性质初步研究表明,在pH 7.0,最佳温度30℃转化麦芽糖效率最高.     

藤黄微球菌海藻糖生物合成基因的克隆与鉴定

首次从一株能利用淀粉产生海藻糖的藤黄微球菌中克隆了海藻糖生物合成基因。采用PCR方法结合非随机鸟枪法得到藤黄微球菌中低聚麦芽糖苷基海藻糖合成酶(MTSase)基因(MtreY)的全序列及低聚麦芽糖苷基海藻糖水解酶(MTHase)基因(MtreZ)的部分序列,其中MtreY共有2,370个碱基,编码789个氨基酸,表达产物分子量为86·7kD。同源性分析表明,与已报道的MTSase和α-淀粉酶家族成员具有相同的保守模体。将MtreY基因在大肠杆菌JM83中表达,证明表达产物具有预期的酶活性。     

海藻糖合酶的分子生物学研究进展

海藻糖合酶能够将麦芽糖转化为海藻糖,在海藻糖的工业生产中具有十分重要的意义。本文从海藻糖合酶的基因克隆、基因工程应用、结构和催化机制的研究以及其在微生物体内的功能等方面讨论了海藻糖合酶的研究进展。     

海藻糖合成酶活性受固定化处理过程影响的研究*

在麦芽糖苷基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽糖苷基海藻糖水解酶(MTHase)双酶的作用下,淀粉可转化为海藻糖,但是其转化率较低。中采用多种固定化载体进行酶固定化研究,发现通过经戊二醛与壳聚糖交联后的载体与酶液作用,可吸附与海藻糖合成无关的杂酶和杂质,从而提高海藻糖合成酶的活性。通过比较固定化过程中与反应条件中多个因素的影响,得到了如下最佳作用条件：将酶液与经3％戊二醛交联18h后的滤纸作用18h,再与10％的淀粉溶液反应9h,与未经固定化作用比较,海藻糖的产率提高10倍,达到27．22g／L转化率从5．33％提升到54．43％。     

海藻糖合酶在毕赤酵母表面的展示

海藻糖合酶能够利用麦芽糖一步法转化生产海藻糖,其底物专一性较高,该酶体系生产工艺简单,不受底物麦芽糖浓度的影响,是工业生产海藻糖的首选。为获得具有生产海藻糖合酶能力的毕赤酵母表面展示载体,实验以筛选的Pseudomonas putide P06海藻糖合酶基因为模板,PCR扩增得到海藻糖合酶基因(tres,2064 bp),连接至pPICZαA质粒中,获得重组质粒pPICZαA-tres。以来自酿酒酵母的共价连接细胞壁的Pir系列蛋白的Pir1p成熟肽蛋白作为毕赤酵母表面展示的锚定蛋白,利用PCR技术扩增得到pir1p(847 bp),连接至重组质粒pPICZαA-tres中,获得重组质粒pPICZαA-tres-pir1p。将重组质粒电击转入毕赤酵母GS115中,利用α-factor信号肽将蛋白引导分泌至细胞壁展示于毕赤酵母表面。通过Zeocin抗性筛选,挑选出阳性克隆子并摇瓶发酵。发酵产物经离心、破碎并使用昆布多糖酶水解,洗脱,结果显示,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析可见明显融合蛋白条带,表明海藻糖合酶已成功地锚定在毕赤酵母。将重组毕赤酵母使用pH 7.5的缓冲液清洗并重悬,与底物浓度为30%的麦芽糖在30℃~60℃水浴条件下作用2 h,反应产物利用HPLC检测,能够检测到酶学活性。在优化后的条件pH 7.5,50℃,表面展示海藻糖合酶酶活达到300.65 U/g。40℃~50℃酶活较稳定,保温60 min,残留酶活相对活力达75%以上;最适反应pH值为7.5,并在碱性环境下稳定。     

重组嗜热栖热菌海藻糖合酶制备海藻糖的工艺条件优化

海藻糖具有独特的生物活性,在多种行业应用广泛。海藻糖合酶能够专一性催化麦芽糖一步生成海藻糖。本文通过PCR扩增获得了来源于Thermus thermophilus ATCC33923的海藻糖合酶基因Tre S,构建了基因工程菌E.coli BL21(DE3)/p ET-24a(+)-Tre S。工程菌在摇瓶中发酵28 h时,胞内海藻糖合酶酶活达到最高值为6.4 U/m L。进一步研究了该重组酶制备海藻糖的影响因素,发现当以10%麦芽糖为底物,初始反应p H 7.5,加酶量为15 U/g麦芽糖,40℃,150 r/min反应24 h,转化率达到最高值,为49.0%。当底物浓度提高至20%~40%时,转化率为45.4%~46.2%。     

玫瑰链霉菌海藻糖合成酶基因克隆、表达及功能鉴定

目的:克隆玫瑰链霉菌海藻糖合成酶基因(Srt)使其在大肠杆菌XL10-Gold中高效表达,并对重组酶的酶学特性进行研究。方法:利用PCR技术从玫瑰链霉菌中克隆到一段长1 704bp的海藻糖合成酶基因(Srt),构建重组表达质粒pSE380-Srt-treS,将其转化大肠杆菌XL10-Gold中诱导表达,对重组纯酶进行SDS-PAGE分析及酶学特性测定。结果:SDS-PAGE显示在65kDa处有明显单一蛋白条带。该酶可催化麦芽糖和海藻糖之间的可逆反应,海藻糖得率达82%,且含有很低的副产物葡萄糖(5%左右)。最适反应温度和pH分别为30℃、7.5,Cu2+、Zn2+和Tris能明显抑制酶活力。该酶还可催化蔗糖生成一种无龋齿,适合糖尿病患者食用的糖类-海藻酮糖。结论:成功克隆表达了一个海藻糖合成酶基因,该酶转化率高,副产物较少,为工业酶法生产海藻糖奠定基础。     

核酸及蛋白质合成、提取、纯化

930378质粒DNA的■促纯化[英]/Isfort,R.J./BioTechniques.一1992,12(6).一798---804[译自DBA,1992,11(15),92-08366] 本操作只需2小时,不用昂贵设备,花钱少。如此提纯的质粒DNA可用于限制性酶切,.克隆、亚克隆、定序、缺口平移分析和末端标记。用此法纯化的质粒为MSVcL,它含有野生型p53肿瘤抑制子基因。培养携该质粒的大肠杆菌,细胞用碱裂解处理后离心,再用酚·氯纺(1 t 1)和异丙醇处理细胞团。离心后将细胞困重悬于50raM Tris—HC。l’(pH8,含30mM MgCII、O.5raM ATP和10m。|yI磕基乙醇,总体积1 m1)。加20/,I酶液(含100U R…     

利用定点突变分析海藻糖合酶的功能

我们通过对来自红色亚栖热菌(Meiothermus ruber) CBS-01中的海藻糖合酶(Trehalose synthase)序列比对及三维模型构建, 我们构建了D200G/H165R, R227C, R392A三个定点突变体, 检测其对麦芽糖及海藻糖的转化能力。结果发现: 在50°C时, D200G/H165R、R392A基本失去其原有活性, 而R227C产生海藻糖的能力降低。37°C时, D200G/H165R失去转化能力, 而R392A及R227C保有部分能力。因此我们推测, R392位点可能是维持酶的结构及热稳定性的关键位点, 而D200位点在反应过程中也起重要作用。     

高效液相色谱法测定转化液中海藻糖

以麦芽糖为反应底物,与从土壤中筛选的产海藻糖合酶菌株发酵制得的粗酶液反应制取转化液。采用高效液相色谱法以Sugar-Pak~(TM)Ⅰ为色谱柱测定转化液中海藻糖的含量。研究结果显示,该方法能够将海藻糖和葡萄糖完全分开,与DNS比色法所得结果一致,为1.5 g/100m L,但HPLC法在测定海藻糖含量时,操作过程及数据处理更为简单,易于掌握。     

海藻糖合酶的研究进展

海藻糖是一种天然存在的非还原性二糖, 对生物膜和蛋白质等大分子有独特的保护作用, 在食品、医药、化妆品等多个领域中都有广泛的发展空间。海藻糖合酶(TreS)是一类分子内转糖苷酶, 专一性地以麦芽糖为底物, 一步转化生成海藻糖, 操作工艺简单、底物价格低廉、应用前景良好。本文综述了海藻糖合酶的酶学性质、催化机理、基因工程以及目前存在的主要问题和拟解决方案。     

谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶基因的克隆及功能鉴定

利用生物信息学手段,在GenBank数据库进行氨基酸的同源性检索分析,发现来自谷氨酸棒杆茵(Corynebacterium glutamicum)一功能未确定的ORF序列被注释为假设的海藻糖酶(putative trehalose sesynthase),它与已报道的海藻糖合成酶的氨基酸序列有60％以上的同源性。本研究把这段ORF克隆到大肠杆茵进行表达及进行功能鉴定。实验表明这段ORF序列为一新的海藻糖合成酶基因,其表达产物能将麦芽糖分子转化成海藻糖分子。重组酶性质的初步研究表明重组酶在pH7．0～7．5,30℃转化麦芽糖效率最高。     

克鲁氏假丝酵母在高渗环境中海藻糖和胞内甘油积累的研究

Brown[1]在1976年提出了相容溶质(Compatible solutes)的概念,尽管有关它们功能的确切机制尚不是非常清楚,但是通常它们被认为是具有渗透调节作用和对细胞中生物活性物质具保护功能的物质.海藻糖和甘油在这方面所表现出的特殊功能已被国内外广泛关注[2].Brown[3]和Crowe[4]还分别报道了甘油和海藻糖在保护胞内可溶性酶和细胞膜稳定性方面的功能.Crowe[5]在研究几种不同碳水化合物对动物肌细胞的保护功能时发现,海藻糖和甘油都在不同程度上表现出这种特性.关于酵母细胞在加盐培养基中的生长代谢情况Kuniho Nakata[6]和Sukesh [7]分别进行了报道,发现酵母细胞内有海藻糖的积累,并且海藻糖的量与细胞对外界不利环境的耐受性有密切关系.     

改造大肠杆菌合成海藻糖途径以高效合成海藻糖

海藻糖是相容性溶质的一种,因其具有多种生物学功能,在食品、化妆品、药品以及器官移植等方面均有很广泛应用。然而近几年生产海藻糖主要集中在使用酶催化的方法,虽然这种方法的转化效率高,但是却存在着副产物的问题,难以得到高纯度的海藻糖产品,严重制约了海藻糖的应用。本文通过基因工程技术在大肠杆菌Escherichia coli中构建了海藻糖高效合成新途径,通过全细胞催化合成海藻糖。利用PCR技术在哈氏噬纤维菌Cytophaga hutchinsonii中克隆获得海藻糖双功能合成酶基因(tpsp),采用E.coli pTac-HisA高效表达载体,实现海藻糖双功能合成酶基因(tpsp)高效表达,利用高效表达菌株进行全细胞催化,将葡萄糖高效转化为海藻糖。结果表明C.hutchinsonii海藻糖合成酶基因(tpsp)在E.coli中成功实现表达,该酶能够在胞内将葡萄糖高效转化为海藻糖,并将其转运到胞外,实现海藻糖的高效率合成,海藻糖的产量提高到1.2 g/L,相对转化率为21%。当将此高产菌株在发酵罐中进行转化时,海藻糖的产量达到13.3 g/L,葡萄糖的相对转化率达到48.6%。采用C.hutchinsonii海藻糖合成酶基因高效表达并且应用于海藻糖全细胞合成催化在国内外尚属首次报道,海藻糖的转化率及产率都已达到文献报道最高水平,本研究为开拓海藻糖生产新技术奠定了基础。     

产(R)-1,3-丁二醇的工程菌构建及转化条件研究

[目的]利用重组大肠杆菌实现(R)-1,3-丁二醇的生物合成。[方法]从脱硫球菌(Desulfococcus biacutus)中克隆得到羰基还原酶基因DbCR,构建pET28a-DbCR表达载体并在大肠杆菌E.coli BL21中表达,利用气相色谱对反应液进行检测。[结果]DbCR在pH 7.5、35℃的最适条件下的酶活力为4.5 U/mL。在50 mL全细胞反应体系中,重组工程菌在pH 7.5、30℃条件下,反应48 h时,对300 mmol/L底物4-羟基-2-丁酮的转化率 96%,产物(R)-1,3-丁二醇的e.e.值 99%。[结论]构建得到高效催化合成(R)-1,3-丁二醇的工程菌,工程菌对底物的转化率96%,产物纯度 99%。